張素妍， 夏恩蕊， 周青麗， 張順貞

云南中醫(yī)藥大學 a.中藥學院； b.基礎醫(yī)學院， 昆明 650000

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關的代謝應激性肝損傷，是最常見的肝臟疾病之一，發(fā)病率逐年增加[1-3]。NAFLD的發(fā)生與代謝綜合征在中醫(yī)病因病機及體質類型和證候特點上具有高度一致性[4]。小腸是物質吸收、消化的重要部位，而且有機陰離子轉運多肽(organic anion transporting polypeptide，OATP) 2B1是水液代謝中重要的物質基礎，因此本實驗用去脂軟肝方對NAFLD大鼠進行干預，探討其對NAFLD大鼠小腸組織中OATP2B1水平的影響，進一步闡明其分子機制，為相關臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 SD雄性大鼠(180～220 g)36只[購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產許可證號:SCXK(湘)2016-0002，實驗單位使用許可證編號:SYXK(滇)K2013-0002]。去脂軟肝方(由莪術、白術、山楂、菊花、三七、青皮、蘭花參七味中藥組成)；辛伐他汀片(Merck Sharp & Dohme B.V. ，批號:RO13440)。高脂飼料(88%普通飼料、10%豬油、2%膽固醇)、普通飼料均購自楚商生物有限公司。Ultrapure RNA Kit RNA提取試劑盒(康為世紀生物科技有限公司，批號:CW0581S)；SuperRT cDNA Synthesis Kit cDNA合試劑盒(康為世紀生物科技有限公司，批號:CW0741S)；UltraSYBR Mixture(High ROX)(康為世紀生物科技有限公司，批號:CW2602M)；OATP2B1抗體(PL Laboratories，批號:PL0305169)；GAPDH抗體(ABCAM，批號:ab181602)；HRP-山羊抗小鼠IgG(H+L)(Beyotime，批號:A0216)；HRP-山羊抗兔IgG(H+L)(Beyotime，批號:A0208)； Marker(Beyotime，批號:P0066)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(Solarbio，批號:PC0020)；超敏ECL發(fā)光試劑盒(CLiNX，批號:1810202)等。酶標儀(BioTek，EPOCH)；熒光定量PCR儀(Heal Force，CG)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo3111)；顯微鏡(奧林巴斯CX23)；移液器(Eppendorff)；垂直板電泳裝置(Tanon VE-180PRE)；垂直板電泳膠轉膜儀裝置(Tanon VE-586)；Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)(CLiNX，6000 pro)等。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥 36只SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為6組，即正常組、模型組、辛伐他汀組、去脂軟肝方高、中、低劑量組，每組各6只。正常組給予普通飼料，其余各組均給予高脂飼料造模。造模的同時預防給藥，正常組、模型組用生理鹽水灌胃(1 ml·100 g-1·d-1)，辛伐他汀組用辛伐他汀片灌胃給藥(1.8 mg·kg-1·d-1)，去脂軟肝方高、中、低劑量組分別按生藥量27.72 g·kg-1·d-1、13.86 g·kg-1·d-1、6.93 g·kg-1·d-1進行灌胃給藥，生藥濃度分別為2.77 g/ml、1.39 g/ml、0.69 g/ml，給藥體積為1 ml·100 g-1·d-1。第14周末實驗結束后，處死動物，采集血清、肝臟及小腸樣本，-80 ℃保存，部分肝臟用4%多聚甲醛固定,室溫保存。

1.2.2 肝指數檢測 取材時，稱定大鼠體質量和肝濕重，肝指數=(肝濕重/體質量)×100%。

1.2.3 血清肝功能指標 采用全自動生化儀檢測大鼠ALT、AST、血糖(GLU)、血清膽固醇(CHOL)水平。

1.2.4 肝組織病理 大鼠肝臟用4%多聚甲醛固定后，常規(guī)制備肝組織石蠟切片，HE染色，顯微鏡下拍片。

1.2.5 RT-PCR法檢測小腸組織中OATP2B1 mRNA表達量 按試劑盒說明提取RNA，測定濃度和純度。利用Primer3軟件設計引物序列，由華大基因合成，以RT-PCR方法檢測目的基因的mRNA水平。

1.2.6 Western Blot檢測小腸組織中OATP2B1蛋白表達水平 取-80 ℃下保存的大鼠小腸組織，提取總蛋白后測定其濃度，每孔加40 μg總蛋白上樣，進行SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉法電轉移至硝酸纖維素膜，以1% 牛血清白蛋白對膜進行封閉40 min，再加入一抗與對照抗體，4 ℃孵育過夜，洗膜后加HRP標記的二抗，37 ℃孵育1 h，洗膜，ECL試劑曝光顯影。

1.3 倫理學審查 本研究方案經由云南中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審批(批號：R-082018075)，符合實驗室動物管理與使用準則。

2 結果

2.1 肝臟病理組織變化 正常組大鼠肝組織肝小葉結構完整，肝索、肝竇分布正常，肝細胞形態(tài)一致，排列整齊有序，未見明顯變性壞死；模型組大鼠肝組織肝小葉結構紊亂，肝索增寬，肝竇融合，肝細胞排列紊亂，細胞形態(tài)大小不一，具有大量脂肪空泡，部分區(qū)域匯管區(qū)和小葉內有少量淋巴細胞浸潤；與模型組比較，各用藥組病變明顯減輕(圖1)。

2.2 各組大鼠肝指數比較 與正常組相比，模型組肝指數顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，去脂軟肝方各用藥組肝指數均明顯降低(P值均<0.05);與辛伐他汀組比較，去脂軟肝方各用藥組肝指數亦均明顯降低(P值均<0.05)(表1)。

2.3 各組大鼠血清肝功能變化 與正常組相比，模型組大鼠GLU、CHOL水平均顯著升高(P值均<0.05)；與模型組相比，各用藥組均能降低GLU、CHOL水平(P值均<0.05)(表2)。

表1 各組大鼠肝指數的比較

表2 各組大鼠血清肝功能指標的比較

注:a,正常組；b，模型組；c，辛伐他汀組；d，去脂軟肝方高劑量組；e，去脂軟肝方中劑量組；f，去脂軟肝方低劑量組。

2.4 各組大鼠小腸組織OATP2B1 mRNA表達情況 與正常組相比，模型組OATP2B1 mRNA表達顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，辛伐他汀組和去脂軟肝方高、中劑量組OATP2B1 mRNA表達均顯著降低(P值均<0.05)；與辛伐他汀組比較，去脂軟肝方中、低劑量組OATP2B1 mRNA表達均顯著降低(P值均<0.05)(表3)。

表3 各組大鼠小腸組織OATP2B1 mRNA相對表達水平比較

2.5 各組大鼠小腸組織OATP2B1蛋白表達情況 與正常組相比，模型組OATP2B1蛋白表達顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，各用藥組OATP2B1蛋白表達均顯著降低(P值均<0.05)；與辛伐他汀組比較，去脂軟肝方高、中、低劑量組OATP2B1蛋白表達均顯著降低(P值均<0.05)(圖2,表4)。

3 討論

NAFLD歸屬于中醫(yī)“脅痛”“積聚”“痞證”“肝脹”“肝癖”“肥氣”等范疇[5-7]，中醫(yī)認為肝脾相關，肝屬木，脾屬土，兩者生理上相關，主要表現為肝主疏泄和脾主運化功能之間的相互促進，以及肝藏血與脾統(tǒng)血之間的相互配合，共同在人體的消化、吸收、血液運行及水液代謝過程中發(fā)揮重要作用。 其中肝脾二臟在飲食消化吸收方面的相關最為重要，膳食營養(yǎng)攝入影響NAFLD的發(fā)生與發(fā)展過程[8]，過食肥甘，導致脾失健運[9]，水谷精微不化，水濕內停，凝結成痰，痰阻氣機，氣機升降失調，水濕不化，久而傷肝[10]?，F代醫(yī)學“腸”的功能屬于中醫(yī)“脾”的功能已毋庸質疑，因此，肝脾相關亦可表現為現代醫(yī)學中肝臟與腸道在生理病理上的相關性?！靶∧c者，受盛之官，化物出焉”，小腸與脾共主運化而各司其職，與機體代謝同樣十分密切[9,11]。有機陰離子轉運肽家族是重要的膜轉運蛋白，介導大量體內外化合物的吸收，相關研究證明OATP的異常表達，與脾虛[12-13]、肝癌[14]、NAFLD[15]等多種疾病密切相關，OATP2B1作為OATP家族中重要的一員，在機體大部分器官都有表達，介導許多藥物和內源性化合物的肝和腸吸收[16]，而小腸作為消化、吸收的重要部位，與OATP2B1的關系不容忽視。

注：1～6分別為正常組、模型組、辛伐他汀組、去脂軟肝方高、中、低劑量組。

表4 各組大鼠小腸組織OATP2B1蛋白相對表達水平比較

去脂軟肝方為云南省肝病專家、榮譽名中醫(yī)蘇漣教授的經驗方，由莪術、白術、山楂、菊花等七味中藥組成，具有柔肝健脾、理氣活血的功效。本課題組前期研究證明，在該方的基礎上加減治療脂肪肝在臨床上具有很好的治療效果，同時去脂軟肝方能夠改善高脂飲食誘導的脂肪肝大鼠血脂、肝脂及肝組織脂肪變性及血液流變學相關指標[17]，NAFLD的病變與OATP2B1在不同器官的表達有密切聯系。本實驗采用高脂飲食造模14周，用去脂軟肝方進行干預治療后，去脂軟肝方能夠通過降低大鼠肝指數、GLU、CHOL水平改善NAFLD病變。NAFLD大鼠小腸組織中OATP2B1 mRNA和蛋白表達相對于正常組明顯上調，使用去脂軟肝方干預治療后，能夠顯著下調OATP2B1 mRNA和蛋白水平的表達，且差異具有統(tǒng)計學意義。長期高脂飲食刺激，機體產生大量的“痰濕”，機體可能通過上調OATP2B1的表達，對這些異物進行轉運，最終維持機體動態(tài)平衡，但是由于長期的過度刺激，OATP2B1過表達后，對這些生物體異物進行大量轉運而機體不能及時將這些物質快速代謝或排泄，從而引起水液的代謝障礙。筆者認為去脂軟肝方可能通過降低OATP2B1的表達，減緩NAFLD的病變程度，但是其作用機理需要進一步探討。

利益沖突聲明：本研究不存在與研究者、倫理委員會成員以及公開研究成果有關的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻聲明：張素妍負責課題設計，資料分析，撰寫論文；夏恩蕊、周青麗參與收集數據，修改論文；張順貞負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。