王錦祥,孫世坤,陳巖鋒,陳冬金,桑 雷,謝喜平
(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,福建 福州 350013)
【研究意義】葡萄球菌?。⊿taphylocosis)是兔的常發(fā)病,是危害養(yǎng)兔業(yè)發(fā)展的重要疾病之一[1-3]。該病由金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染所致,臨床上以腳皮炎、乳房炎和皮下膿腫為主要特征,也可見呼吸感染[2-5]。福建省是我國重要的家兔養(yǎng)殖區(qū),存欄量和出欄量均居全國前列。加強(qiáng)福建省內(nèi)兔源強(qiáng)毒力金黃色葡萄球菌的檢測,對兔產(chǎn)業(yè)穩(wěn)定發(fā)展具有重要意義?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】前期研究表明,金黃色葡萄球菌感染在福建省兔群中廣泛存在,該菌在病死兔肺臟、乳房炎和腳皮炎樣品中的分離率分別為19.96%、83.87%和83.33%[6]。此外,還發(fā)現(xiàn)福建省兔群中流行著兩種毒力差異較大的金黃色葡萄球菌。強(qiáng)毒力菌株能引起嚴(yán)重的致死性呼吸道感染,而低毒力菌株則引起慢性的腳皮炎、乳房炎、皮下膿腫、肺炎或其他組織器官的膿腫。強(qiáng)毒力菌株感染兔后,能在兔群中快速傳播,導(dǎo)致大量的死亡,在短期內(nèi)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]。低毒力菌株感染兔后,在兔群中表現(xiàn)為慢速的點(diǎn)狀擴(kuò)散,感染兔最終以慢性消耗性的全身衰竭而死亡[2-3,7]。由此可見,實(shí)現(xiàn)對強(qiáng)毒力菌株的快速檢測,對保障養(yǎng)兔業(yè)的發(fā)展具有重要意義?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前,針對金黃色葡萄球菌的檢測方法主要有細(xì)菌分離鑒定和單重PCR[1-3,8-9],尚未見用于鑒別強(qiáng)毒力金黃色葡萄球菌的雙重PCR 檢測方法報(bào)道?!緮M解決的關(guān)鍵問題】為了快速地對福建省兔群中強(qiáng)毒力金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測,本試驗(yàn)根據(jù)強(qiáng)毒力和低毒力菌株攜帶不同毒力基因的特點(diǎn)(強(qiáng)毒力菌株為nuc和pvl陽性;低毒力菌株為nuc陽性,pvl陰性)[4,6],針對nuc和pvl兩種毒力基因的保守序列分別設(shè)計(jì)了兩對特異性引物,建立了檢測強(qiáng)毒力菌株的雙重PCR 檢測方法。該方法不僅能同時(shí)檢測出強(qiáng)毒力和低毒力菌株并且還能區(qū)分強(qiáng)毒力和低毒力菌株,為兔葡萄球菌病的診斷提供技術(shù)支持。
1.1.1 菌株 兔源金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)強(qiáng)毒力和低毒力菌株、多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)、支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)、大腸桿菌(Escherichia coli)由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。上述分離菌均用腦心浸出液培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)支氣管敗血波氏桿菌時(shí)添加1%甘油。
1.1.2 主要試劑 腦心浸出液培養(yǎng)基(Brain Heart Infusion,BHI)購自O(shè)xoid 公司;2×PCR Mix、細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒和膠回收試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。
1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室分離的兔源金黃色葡萄球菌強(qiáng)毒力菌株的nuc和pvl基因序列以及低毒力菌株的nuc基因序列,并結(jié)合這兩種基因在NCBI基因庫中的BLAST 分析結(jié)果,應(yīng)用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)了兩對分別針對nuc和pvl基因保守序列的特異性引物(表1),引物由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司合成。
表1 雙重PCR 檢測方法引物Table 1 Primers for duplex PCR assay
1.2.2 單重PCR 檢測方法的建立及擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定 按照細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒說明書分別提取兔源金黃色葡萄球菌強(qiáng)毒力和低毒力菌株的基因組DNA。分別以強(qiáng)毒力和低毒力菌株的基因組DNA 為模板,利用nuc和pvl基因引物進(jìn)行單重PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為50 μL:包含25 μL 2×PCR Mix,基因組DNA 100 ng,上下游引物各0.2 μmol·L-1。PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,35 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后切膠回收,送上海鉑尚生物技術(shù)有限公司測序。
1.2.3 雙重PCR 檢測方法的建立及反應(yīng)條件的優(yōu)化 將濃度稀 釋至40 μmol·L-1的nuc和pvl基因 的上下游引物等體積混合,作為雙重PCR 的引物。在步驟1.2.2 的基礎(chǔ)上建立雙重PCR 檢測方法,PCR 反應(yīng)體系為50 μL:包含25 μL 2×PCR Mix,強(qiáng)毒力菌株或低毒力菌株基因組DNA100 ng,混合引物0.4 μmol·L-1。PCR 反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,35 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。在此基礎(chǔ)上,將雙重PCR 檢測方法的退火溫度設(shè)置為53~60 ℃,將混合引物的終濃度設(shè)置為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 和0.8 μmol·L-1,對 雙重PCR 反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,確定最佳的退火溫度和引物濃度。
1.2.4 雙重PCR 檢測方法特異性試驗(yàn) 按照細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒說明書分別提取兔源多殺性巴氏桿菌、支氣管敗血波氏桿菌、肺炎克雷伯菌和大腸桿菌的基因組DNA。以提取的基因組DNA 為模板,應(yīng)用建立的雙重PCR 檢測方法分別進(jìn)行擴(kuò)增,并設(shè)置陰性對照,檢測雙重PCR 方法的特異性。
1.2.5 雙重PCR 檢測方法敏感性試驗(yàn) 分別取強(qiáng)毒力菌株和低毒力菌株的基因組DNA100 ng,進(jìn)行連續(xù)的10 倍倍比稀釋,以稀釋的基因組DNA 為模板,應(yīng)用建立的雙重PCR 檢測方法分別進(jìn)行擴(kuò)增,檢測雙重PCR 方法的敏感性。
1.2.6 雙重PCR 檢測方法重復(fù)性試驗(yàn) 取60 份已知結(jié)果的樣品,平均分為3 組,每組20 份(強(qiáng)毒力菌株陽性樣品6 份,低毒力菌株陽性樣品8 份,陰性樣品6 份)。應(yīng)用建立的雙重PCR 方法重復(fù)3 次檢測上述60 份樣品,根據(jù)檢測結(jié)果與已知結(jié)果的符合率分別計(jì)算批內(nèi)和批間變異系數(shù),評(píng)價(jià)雙重PCR 方法的重復(fù)性。
1.2.7 臨床樣品的檢測 119 份從福州、南平、三明和龍巖4 個(gè)地區(qū)收集的呼吸道病死兔肺臟樣品,用已報(bào)道的檢測金黃色葡萄球菌nuc[8]和pvl[9]基因的單重PCR 方法和本試驗(yàn)建立的雙重PCR 方法同時(shí)進(jìn)行檢測,統(tǒng)計(jì)檢測結(jié)果,比較雙重PCR 方法檢測結(jié)果與已報(bào)道的單重PCR 方法檢測結(jié)果的一致性。
應(yīng)用本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物能特異地?cái)U(kuò)增出強(qiáng)毒力菌株的nuc(320 bp)和pvl(585 bp)基因片段以及低毒力菌株的nuc(320 bp)基因片段,而低毒力菌株的pvl基因片段以及陰性對照(滅菌ddH2O)的nuc和pvl基因片段的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性(圖1)。測序結(jié)果表明,擴(kuò)增得到的nuc和pvl基因片段的序列與對應(yīng)的參考基因的同源性均為100%。
將強(qiáng)毒力菌株或低毒力菌株基因組DNA 的量固定為100 ng 進(jìn)行雙重PCR 擴(kuò)增,結(jié)果表明混合引物濃度為0.4 μmol·L-1、退火溫度為58 ℃時(shí)能分別擴(kuò)增出強(qiáng)毒力菌株的nuc和pvl基因片段和低毒力菌株的nuc基因片段(圖2)。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對反應(yīng)體系中混合引物的濃度和退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明當(dāng)混合引物的濃度為0.6~0.8 μmol·L-1(圖3-A)、退火溫度為57.5~60.0 ℃時(shí)(圖4-A),雙重PCR 對強(qiáng)毒力菌株的擴(kuò)增效果較好;當(dāng)混合引物的濃度為0.5~0.7 μmol·L-1(圖3-B)、退火溫度為57.5~59.6 ℃時(shí)(圖4-B),雙重PCR 對低毒力菌株的擴(kuò)增效果好。引物會(huì)與反應(yīng)體系中的Mg2+結(jié)合而抑制DNA 聚合酶的活性,而退火溫度越高則特異性越強(qiáng)。因此,確定雙重PCR 的最優(yōu)反應(yīng)條件為引物濃度0.6 μmol·L-1和退火溫度59.6 ℃。
圖1 單重PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Result of single PCR amplification
圖2 雙重PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Result of duplex PCR amplification
圖3 雙重PCR 檢測方法引物濃度優(yōu)化Fig.3 Optimization on primer concentration for duplex PCR assay
圖4 雙重PCR 檢測方法退火溫度優(yōu)化Fig.4 Optimization on annealing temperature for duplex PCR assay
應(yīng)用建立的雙重PCR 檢測方法能特異地?cái)U(kuò)增出兔源金黃色葡萄球菌強(qiáng)毒力菌株的nuc和pvl基因片段以及低毒力菌株的nuc基因片段,而多殺性巴氏桿菌、支氣管敗血波氏桿菌、肺炎克雷伯菌和大腸桿菌等4 種常見兔源細(xì)菌性病原以及陰性對照(滅菌ddH2O)的結(jié)果均為陰性(圖5)。結(jié)果表明,該雙重PCR 檢測方法具有良好的特異性。
取強(qiáng)毒力菌株和低毒力菌株的基因組DNA 各100 ng,進(jìn)行連續(xù)的10 倍倍比稀釋,使雙重PCR 反應(yīng)體系中模板的量為1 fg~100 ng。擴(kuò)增結(jié)果顯示,該雙重PCR 檢測方法能檢測到的強(qiáng)毒力菌株和低毒力菌株的最低模板量為分別為10 pg(圖6-A)和100 fg(圖6-B)基因組DNA。結(jié)果表明,該雙重PCR 檢測方法具有良好的敏感性。
圖5 雙重PCR 檢測方法特異性Fig.5 Specificity test of duplex PCR assay
圖6 雙重PCR 檢測方法敏感性Fig.6 Sensitivity test of duplex PCR assay
應(yīng)用建立的雙重PCR 方法檢測3 組已知結(jié)果的樣品(每組20 份,共60 份),重復(fù)3 次,結(jié)果顯示,重復(fù)性試驗(yàn)批內(nèi)和批間的變異系數(shù)均為0,表明該雙重PCR 方法具有良好的重復(fù)性。
應(yīng)用建立的雙重PCR 方法檢測檢測119 份臨床樣品(82 份已知結(jié)果,37 份未知結(jié)果),檢測出強(qiáng)毒力菌株陽性樣品30 份、低毒力菌株陽性樣品45 份和陰性樣品44 份,檢測結(jié)果與已報(bào)道的單重PCR 方法檢測結(jié)果的符合率為100%(表2)。結(jié)果表明,該雙重PCR 檢測方法具有良好的準(zhǔn)確性。
表2 臨床樣品的檢測Table 2 Detection of clinical samples
葡萄球菌病是危害養(yǎng)兔業(yè)發(fā)展的重要疾病之一。前期研究結(jié)果表明,福建省兔群中流行著兩種毒力差異較大的金黃色葡萄球菌。強(qiáng)毒力菌株是序列型為ST121 的菌株,該菌株危害所有日齡的兔,能在兔群中快速傳播,引起嚴(yán)重的致死性呼吸道感染[4];低毒力菌株是序列型為ST398 的菌株,該菌株主要危害成年兔,在兔群中呈慢速的點(diǎn)狀擴(kuò)散,引起慢性的化膿性感染[2-3,6]。由此可見,不同毒力菌株感染導(dǎo)致的臨床癥狀的多樣化給兔葡萄球菌病的診斷帶來了困難。
本試驗(yàn)根據(jù)不同毒力金黃色葡萄球菌攜帶不同毒力因子的特點(diǎn),選取nuc和pvl兩種毒力基因作為目的基因,建立了檢測兔源強(qiáng)毒力金黃色葡萄球菌的雙重PCR 檢測方法。nuc基因編碼耐熱核酸酶,普遍存在于金黃色葡萄球菌中,是該菌的一種特異基因[8,10]。研究表明,以nuc基因?yàn)槟康幕蚰芙z測金黃色葡萄球菌的特異性PCR 檢測方法[8-9]。pvl基因編碼殺白細(xì)胞毒素,該毒素是導(dǎo)致壞死性肺炎的主要毒力因子,是強(qiáng)毒力金黃色葡萄球菌菌株的重要標(biāo)志之一[9,11]。因此,選取nuc和pvl基因作為目的基因建立檢測福建省兔源強(qiáng)毒力金黃色葡萄球菌的雙重PCR 檢測方法是可行的。本試驗(yàn)對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化后,建立了特異性強(qiáng)、敏感性高、準(zhǔn)確性高和重復(fù)性好的雙重PCR 檢測方法。該檢測方法能同時(shí)擴(kuò)增出強(qiáng)毒力菌株的nuc和pvl基因片段,能擴(kuò)增出低毒力菌株的nuc基因,不僅能作為兔源金黃色葡萄球菌的特異性檢測方法,在強(qiáng)毒力或低毒力菌株單純感染的情況下還能作為強(qiáng)毒力和低毒力菌株的鑒別診斷方法。此外,該雙重PCR 檢測方法僅需約3 h 就能檢測出樣品中的強(qiáng)毒力或低毒力菌株,與傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定相比較,極大地提高了檢測效率。該雙重PCR 檢測方法的建立將為兔葡萄球菌病的診斷提供有力的技術(shù)支撐。