王蕊

昆明市食品藥品檢驗(yàn)所（昆明市食品藥品檢驗(yàn)研究院） 云南昆明 650000

食品安全問(wèn)題引起了人們的高度關(guān)注，與人們的健康息息相關(guān)。因此，做好食品檢測(cè)問(wèn)題非常必要。近年來(lái)，雜交探針技術(shù)與聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)在食品檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。

1 雜交探針在食品檢測(cè)中的應(yīng)用

在分子生物學(xué)中，雜交探針是可變長(zhǎng)度的DNA或RNA片段（通常長(zhǎng)100-10000個(gè)堿基），可以進(jìn)行放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記。然后可以將其用于DNA或RNA樣品中，以檢測(cè)與探針序列互補(bǔ)的核苷酸物質(zhì)（RNA靶標(biāo)）的存在[1]。因此，在食品檢測(cè)中，探針與單鏈核酸（DNA或RNA）雜交，由于探針和靶標(biāo)之間的互補(bǔ)性，其堿基序列允許探針與靶標(biāo)堿基配對(duì)。首先將標(biāo)記的探針變性（通過(guò)加熱或在堿性條件下，例如暴露于氫氧化鈉中）制成單鏈DNA（ssDNA），然后與固定在膜或膜上的靶標(biāo)ssDNA（Southern blotting）或RNA（northern blotting）雜交。為了檢測(cè)探針與其靶序列的雜交，用放射性或熒光分子的分子標(biāo)記物標(biāo)記探針。常用的標(biāo)記是32P，摻入探針DNA磷酸二酯鍵的磷的放射性同位素，或洋地黃毒苷，后者是基于抗體的非放射性標(biāo)記，然后通過(guò)放射自顯影或其他成像技術(shù)將雜交的探針可視化，即可檢測(cè)到與探針具有中等至高度序列相似性的DNA序列或RNA轉(zhuǎn)錄本。通常，在食品檢測(cè)中，該方法是從濾光鏡上拍攝X射線照片，或者將濾光鏡置于紫外線下，具有中等或高度相似性的序列的檢測(cè)取決于施加雜交條件的嚴(yán)格程度，高雜交溫度和雜交緩沖液中的低鹽分僅允許高度相似的核酸序列之間的雜交，而低嚴(yán)格性因?yàn)榫哂休^低的溫度和較高的鹽分，當(dāng)序列不太相似時(shí)允許雜交?；诜肿覦NA或RNA的探針通常用于篩選基因庫(kù)，使用印跡法檢測(cè)核苷酸序列以及用于其他基因技術(shù)，例如核酸和組織微陣列，可提升食品檢測(cè)的效率。

2 聚合酶鏈反應(yīng)在食品檢測(cè)中的應(yīng)用

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是一種廣泛用于快速制造特定DNA樣品的數(shù)百萬(wàn)至數(shù)十億個(gè)拷貝的方法。在食品檢測(cè)中，使用PCR，可在一系列溫度變化循環(huán)中以指數(shù)方式擴(kuò)增非常少量的DNA序列副本。

在食品檢測(cè)中，大多數(shù)PCR方法依賴于熱循環(huán)，熱循環(huán)使反應(yīng)物經(jīng)受重復(fù)的加熱和冷卻循環(huán)，以允許進(jìn)行不同的溫度依賴性反應(yīng)，特別是DNA熔解和酶驅(qū)動(dòng)的DNA復(fù)制。PCR使用兩種主要試劑-引物（一種短的單鏈DNA片段，稱為寡核苷酸，是與目標(biāo)DNA區(qū)域的互補(bǔ)序列）和一種DNA聚合酶。在食品檢測(cè)第一步中，DNA雙螺旋的兩條鏈在稱為核酸變性的過(guò)程中在高溫下物理分離。在第二步中，降低溫度并且引物與DNA的互補(bǔ)序列結(jié)合。然后，兩條DNA鏈成為DNA聚合酶的模板，以酶從游離核苷酸（DNA的組成部分）中酶促組裝一條新的DNA鏈。隨著PCR的進(jìn)行，生成的DNA本身將用作復(fù)制模板，從而啟動(dòng)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在該反應(yīng)中原始DNA模板被指數(shù)擴(kuò)增。

在食品檢測(cè)中，PCR由一系列20-40次重復(fù)的溫度變化（稱為熱循環(huán)）組成，每個(gè)循環(huán)通常由兩個(gè)或三個(gè)離散的溫度步驟組成。在循環(huán)之前，通常先在非常高的溫度（＞90°C）下執(zhí)行一個(gè)溫度步驟，然后在最后一站進(jìn)行最終產(chǎn)品擴(kuò)展或短暫存儲(chǔ)。在每個(gè)循環(huán)中使用的溫度及其施加的時(shí)間長(zhǎng)短取決于多種參數(shù)，包括用于DNA合成的酶，反應(yīng)中二價(jià)離子和dNTPs的濃度以及引物的解鏈溫度（Tm）。食品檢測(cè)要經(jīng)過(guò)以下幾個(gè)步驟：

初始化：只有需要通過(guò)熱啟動(dòng)PCR進(jìn)行熱激活的DNA聚合酶才需要執(zhí)行此步驟，其包括將反應(yīng)室加熱到94-96°C的溫度，如果使用極熱穩(wěn)定的聚合酶，則加熱到98°C，然后保持1-10分鐘。

變性：這是第一個(gè)常規(guī)循環(huán)事件，包括將反應(yīng)室加熱到94-98°C20-30秒，這會(huì)通過(guò)破壞互補(bǔ)堿基之間的氫鍵，導(dǎo)致雙鏈DNA模板的DNA熔化或變性，從而產(chǎn)生兩個(gè)單鏈DNA分子。

退火：在下一步中，將反應(yīng)溫度降低至50-65°C持續(xù)20-40秒，從而允許將引物退火至每個(gè)單鏈DNA模板。反應(yīng)混合物中通常包含兩種不同的引物，一種用于含有靶標(biāo)區(qū)域的兩種單鏈互補(bǔ)鏈。引物本身是單鏈序列，但比靶區(qū)域的長(zhǎng)度短得多，僅在每條鏈的3'端僅互補(bǔ)非常短的序列。

確定退火步驟的合適溫度至關(guān)重要，因?yàn)樾屎吞禺愋詴?huì)受到退火溫度的強(qiáng)烈影響。該溫度必須足夠低以允許引物與鏈雜交，但是必須足夠高以使雜交是特異性的，即引物應(yīng)僅與鏈的完全互補(bǔ)部分結(jié)合，而無(wú)其他結(jié)合。如果溫度太低，則底漆可能會(huì)結(jié)合不良。如果太高，引物可能根本不結(jié)合。典型的退火溫度比所用引物的Tm低約3-5°C。只有當(dāng)引物序列與模板序列非常匹配時(shí)，互補(bǔ)堿基之間才會(huì)形成穩(wěn)定的氫鍵。在此步驟中，聚合酶與引物-模板雜交體結(jié)合并開(kāi)始DNA形成。此步驟的溫度取決于所用的DNA聚合酶。Taq聚合酶的熱穩(wěn)定DNA聚合酶的最佳活性溫度約為75-80°C，盡管通常使用72°C的溫度酶。在此步驟中，DNA聚合酶通過(guò)從反應(yīng)混合物中添加與模板互補(bǔ)的方向的游離dNTP，從而合成與DNA模板鏈互補(bǔ)的新DNA鏈，從而使5'-磷酸基團(tuán)縮合。在新生（伸長(zhǎng)）DNA鏈末端帶有3'-羥基的dNTP。延伸所需的精確時(shí)間取決于所用的DNA聚合酶和要擴(kuò)增的DNA靶區(qū)域的長(zhǎng)度。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，在食品檢測(cè)中，大多數(shù)DNA聚合酶在最佳溫度下每分鐘聚合一千個(gè)堿基。在最佳條件下，由于底物或試劑的限制沒(méi)有限制，在每個(gè)食品檢測(cè)步驟中，DNA靶序列的數(shù)量都會(huì)加倍。在每個(gè)連續(xù)的周期中，原始模板鏈加上所有新生成的鏈成為下一輪延伸的模板鏈，從而導(dǎo)致特定DNA靶區(qū)域的指數(shù)擴(kuò)增，從而改善食品檢測(cè)的效果[2]。

3 結(jié)語(yǔ)

近年來(lái)，食品檢測(cè)技術(shù)在不斷發(fā)展。在食品檢測(cè)中，將雜交探針技術(shù)與聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)應(yīng)用在食品檢測(cè)中，效果非常好，具有廣泛的前景。