吳雙士, 李洪達(dá), 趙季偉, 孫 浩, 胡 樂, 王永祥

(揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 骨科, 江蘇 揚(yáng)州, 225000)

脊髓損傷(SCI)是嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷, 具有高發(fā)病率、高致殘率、高醫(yī)療費(fèi)等特點(diǎn)，可導(dǎo)致肢體不可逆的感覺及運(yùn)動功能喪失[1-2]。目前, SCI的病理機(jī)制尚不清楚，臨床上多采用外科手術(shù)、藥物治療及康復(fù)治療等手段，但療效均欠佳[3]。糖皮質(zhì)激素能與大多數(shù)動物細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，在免疫和代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[4]。地塞米松是治療SCI的常用皮質(zhì)類固醇藥物，研究[5]表明，地塞米松對神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)再生的關(guān)鍵因子Nogo-A(又稱RTN4)具有抑制作用。本研究探明了Nogo-A啟動子的糖皮質(zhì)激素結(jié)合區(qū)域，并利用生物信息學(xué)方法對該區(qū)域進(jìn)行CpG島預(yù)測，并對可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分析，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與基因組提取

采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)胃癌細(xì)胞株SGC-7901。細(xì)胞保存于37 ℃飽和濕度和5%二氧化碳培養(yǎng)箱中，每2～3 d傳代1次。所有實(shí)驗(yàn)均采用對數(shù)期細(xì)胞。采用天安普基因組DNA試劑盒(DP304)提取SGC-7901細(xì)胞基因組DNA, 所有步驟均參照說明書進(jìn)行。

1.2 人Nogo-A基因啟動子的擴(kuò)增及其產(chǎn)物的純化

針對Nogo-A不同長度截短啟動子設(shè)計(jì)的引物見表1。以SGC-7901細(xì)胞基因組DNA為模板，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增Nogo-A啟動子片段。擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性5 min, 95 ℃變性30 s, 58 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 共35個周期，然后在72 ℃下延伸10 min。將5 μL產(chǎn)品加入1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，隨后采用凝膠提取試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。

表1 Nogo-A不同長度截短啟動子的引物

1.3 純化目的片段與克隆載體的連接與鑒定

收集PCR產(chǎn)物，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后將其轉(zhuǎn)化并擴(kuò)增得到質(zhì)粒，隨后采用限制性酶XhoⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，并檢測序列。

1.4 重組表達(dá)載體的建立與鑒定

將pGL3堿性質(zhì)粒經(jīng)XhoⅠ和HindⅢ雙酶消化，加入凝膠提取試劑盒收集目的片段，用T4 DNA連接酶轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增、提取質(zhì)粒。產(chǎn)物經(jīng)雙酶消化和序列檢測，命名為pGL3-Nogo-A啟動子。

1.5 重組細(xì)胞轉(zhuǎn)染及表達(dá)活性檢測

轉(zhuǎn)染前4 h將SGC-7901細(xì)胞接種于24孔板中，每孔加入0.5 mL全培養(yǎng)基和0.5×105細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到70%～80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，采用Promega公司的雙熒光素酶報告試劑盒檢測轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的活性，每組有3個重復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，采用10-9、10-8、10-7mol/L的地塞米松處理48 h。

1.6 熒光檢測與轉(zhuǎn)錄因子分析

細(xì)胞溶解后，按照指示進(jìn)行熒光檢測。采用酶聯(lián)免疫測定儀讀取數(shù)據(jù)。對照組數(shù)據(jù)設(shè)為1, 其余數(shù)據(jù)分別與對照組比較并計(jì)算，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。Nogo-A基因序列通過UCSC(http: //genome.ucsc.edu/index.html)數(shù)據(jù)庫獲取，在GeneSorter中檢索“Nogo-A”, 截取轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-1 218～-833堿基對(bp)的序列，使用TRANSFAC數(shù)據(jù)庫和Patch 1.0軟件分析Nogo-A啟動子中可能的轉(zhuǎn)錄因子。

1.7 CpG島預(yù)測

采用EMBOSS 6.6.0在線預(yù)測軟件對啟動子區(qū)序列進(jìn)行預(yù)測，預(yù)測條件設(shè)定為觀察值/預(yù)期值大于0.60, (G+C)%大于50.00%, 長度大于200 bp。(G+C)%表示C、G這2種堿基在序列中的占比。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0 (Chicago, IL, USA)分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 啟動子載體的構(gòu)建

啟動子區(qū)域設(shè)計(jì)在起始密碼子“ATG”(atggact-tgagagga)的上游區(qū)域，分別為-1 218、-833、-428和-239 bp。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳(圖1B)和堿基序列確認(rèn)后，成功克隆了這些啟動子，并將其插入到HindⅢ和XhoⅠ雙酶切的pGL3載體中。見圖1。

2.2 熒光檢測

地塞米松處理后，除pGL3-833 bp、pGL3-428 bp和pGL3-239 bp組外, pGL3-1 218 bp組的熒光測量數(shù)據(jù)顯著增加，并呈劑量依賴性(10-9、10-8、10-7mol/L地塞米松)。結(jié)果表明地塞米松靶區(qū)或靶向轉(zhuǎn)錄因子位于起始密碼子上游-1 218～-833 bp區(qū)間。見圖2。

2.3 轉(zhuǎn)錄因子分析

PROMO 3.0.2的預(yù)測結(jié)果共有88個，主要包含GATA-1、Ap-1、AR等，見表2-1、2-2。Patch 1.0預(yù)測Nogo-A基因共有116個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，見表3。據(jù)此推測Nogo-A基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)至少包含GATA-1、Ap-1和AR, 此為2個軟件的共同預(yù)測結(jié)果，相對可靠。結(jié)合2個軟件預(yù)測結(jié)果，經(jīng)人工篩選去重后，最終確定了84個可能的轉(zhuǎn)錄因子，即AP-1、AR、C/EBPalpha、C/EBPbeta、CAC-bindingprotein、CACCC-bindingfactor、CAR、CCAAT-bindingfactor、c-Ets-1、c-Ets-2、c-Fos、c-Jun、c-Myb、COUP-TF1、CP1、CRE-BP1、deltafactor、EBP-80、Elk-1、ER-alpha、ER-beta1、FOXM1a、FOXM1b、FOXP3、FOXP3、GATA-1、GATA-2、GATA-3、GATA-4、GR-beta、HiNF-D、HiNF-M、HNF-1A、HiNF-P、HNF-3B、Hp55、Hp65、HrpF、IRF-1、IRF-2、ISGF-3、LBP-1、LF-A1、LXR-alpha、LXR-beta、MCBF、MyoD、NF-1(-likeproteins)、NF-AT1、NF-ATc、NF-ATx、NF-CLE0a、NF-CLE0b、NF-E3、NF-kappaB、NHP-1、NIP、p58、Pax-2、Pax-5、Pax-8、PEBP2alphaA1、PPAR-alpha、PR-alpha、PR-beta、RAR-alpha1、RAR-beta、RXR-alpha、RXR-beta、SF-1、SRF、STAT4、T3R-alpha1、T3R-beta1、T3R-beta2、TBP、TFIID、TFII-Ⅰ、TMF、TR2-11、VDR、XBP-1、XrpFI、YY1。

A: 啟動子區(qū)設(shè)計(jì)在起始密碼子“ATG”的上游區(qū),分別為-1 218、-833、-428和-239 bp, 并與Hind Ⅲ和Xho Ⅰ雙酶切的pGL3堿性載體連接; B: Nogo-A不同長度截斷啟動子的瓊脂糖凝膠電泳。圖1 啟動子載體的構(gòu)建

圖2 不同劑量地塞米松處理后轉(zhuǎn)染質(zhì)?；钚缘臒晒鉁y量值

表2-1 PROMO 3.0.2預(yù)測結(jié)果

表2-2 PROMO 3.0.2預(yù)測結(jié)果

表3 Patch 1.0的預(yù)測結(jié)果

2.4 CpG島預(yù)測結(jié)果

預(yù)測條件設(shè)定為觀察值/期望值大于0.60, (G+C)%大于50.00%, 長度大于200 bp。未發(fā)現(xiàn)Nogo-A啟動子區(qū)域有CpG島。見圖3。

圖3 EMBOSS 6.6.0軟件預(yù)測的甲基化CpG島圖譜

3 討 論

髓鞘衍生蛋白Nogo-A又稱RTN4, 屬于網(wǎng)狀纖維蛋白家族，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)特有的髓鞘相關(guān)神經(jīng)突起生長抑制劑。CNS中的Nogo-A有助于形成一個非容許環(huán)境，在腦/脊髓損傷和神經(jīng)再生中起著關(guān)鍵作用[6-8]。在成年人脊髓中，Nogo-A不僅在髓鞘形成的少突膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，也在神經(jīng)元中表達(dá)。Nogo-A能與其他因子共同抑制軸突的生長，如少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白(OMgp)、髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)、腎上腺素和信號素[9-12]。抑制Nogo-A可能是促進(jìn)脊髓損傷后神經(jīng)再生、可塑性和功能恢復(fù)的重要策略。

糖皮質(zhì)激素目前廣泛用于脊髓損傷的治療，其可以與受體結(jié)合減輕炎癥，因此被用于脊髓損傷的初級治療。地塞米松是常用的糖皮質(zhì)激素之一，能促進(jìn)脊髓損傷后的慢性恢復(fù)，抑制細(xì)胞凋亡[13]。啟動子分析是基因調(diào)控研究中最常用的方法。基因啟動子是指DNA序列上的一個特殊區(qū)域，主要啟動基因轉(zhuǎn)錄。通常情況下，啟動子的長度為100～1 000 bp。本研究首先克隆了Nogo-A轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游不同長度的啟動子，分別為-1 218、-833、-428、-239 bp, 并與PGL-3基本載體連接。熒光分析表明，地塞米松靶向轉(zhuǎn)錄因子位于起始密碼子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的-1 218～-833 bp區(qū)間。

在哺乳動物中, CG雙核苷酸通常以2種方式存在于基因組序列中，即分散于DNA序列中或者呈現(xiàn)高度聚集狀態(tài)，后者就是CpG島。DNA的甲基化主要發(fā)生在CG二核苷酸的胞嘧啶殘基第5個碳原子上，是一種很重要的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記，雖然不改變基因的序列，但是能調(diào)控基因的表達(dá)。研究[14]認(rèn)為，正常組織中70%～90%的CpG是甲基化的，而CpG島則是非甲基化的，當(dāng)啟動子區(qū)的CpG島被甲基化時，通常會抑制基因的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn), Nogo-A啟動子區(qū)域沒有CpG島，提示Nogo-A基因的表達(dá)調(diào)控與CpG島甲基化無關(guān)。

轉(zhuǎn)錄因子是基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，通過特異性結(jié)合啟動子和其他基因調(diào)控區(qū)域來調(diào)控基因表達(dá)。TRANSFAC數(shù)據(jù)庫包含真核轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄因子序列及其與真核DNA結(jié)合位點(diǎn)的信息。Patch1.0軟件是基于TRANSFAC數(shù)據(jù)庫中的模型匹配，在1個序列中找到與模型匹配的位置，并對每個位置進(jìn)行評分，以評價匹配的質(zhì)量。PROMO 3.0.2軟件可以從特定物種或物種群的DNA序列中識別潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，在預(yù)測時可以直接選擇人類物種作為預(yù)測條件，在一定程度上可以降低結(jié)果的假陽性率。本研究采用Patch1.0程序和PROMO 3.0.2程序在TRANSFAC數(shù)據(jù)庫中對Nogo-A基因啟動子區(qū)序列進(jìn)行了比較和預(yù)測。通過篩選本研究發(fā)現(xiàn)，一些潛在的轉(zhuǎn)錄因子，這將為地塞米松調(diào)控Nogo-A的機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)和線索。在這些轉(zhuǎn)錄因子中, c-Jun是一種由JUN基因編碼的蛋白質(zhì)，其與神經(jīng)再生密切相關(guān)。研究[15]表明, c-Jun在神經(jīng)細(xì)胞的再生過程中能顯著激活星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，而c-Jun的缺失降低了損傷后軸突再生的速度，大部分的切斷軸突的重新連接受到抑制。c-Jun與Nogo-A調(diào)控的關(guān)系未來將進(jìn)一步探討。