郝好，姚慶鑫，高遠(yuǎn)，謝建軍

（1 中南林業(yè)科技大學(xué)，材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖南長沙410004；2 國家納米科學(xué)中心，納米生物效應(yīng)與安全性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100190）

超分子自組裝是自然界中普遍存在的現(xiàn)象，它主要是通過非共價鍵相互作用（氫鍵、疏水作用、靜電作用、π-π共軛等），使無序的單個分子自發(fā)形成有序結(jié)構(gòu)[1-4]。構(gòu)建納米材料的方法包括“自上而下”和“自下而上”兩種策略?！白陨隙隆笔菍⑤^大尺寸的物質(zhì)通過各種刻蝕技術(shù)來制備所需要的納米結(jié)構(gòu)，該方法的缺點(diǎn)是浪費(fèi)材料，且對控制目標(biāo)材料的微觀形貌有限制；“自下而上”是將較小的結(jié)構(gòu)單元（如原子、分子、納米粒子等）通過弱相互作用自組裝構(gòu)成相對較大、較復(fù)雜的結(jié)構(gòu)體系[5]，該方法克服了浪費(fèi)材料的缺點(diǎn)，能通過調(diào)整分子間的排列控制材料的形貌。超分子自組裝就是利用“自下而上”的方法將多種功能模塊整合到最終的超分子組裝體中，表現(xiàn)出單個分子不具備的特性與功能。因此，超分子自組裝成為構(gòu)建復(fù)雜生物材料的通用平臺[6-8]。通過精細(xì)調(diào)控分子間相互作用，自組裝結(jié)構(gòu)保持相對穩(wěn)定，同時自組裝過程具有動態(tài)響應(yīng)特性[9]。目前，超分子自組裝在生物醫(yī)藥領(lǐng)域?yàn)殚_發(fā)多功能材料提供了一種新策略[10]。

超分子自組裝有多種觸發(fā)方式如溫度[11]、pH[12]、離子強(qiáng)度[13]及金屬離子[14]等，但這些條件大多只能在體外實(shí)現(xiàn)，因而限制了其在生物體內(nèi)的應(yīng)用。基于腫瘤細(xì)胞區(qū)別于正常細(xì)胞過表達(dá)的酶，XU 等[15]在酶催化超分子自組裝（enzyme-instructed supramolecular self-assembly, EISA）方面進(jìn)行了開創(chuàng)性的研究。EISA 包括酶轉(zhuǎn)化和分子自發(fā)組裝兩步[16]，利用生物體內(nèi)酶的特異性表達(dá)，設(shè)計(jì)酶響應(yīng)前體，在酶催化作用下，前體通過弱相互作用（如氫鍵、π-π 相互作用等）自組裝形成纖維或球形納米結(jié)構(gòu)[17]，目前已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)檢測、癌癥治療等領(lǐng)域[10,18-20]。

1 酶催化超分子自組裝的構(gòu)建方式

酶是一種高效、特異性的生物催化劑，在生理?xiàng)l件下能有效地催化多種生命活動。根據(jù)酶在生物體中存在的部位，可分為胞外酶和胞內(nèi)酶。利用不同部位的酶構(gòu)建超分子自組裝，可從不同方面干擾細(xì)胞活動。

1.1 細(xì)胞外構(gòu)建EISA

利用細(xì)胞表面高表達(dá)的酶，設(shè)計(jì)相關(guān)酶響應(yīng)前體，經(jīng)過酶催化，前體能在細(xì)胞表面自組裝形成納米纖維，這樣形成的納米纖維能從癌細(xì)胞中捕獲分泌蛋白或酶，阻止它們進(jìn)入周圍環(huán)境，阻斷細(xì)胞與環(huán)境的信息交換，因此在細(xì)胞外構(gòu)建超分子自組裝，作為調(diào)控細(xì)胞和微環(huán)境相互作用的方法[21]，從而達(dá)到利用分子納米纖維來控制細(xì)胞命運(yùn)的目的。Kuang 等[22]利用癌細(xì)胞表面過表達(dá)的磷酸酶，設(shè)計(jì)合成了磷酸化修飾的多肽，細(xì)胞表面的磷酸酶能使多肽去磷酸化，形成納米纖維，細(xì)胞外的納米纖維捕獲分泌蛋白，阻礙細(xì)胞與環(huán)境的物質(zhì)能量交換，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且基于腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的磷酸酶，自組裝納米纖維可選擇性地在腫瘤細(xì)胞表面形成[圖1(a)]。該研究闡明了一種根據(jù)酶的表達(dá)和位置，控制不同類型細(xì)胞命運(yùn)的新方法。而Pires等[20]設(shè)計(jì)合成了一種磷酸化的碳水化合物，可被細(xì)胞膜表面的堿性磷酸酶催化形成納米纖維。實(shí)驗(yàn)對比了堿性磷酸酶高表達(dá)的骨肉瘤細(xì)胞（Saos-2）和低表達(dá)的軟骨細(xì)胞（ATDC5），證明在堿性磷酸酶高表達(dá)的Saos-2 細(xì)胞表面能形成納米纖維，并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。

圖1 EISA在細(xì)胞內(nèi)外的構(gòu)建

1.2 細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建EISA

胞內(nèi)酶在細(xì)胞內(nèi)起催化作用，基于癌細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的酶（如基質(zhì)金屬蛋白酶、酯酶、弗林蛋白酶等），設(shè)計(jì)酶響應(yīng)的前體，經(jīng)過酶催化形成胞內(nèi)組裝體改變細(xì)胞質(zhì)黏度，控制細(xì)胞命運(yùn)?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMP-7）是癌細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)的酶，Tanaka等[23]設(shè)計(jì)了金屬蛋白酶催化的自組裝體系，在酶催化作用下，癌細(xì)胞內(nèi)能形成納米纖維，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。根據(jù)細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)，前體在癌細(xì)胞中顯示更大毒性，因癌細(xì)胞中有更多的金屬蛋白酶，可催化前體形成更多的納米纖維，改變細(xì)胞質(zhì)黏度，從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[圖1(b)]。

Li 等[24]合成了多肽前體作為羧酸酯酶的底物，羧酸酯酶切斷前體上的酯鍵，并催化多肽前體自組裝，在水中形成納米纖維。在最佳濃度下，這些前體對細(xì)胞無害，但對耐藥卵巢癌細(xì)胞的活性是順鉑的兩倍或三倍，為卵巢癌治療提供有效的方法。Zhou等[25]合成了牛磺酸與D構(gòu)型多肽的結(jié)合物，能促進(jìn)哺乳動物細(xì)胞對D構(gòu)型肽的攝取，細(xì)胞內(nèi)酯酶催化D 構(gòu)型多肽自組裝，進(jìn)一步促進(jìn)其細(xì)胞內(nèi)積累。

Miao 等[26]設(shè)計(jì)了一種含有125I 放射性探針的自組裝前體分子，在癌細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽和弗林蛋白酶作用下，自組裝成納米顆粒。這些放射性納米粒子可在腫瘤細(xì)胞內(nèi)聚集，因其體積大且具有疏水性，故很難從腫瘤細(xì)胞內(nèi)清除，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（MTT實(shí)驗(yàn)）表明，100μmol/L 濃度下，該探針在細(xì)胞內(nèi)無毒。該策略為分子成像智能探針設(shè)計(jì)提供了一種新方法。

2 EISA在癌癥診斷治療中的應(yīng)用

癌癥發(fā)生與酶表達(dá)密切相關(guān)[27]，與正常細(xì)胞相比，快速增殖腫瘤細(xì)胞通常具有高表達(dá)的酶[28]，如宮頸癌細(xì)胞中磷酸酶處于高表達(dá)狀態(tài)?；谀[瘤細(xì)胞的這些特點(diǎn)，可設(shè)計(jì)功能化的自組裝前體分子，利用腫瘤內(nèi)過表達(dá)的酶實(shí)現(xiàn)超分子自組裝，進(jìn)而在腫瘤細(xì)胞原位構(gòu)建功能納米組裝體，用于癌癥診斷和治療[27]。

2.1 EISA在癌癥診斷中的應(yīng)用

EISA 主要通過兩方面幫助癌癥診斷：①對腫瘤細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的酶進(jìn)行成像，檢測酶活性，為癌癥診斷提供線索；②設(shè)計(jì)酶響應(yīng)的前體作為造影劑，對腫瘤進(jìn)行成像，幫助癌癥診斷。

癌癥往往伴隨著某些酶的異常表達(dá)，酶催化自組裝可用于檢測與病理變化相關(guān)的酶的存在、含量和分布，在臨床診斷中具有較大的應(yīng)用潛力[17]。Zhou等[29]設(shè)計(jì)了一種磷酸酶熒光探針，該探針在癌細(xì)胞表面會組裝成納米纖維，增強(qiáng)熒光信號，用來檢測磷酸酶活性。Ye 等[30]設(shè)計(jì)了一種基于弗林蛋白酶的熒光探針，該探針經(jīng)弗林蛋白酶和谷胱甘肽作用，發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化并自組裝成熒光納米粒子，用于定位腫瘤過表達(dá)的弗林蛋白酶。

半胱天冬酶（Caspase）是一種細(xì)胞凋亡蛋白酶，是理想的細(xì)胞凋亡成像靶點(diǎn)。Ye 等[31]設(shè)計(jì)了一種Caspase 酶探針，該探針中的多肽DEVD 片段能被Caspase酶切掉，分子內(nèi)環(huán)化并聚集產(chǎn)生熒光，當(dāng)腫瘤細(xì)胞凋亡時Caspase 酶被激活，從而被探針檢測到。該方法可用于活體內(nèi)細(xì)胞凋亡的成像，評估癌癥治療效果[圖2(a)]。該工作實(shí)現(xiàn)了活體內(nèi)檢測Caspase 酶的活性，用于檢測腫瘤細(xì)胞的凋亡，幫助診斷癌癥治療效果。Wang 等[32]合成了Caspase3酶響應(yīng)的光聲探針，利用光聲成像檢測腫瘤內(nèi)Caspase3酶活性和生物分布。

Gd 是順磁性很強(qiáng)的金屬，常被用作造影劑。谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶是多種癌細(xì)胞表面過表達(dá)的一種酶[33]。Hai 等[34]設(shè)計(jì)了谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶響應(yīng)的Gd 探針，該探針進(jìn)入癌細(xì)胞后谷氨酸結(jié)構(gòu)被谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶切斷，再經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽還原，生成環(huán)狀二聚體，通過π-π 相互作用自組裝成納米粒子，增強(qiáng)磁共振成像的T2 加權(quán)像，為檢測深部腫瘤提供有效方法[圖2(b)]。

圖2 EISA在癌癥診斷中的應(yīng)用

2.2 EISA在癌癥治療中的應(yīng)用

EISA 利用腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的酶，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)外形成組裝體，一方面可激活細(xì)胞死亡信號通路，另一方面組裝體和抗癌藥結(jié)合可遞送藥物到腫瘤部位，誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡。而正常細(xì)胞中沒有相關(guān)酶，不會形成組裝體，顯示出精確靶向的優(yōu)點(diǎn)[35]。EISA 主要通過三種途徑實(shí)現(xiàn)癌癥治療：①超分子組裝體作為納米藥物選擇性殺死癌細(xì)胞；②作為靶向腫瘤的策略遞送抗癌藥；③通過前藥激活策略克服藥物不良反應(yīng)。

2.2.1 超分子組裝體作為納米藥物選擇性殺死癌細(xì)胞

選擇性殺死癌細(xì)胞是化療中的重大挑戰(zhàn)。近年來很多科學(xué)家利用EISA 原位構(gòu)筑納米組裝體來治療癌癥。Zhou等[36]設(shè)計(jì)了D構(gòu)型的磷酸化酪氨酸多肽[圖3(a)]，在磷酸酶作用下多肽自組裝生成納米纖維。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，磷酸化前多肽對細(xì)胞無毒，生成組裝體后可殺死癌細(xì)胞。該工作說明EISA 組裝形成的多肽納米纖維能有效抑制癌細(xì)胞，并對比了磷酸酶表達(dá)水平不同的癌細(xì)胞（HeLa 細(xì)胞和Saos-2 細(xì)胞），結(jié)果表明，磷酸酶表達(dá)水平高的Saos-2細(xì)胞更易受到抑制。他們還針對D構(gòu)型多肽選擇性殺死癌細(xì)胞的機(jī)制做了進(jìn)一步探究[37]，設(shè)計(jì)了磷酸化D構(gòu)型多肽，去磷酸化后可在癌細(xì)胞表面自組裝成納米纖維，這樣形成的納米纖維能捕獲細(xì)胞內(nèi)不同的促凋亡配體（TNF-α、CD95L 和TRAIL），使其和外源相應(yīng)的死亡受體（TNFR1/2、CD95 和DR3/4/5）結(jié)合，或直接和死亡受體CD95結(jié)合，激活細(xì)胞死亡信號通路，從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[圖3(b)]。

2.2.2 EISA作為靶向腫瘤的策略遞送抗癌藥

傳統(tǒng)的抗癌藥有很多缺點(diǎn)，如毒性大、特異性低、血液清除率快等[38-39]。然而多肽具有生物活性高、相容性好、毒性低等優(yōu)點(diǎn)，因此利用多肽進(jìn)行藥物遞送成為提高抗癌效果的有效策略。EISA 遞送抗癌藥主要通過兩種方式：①多肽和藥物共價連接；②多肽和藥物共組裝。

阿霉素[40]、喜樹堿[41]和紫杉醇[42]等傳統(tǒng)抗癌藥，已被應(yīng)用于癌癥治療。Gao 等[43]將紫杉醇和自組裝多肽共價連接來遞送納米藥物，既不損害紫杉醇的藥物毒性，又提高了藥物靶向性，表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗癌能力。Liu 等[44]設(shè)計(jì)了一種包含磷酸化多肽和鉑的前體藥物，其能被癌細(xì)胞表面和內(nèi)部的磷酸酶催化形成納米纖維，再經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽還原，鉑-氧鍵斷裂，釋放順鉑[圖3(c)]，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

多藥耐藥是癌癥化療中的主要問題。針對這一問題，Yuan 等[45]利用EISA 合成了弗林蛋白酶響應(yīng)的多肽/藥物2-氰基苯并噻唑-紫杉醇（CBTTaxol）。該藥包含穿膜肽、CBT和Taxol。在穿膜肽幫助下，藥物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在弗林蛋白酶作用下自組裝成納米粒子，依附在細(xì)胞器（如高爾基體）膜表面，由于該納米顆粒具有較大尺寸和疏水性，難以外排，延長了藥物在細(xì)胞內(nèi)的循環(huán)時間，細(xì)胞內(nèi)的酯酶能切斷納米粒子與紫杉醇之間的酯鍵，紫杉醇從納米粒子中逐漸釋放，與微管蛋白不斷結(jié)合，有效克服多藥耐藥。

另外，多肽和藥物也能通過共組裝提高癌癥治療效果。共組裝主要通過兩步進(jìn)行：①EISA 在腫瘤內(nèi)形成；②治療藥物載入腫瘤內(nèi)部與EISA 組裝體共組裝。藥物與EISA 間通過非共價相互作用結(jié)合，實(shí)現(xiàn)藥物靶向治療。通過探究吲哚菁綠（ICG） 和多肽（NapFFKY） 間的共組裝機(jī)理。Huang 等[46]探究了ICG 和NapFFKY 間的共組裝機(jī)理[圖3(d)]，磷酸化的多肽NapFFKYp 進(jìn)入腫瘤細(xì)胞去磷酸化，組裝成納米纖維，ICG 能自發(fā)地頭-尾相接排列在納米纖維中，形成共組裝體系，顯示出明顯增強(qiáng)的光熱信號，在激光照射下，納米纖維能把光轉(zhuǎn)化成熱來破壞腫瘤。

羥基喜樹堿（HCPT）是一種DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，順鉑是一種DNA 合成抑制劑，因此在癌細(xì)胞中增加這兩種藥的濃度，有利于誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡。為解決HCPT 進(jìn)入細(xì)胞核的困難，Cai等[47]利用靜電相互作用，引導(dǎo)帶負(fù)電荷的HCPT 與帶正電荷的順鉑共組裝，其共組裝合成的超分子納米藥物能更有效地傳遞這兩種藥物，并表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)，這兩種藥物的相互作用可抑制體內(nèi)的耐藥癌細(xì)胞。

2.2.3 前藥激活策略克服藥物不良反應(yīng)

雖然化療是目前抗腫瘤治療的主要手段之一，但化療藥物的毒副作用限制了給藥劑量，而減小藥物不良反應(yīng)是癌癥治療中的重大挑戰(zhàn)[48]。針對這一問題，Yao等[49]利用EISA在癌細(xì)胞內(nèi)積累生物正交反應(yīng)開關(guān)，實(shí)現(xiàn)前藥特異性激活[圖3(e)]。根據(jù)四嗪（Tz）和反式環(huán)辛烯（TCO）這一生物正交反應(yīng)對，他們設(shè)計(jì)了阿霉素前藥TCO-Dox（其中，TCO為生物正交脫籠基團(tuán)，Dox為阿霉素）和Tz修飾的磷酸化多肽前體NapK(Tz)YpF，利用癌細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)的磷酸酶，多肽前體在腫瘤細(xì)胞內(nèi)自組裝形成納米纖維，使Tz在癌細(xì)胞中大量累積，當(dāng)前藥TCODox進(jìn)入癌細(xì)胞，Tz與TCO發(fā)生快速的生物正交剪切反應(yīng)，釋放活性藥物阿霉素，實(shí)現(xiàn)前藥在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的特異性激活。該工作通過酶催化的超分子自組裝獲得腫瘤靶向性，協(xié)同生物正交反應(yīng)實(shí)現(xiàn)時空可控的前藥激活，構(gòu)建了安全有效的腫瘤抑制策略，為化療提供了新思路。

3 展望

酶催化超分子自組裝因腫瘤靶向性好、原料易制備、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，目前在自組裝方法、機(jī)理及癌癥診療等方面進(jìn)行了較多基礎(chǔ)研究。但臨床上實(shí)際應(yīng)用研究較少。因此，酶催化超分子自組裝仍有較大提升空間。①體內(nèi)超分子組裝體的微觀形貌需要明確表征。AFM（原子力顯微鏡）、SEM（掃描電子顯微鏡）、TEM（透射電子顯微鏡）等技術(shù)可很好地表征體外超分子組裝體，但由于體內(nèi)/細(xì)胞環(huán)境的復(fù)雜性，目前依然難以直接表征活體內(nèi)超分子組裝體的高分辨結(jié)構(gòu)。利用電子顯微鏡采用金屬離子（如銅、碘）標(biāo)記的方法是一種表征EISA 的潛在手段。此外，超分辨熒光成像技術(shù)的進(jìn)步及多色熒光探針的開發(fā)可能能夠精確表征體內(nèi)超分子組裝體的微觀形貌。②構(gòu)建自組裝方法的酶范圍需擴(kuò)展。酶的表達(dá)受基因調(diào)控，因此不同類型腫瘤過表達(dá)的酶種類、水平具有較大差異。目前普遍采用的酶大多數(shù)屬于水解酶，為拓展EISA 的普適性，需要開發(fā)響應(yīng)其他種類酶的觸發(fā)自組裝方法，如激酶是一種很好的癌癥靶點(diǎn)。③探索EISA與亞細(xì)胞器的相互作用。大多數(shù)酶與亞細(xì)胞器關(guān)系密切，如堿性磷酸酶位于細(xì)胞膜、蛋白酪氨酸磷酸酶1B 位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)附近、弗林蛋白酶位于高爾基體等。因此，體內(nèi)超分子組裝體分布與酶的位置密切相關(guān)，超分子組裝體的分布與亞細(xì)胞器的相互作用可進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞的命運(yùn)。

利用酶催化策略，超分子自組裝選擇性發(fā)生在特定酶過表達(dá)的位置，并產(chǎn)生預(yù)期的功能與效果，特別是細(xì)胞內(nèi)酶催化小分子生成功能納米材料，為開發(fā)納米抗癌藥物提供了獨(dú)特的策略，通過對EISA不斷深入研究，將為癌癥治療開辟新的方向。除了在癌癥治療方面的優(yōu)勢，EISA也將在抗菌、免疫調(diào)節(jié)、創(chuàng)傷修復(fù)、組織再生等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。