姚錦愛，黃 鵬，陳漢鑫，侯翔宇，余德億

（1.福建省作物有害生物監(jiān)測與治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，福建 福州 350013；2.漳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建 漳州 363005）

0 引言

【研究意義】多肉植物紅心蓮（EcheveriaPerle von Nürnberg）又名紫珍珠，其根、莖、葉肥厚多汁，可儲(chǔ)藏大量水分，是景天科（Crassulaceae）石蓮花屬(Echeveria)的重要商業(yè)化品種[1]。近年來，在福建漳州多肉植物種植基地發(fā)現(xiàn)紅心蓮植株出現(xiàn)葉片黃化、紅紫、脫落等病癥，經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)其莖部有褐色病斑，維管束和髓部變色；嚴(yán)重時(shí)，莖基部腐爛縮縊，植株倒伏死亡，對(duì)多肉植物產(chǎn)業(yè)造成威脅。經(jīng)對(duì)發(fā)病部位切片鏡檢發(fā)現(xiàn)該病是由尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)引起的紅心蓮莖腐病。尖孢鐮刀菌是重要的植物土傳病原真菌，潛伏期長，侵染初期在植株外觀上通常不顯癥，待表現(xiàn)癥狀后再采取防控措施，為時(shí)已晚[2-3]。為有效防控尖孢鐮刀菌引起的紅心蓮莖腐病為害，生產(chǎn)上迫切需要建立一種快速、準(zhǔn)確檢測紅心蓮等景天科多肉植物尖孢鐮刀菌的方法。

【前人研究進(jìn)展】環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loopmediated isothermal amplification, LAMP）是一種簡便、快速、精確、經(jīng)濟(jì)的檢測方法，其檢測時(shí)間與常規(guī)PCR 法相比大大縮短（通常1 h 內(nèi)）且特異性更高[4-6]，此外LAMP 法還可通過添加SYBR Green I、calcein、溴酚藍(lán)等DNA 染料，實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果的直觀可視化[7]。目前該檢測技術(shù)已成功應(yīng)用于炭疽菌屬Colletotrichumspp.、鐮刀菌屬Fusariumspp.、疫霉菌屬Phytophthoraspp.等植物病原真菌的快速檢測[8-10]。其中鐮刀菌屬LAMP 檢測涉及的寄主植物包括大豆、黃瓜、水稻、鷹嘴豆、玉米、小麥等[10-15]。【本研究切入點(diǎn)】但未見LAMP 應(yīng)用于多肉植物鐮刀菌屬病原菌檢測的相關(guān)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】為了獲得特異性和靈敏度更高的適用于紅心蓮尖孢鐮刀菌LAMP 檢測的特異性引物，選取在鐮刀菌種的水平上信息豐富保守基因EF-1a（Elongation factor 1α）為靶點(diǎn)，對(duì)紅心蓮尖孢鐮刀菌EF-1a基因和其他鐮刀菌序列進(jìn)行差異性分析，選取6 個(gè)特定區(qū)域，設(shè)計(jì)了4 條特異性的LAMP 引物，建立一種LAMP可視化檢測方法，以期在多肉植物紅心蓮莖腐病發(fā)生初期實(shí)現(xiàn)病原菌的快速準(zhǔn)確檢測，為該病害的早期防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及DNA 提取

供試菌株見表1，包括17 株鐮刀菌屬病原菌（其中10 株為尖孢鐮刀菌）和10 株其他菌屬病原菌（其中3 株寄主為多肉植物）。病原菌在裝有100 mL馬鈴薯-葡萄糖肉湯（每升蒸餾水中含200 g 馬鈴薯，20 g 葡萄糖）的250 mL 三角燒瓶中培養(yǎng)，在26 °C恒溫?fù)u床150 r·min-1培養(yǎng)5～6 d；真空過濾收集各菌株菌絲，后凍干48 h，用DNA 提取試劑盒（天根生物技術(shù)有限公司）提取各菌株基因組DNA，DNA 濃度使用NanoDrop 2000C 分光光度計(jì)測定（Thermo Fischer Scientific, USA），DNA 作為LAMP 檢測的模板用無菌雙蒸餾水按要求稀釋。

1.2 引物設(shè)計(jì)及合成

比對(duì)紅心蓮尖孢鐮刀菌和GenBank 中的其他7 株鐮刀菌屬病原菌的EF-1a基因序列，利用在線LAMP 引物設(shè)計(jì)軟件Primer software Explorer V4（http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html; Eiken Chemical Co., Japan）設(shè)計(jì)一套紅心蓮尖孢鐮刀菌特異性LAMP引物組，包括1 對(duì)外側(cè)引物F3/B3 和1 對(duì)內(nèi)側(cè)引物FIP/BIP 組 成（圖1）；利 用 軟 件primer 5 設(shè) 計(jì)1 對(duì)PCR 引物。LAMP 及PCR 引物序列見表2，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 LAMP 反應(yīng)體系優(yōu)化

參考李華偉等[7]的方法建立紅心蓮莖腐病菌LAMP（25 μL）反應(yīng)體系。LAMP 反應(yīng)溫度及時(shí)間優(yōu)化：將底物、引物、紅心蓮尖孢鐮刀菌樣本DNA 依次加入PCR 管混勻，無菌雙蒸水補(bǔ)至25 μL，分成2 組；1 組用于最佳溫度梯度試驗(yàn)，反應(yīng)設(shè)60、61、62、63、64、65、66 ℃等7 個(gè)溫度梯度，反應(yīng)時(shí)間為60 min；另1 組取前1 組中最佳反應(yīng)溫度，后設(shè)30、45、60、75、90 min 等5 個(gè)時(shí)間梯度；2 組試驗(yàn)反應(yīng)最后分別于80 ℃加熱10.0 min，最后在冰上終止反應(yīng)；設(shè)3 次重復(fù)。LAMP 擴(kuò)增結(jié)果的判定：反應(yīng)前在PCR 管蓋內(nèi)側(cè)加入2 μL 的1 000×SYBR Green Ⅰ，反應(yīng)后瞬時(shí)離心將1 000×SYBR GreenⅠ離心至管底與LAMP 反應(yīng)產(chǎn)物混勻，觀察LAMP反應(yīng)產(chǎn)物顏色判定擴(kuò)增結(jié)果。LAMP 檢測結(jié)果可靠性驗(yàn)證：以紅心蓮尖孢鐮刀菌DNA 為陽性對(duì)照、無菌雙蒸水為陰性對(duì)照，采用建立的紅心蓮尖孢鐮刀菌LAMP（25 μL）反應(yīng)體系及瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4 LAMP 特異性檢測及靈敏度驗(yàn)證

特異性驗(yàn)證：對(duì)27 株供試菌株進(jìn)行LAMP 檢測，通過觀察LAMP 產(chǎn)物顏色判定擴(kuò)增結(jié)果；后從反應(yīng)菌株中挑選1 株從紅心蓮上分離的F.oxysporum，3 株從多肉植物上分離的Colletotrichum destructivum、Corynespora cassiicola和Alternaria alternata，3 株 從其他寄主植物上分離的鐮刀菌屬菌株F.moniliforme、F.solani和F.sporotrichioides，共7 株菌株進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以無菌雙蒸水為陰性對(duì)照，通過判定電泳梯形條帶的有無驗(yàn)證LAMP 檢測的特異性。試驗(yàn)設(shè)3 次重復(fù)。

表1 用于LAMP 試驗(yàn)的菌株Table 1 Fungal isolates tested by LAMP assay

圖1 紅心蓮尖孢鐮刀菌LAMP 引物設(shè)計(jì)Fig.1 Design of LAMP primers for F.oxysporum in Echeveria

靈敏度驗(yàn)證：將紅心蓮尖孢鐮刀菌樣本DNA按10 倍 濃 度 梯度依次稀釋為10 ng·μL-1～1 fg·μL-18 個(gè)不同濃度，同時(shí)進(jìn)行LAMP 檢測和PCR 檢測，比對(duì)2 種檢測方法的靈敏度差異；試驗(yàn)設(shè)3 次重復(fù)。

表2 紅心蓮尖孢鐮刀菌LAMP 及PCR 檢測引物Table 2 LAMP and PCR primers of F.oxysporum in Echeveria

1.5 田間發(fā)病樣品的LAMP 檢測

利用建立的LAMP 檢測方法對(duì)采自福建（10 份樣本）及云南（5 份樣本）自然感染的紅心蓮莖腐病發(fā)病樣本進(jìn)行檢測，同時(shí)通過PCR 方法和組織分離法進(jìn)行檢測驗(yàn)證。LAMP 和PCR 檢測樣本DNA 參照Lan 等[12]的方法提取；組織分離法參照Yao 等[3]的方法進(jìn)行，略加改動(dòng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP 檢測方法建立

LAMP 反應(yīng)溫度及時(shí)間優(yōu)化結(jié)果顯示，在7 個(gè)溫度梯度中，當(dāng)反應(yīng)溫度62 ℃時(shí)，有梯形條帶出現(xiàn)，但條帶弱，隨著反應(yīng)溫度提高，條帶變亮，當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)65 、66 ℃時(shí)，條帶擴(kuò)增效果較好且無明顯差異（圖2-a），確定最佳反應(yīng)溫度為65 ℃。在5 個(gè)時(shí)間梯度中，反應(yīng)時(shí)間45 min 時(shí)，出現(xiàn)梯形條帶，但條帶弱，隨著反應(yīng)時(shí)間延長，條帶變亮，在60、75、90 min 時(shí)擴(kuò)增效果好，但效果差異不明顯（圖2-b），為提高LAMP 檢測效率，確定最佳反應(yīng)時(shí)間為60 min。依此建立紅心蓮尖孢鐮刀菌LAMP（25 μL）最優(yōu)反應(yīng)體系：底物為20 mmol·L-1Tris-HCl、10 mmol·L-1（NH4）2SO4、 6.0 mmol·L-1MgSO4、50 mmol·L-1KCl、0.8 mmol·L-1甜菜堿、1.4 mmol·L-1dNTPs 和8 UBstDNA 聚 合 酶，引 物 為0.2 μmol·L-1外 側(cè) 引 物F3/B3 和1.6 μmol·L-1內(nèi) 側(cè) 引 物FIP/BIP，1 μL 樣本DNA（50 ng），無菌雙蒸水補(bǔ)足25 μL；LAMP 反應(yīng)溫度及時(shí)間分別為65 ℃和60 min；后置于80 ℃加熱10.0 min，最后在冰上終止反應(yīng)。反應(yīng)前在PCR 管蓋內(nèi)側(cè)加入2 μL 的1 000×SYBR Green Ⅰ，反應(yīng)后瞬時(shí)離心，觀察產(chǎn)物顏色，陽性呈綠色，陰性呈黃綠色。

圖2 LAMP 反應(yīng)最佳溫度及時(shí)間篩選Fig.2 Optimal reaction temperature and time for LAMP assay

LAMP 檢測結(jié)果可靠性驗(yàn)證表明，陽性對(duì)照呈綠色，對(duì)應(yīng)的瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增出梯形條帶；陰性對(duì)照呈現(xiàn)黃綠色，瓊脂糖凝膠電泳無梯形條帶（圖3）。表明建立的LAMP 檢測方法可行，能可靠檢測到紅心蓮尖孢鐮刀菌F.oxysporum。

圖3 LAMP 檢測紅心蓮尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporumFig.3 Detection of F.oxysporum on Echeveria by LAMP assay

2.2 LAMP 特異性檢測及靈敏度驗(yàn)證

特異性檢測結(jié)果顯示，27 株供試菌株（表1）中僅有尖孢鐮刀菌菌株的LAMP 反應(yīng)管呈陽性反應(yīng)，其他菌株LAMP 反應(yīng)管均呈陰性反應(yīng)；進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳的7 株菌株，僅紅心蓮尖孢鐮刀菌產(chǎn)生電脈梯形條帶，其他6 株菌株和陰性對(duì)照均沒有產(chǎn)生條帶（圖4）。說明本研究建立的LAMP檢測方法具特異性，僅能檢出紅心蓮尖孢鐮刀菌F.oxysporum。

靈敏度驗(yàn)證結(jié)果顯示，當(dāng)紅心蓮尖孢鐮刀菌F.oxysporum樣 本DNA 質(zhì) 量 濃 度 為10 fg·μL-1時(shí)，LAMP 產(chǎn)物呈綠色（圖5），發(fā)生陽性反應(yīng)，對(duì)應(yīng)的瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增出梯形條帶（圖5）；而PCR檢測在DNA 質(zhì)量濃度為100 fg·μL-1時(shí)條帶開始變?nèi)?，DNA 質(zhì)量濃度為10 fg·μL-1時(shí)已觀察不到條帶（圖5）。說明本研究建立的LAMP 檢測方法具更高的靈敏性，其靈敏度是PCR 檢測的10 倍。

圖4 LAMP 檢測特異性驗(yàn)證Fig.4 Specificity of LAMP assay

圖5 LAMP 靈敏度檢測驗(yàn)證Fig.5 Sensitivity of LAMP and PCR

2.3 田間發(fā)病樣品的LAMP 檢測

選取15 份自然感染莖腐病菌紅心蓮莖腐病莖部組織樣本，其中8 份莖部有明顯褐色病斑；5 份癥狀不明顯，莖部有零星褐色小點(diǎn)；2 份無發(fā)病癥狀。經(jīng)LAMP 檢測、PCR 檢測和組織分離法分別檢測結(jié)果表明，田間紅心蓮莖腐病原菌-尖孢鐮刀菌的檢出率均為100%，3 種方法的檢測符合率100%，說明本研究建立的LAMP 檢測法可用于由尖孢鐮刀菌引起紅心蓮莖腐病的田間快速檢測。

3 討論與結(jié)論

LAMP 檢測技術(shù)是新興的基因擴(kuò)增技術(shù)，被廣泛用于植物病原菌的快速檢測，與PCR 檢測相比，其可在更短時(shí)間內(nèi)簡便地?cái)U(kuò)增到靶標(biāo)病原菌[16]。本研究根據(jù)紅心蓮尖孢鐮刀菌的靶標(biāo)基因序列EF-1α的6～8 區(qū) 域 設(shè) 計(jì) 特 異 性LAMP 引 物 組，通 過LAMP 體系優(yōu)化，建立了紅心蓮尖孢鐮刀菌LAMP快速檢測方法，其對(duì)紅心蓮莖腐病發(fā)病樣本的檢測結(jié)果與PCR 及組織分離法檢測的結(jié)果一致，可用于由尖孢鐮刀菌引起紅心蓮莖腐病的田間快速檢測。

特異性是LAMP 檢測技術(shù)的一個(gè)重要指標(biāo)，國內(nèi)外學(xué)者在尖孢鐮刀菌及相關(guān)種的LAMP 檢測中利用不同靶標(biāo)基因序列設(shè)計(jì)特異性引物[12,17-18]，并根據(jù)這些特異性引物建立相應(yīng)的LAMP 檢測體系。EF-1a基因序列信息豐富，有研究表明EF-1a基因在鐮刀菌種間具有一定的保守性，與rDNA-ITS、RAPD、β-tubulin 等基因相比更具特異性[19]，此外Ghosh 等[14]報(bào)道了以EF-1a基因?yàn)榘袠?biāo)設(shè)計(jì)LAMP 引物檢測F.oxysporumf.sp.Ciceris，說明EF-1a基因序列適用于尖孢鐮刀菌LAMP 引物的設(shè)計(jì)。本研究選擇紅心蓮尖孢鐮刀菌EF-1α作為靶標(biāo)基因序列設(shè)計(jì)LAMP 特異性引物有效擴(kuò)增到了所有的尖孢鐮刀菌分離株，未能擴(kuò)增所有其他菌株，包括一些密切相關(guān)的多肉植物上分離的Colletotrichum destructivum、Corynespora cassiicola、Alternaria alternata， 以 及F.sporotrichioides、F.moniliforme、F.sambucinum、F.solani、F.nivale、F.acuminatum和F.avenaceum等鐮刀菌屬真菌，表現(xiàn)出很高的特異性。

靈敏度是LAMP 檢測技術(shù)的另一個(gè)重要指標(biāo)，眾多研究表明LAMP 檢測靈敏度一般高于相應(yīng)的PCR檢測[4,18,20]。本研究建立的LAMP 方法DNA 檢測最小質(zhì)量濃度為10 fg·μL-1，而PCR 檢測為100 fg·μL-1，LAMP 法檢測靈敏度提高了10 倍；其靈敏度均高于以其他基因?yàn)榘悬c(diǎn)建立的LAMP 方法[17-18]。Ghosh 等[14]報(bào)道了以EF-1a基因?yàn)榘悬c(diǎn)設(shè)計(jì)LAMP 引物檢測F.oxysporumf.sp.ciceris，其靈敏度與本研究設(shè)計(jì)的特異性引物一致。但隨著靈敏度的提高，易導(dǎo)致開蓋形成氣溶膠污染，造成假陽性；本研究以SYBR GreenⅠ作顯色劑，反應(yīng)前直接滴于PCR 管蓋內(nèi)側(cè)，降低了假陽性出現(xiàn)。

本研究建立的紅心蓮尖孢鐮刀菌LAMP 快速檢測技術(shù)體系，不僅特異性強(qiáng)、靈敏度高，而且檢測結(jié)果可視、假陽性低，在田間能快速檢測出由尖孢鐮刀菌引起的紅心蓮莖腐病，具有很好的應(yīng)用推廣前景。今后，可對(duì)各種尖孢鐮刀菌?；偷陌袠?biāo)基因序列進(jìn)行探究，建立更加特異、靈敏的尖孢鐮刀菌專化型LAMP 快速檢測技術(shù)體系。