呂希坤,樂 園,張成桂

(1.北京化工大學 化學工程學院,北京100029;2.大理大學 藥學與化學學院,云南 大理671000)

1 前 言

美洲大蠊(periplaneta americana,PA)屬昆蟲綱，蜚蠊目，蜚蠊科，是地球上起源最早、生命力最頑強的昆蟲類群之一[1]。作為一種應用較為廣泛的昆蟲藥物[2]，美洲大蠊提取物中含有海藻糖、肌醇、苯丙氨酸、天冬酰胺等多種糖蛋白和氨基酸，具有增強機體免疫力、保護肝臟、促進組織修復和廣泛的抗腫瘤等作用[3]。自20世紀80年代以來，相繼研發(fā)并且在國內獲批上市的美洲大蠊制劑有康復新液、肝龍膠囊、心脈隆等，其中康復新液在應用于皮膚創(chuàng)傷修復時具有很好的促進創(chuàng)口愈合作用，并能降低傷口感染[4]。然而，同其它幾種已經開發(fā)的用于提高創(chuàng)傷修復效果的藥物，比如透明質酸[5]、蘆薈膠[6]、積雪草苷[7]一樣，美洲大蠊提取物的主要活性物質多為易溶于水的極性大分子，不易透過皮膚表皮層到達病變部位，其藥效及應用在一定程度受到了限制。

脂質體(liposome,LIP)作為一種藥物載體，是一種具有雙分子層結構，與人體細胞膜相似的人工生物膜[8]，其與皮膚角質層具有相似的結構和很好的生物相容性，其包裹藥物時能夠更好地透過表層皮膚，并儲存在表皮與真皮之間，形成藥物儲庫，達到持續(xù)釋藥、提高治療效果的目的[9]。脂質材料在生物體內可降解，對人體無毒無刺激[10]，但由于其具有流動性，貼合性差，易造成藥物流失，把脂質體制成凝膠制劑時，更易于涂布于皮膚上。本研究采用乙醇注入法制備柔性脂質體，將磷脂、膽固醇、柔性劑等膜材溶于乙醇中，水溶性藥物溶于水相中，將有機相注入水相中一步形成脂質體[11]。

本文針對皮膚創(chuàng)傷修復制劑難以有效透過皮膚這一問題，將美洲大蠊提取物制備成柔性脂質體凝膠，并對該柔性脂質體凝膠的性能進行表征，為美洲大蠊提取物高性能皮膚透過制劑的開發(fā)提供基礎。

2 實 驗

2.1 實驗原料和儀器

2.1.1實驗原料

美洲大蠊提取物(云南大理大學提供，總氨基酸成分含量約為60%)；超純水(超純水系統(tǒng)制得，RO-DI)；膽固醇(阿拉丁，分析純)；吐溫-20(源葉，生物級)；高純蛋黃卵磷脂(日本丘比株式會社，PC≥90%)；無水乙醇(北京化工廠，分析純)；1,2-丙二醇(Amethyst，≥99.8%)，卡波姆-940(Macklin，EP)。

2.1.2實驗儀器電子分析天平(XA105DU，瑞士Mettler Toledo集團)；納米粒徑電位分析儀(Nano-ZS90，英國Malvern儀器有限公司)；實驗室純水系統(tǒng)(Smart-S30，上海和泰儀器有限公司)；掃描電子顯微鏡(JSM-7800F，日本Jeol 公司)；透射電鏡(HT7800，日本Hitachi)；高效液相色譜(Waters2695，美國Waters公司)；電熱恒溫水浴鍋(HH-1，北京科偉永興有限公司)。

2.2 實驗方法

2.2.1 PAE 標準曲線的繪制

PAE 標準溶液的配制：精密稱取PAE 0.050 0 g 于50 mL 的容量瓶內，用超純水定容，作為儲備液。用移液槍分別精密汲取適量儲備液，用超純水稀釋，得到質量濃度為10、20、50、100、200、300、400、500、600、800μg.mL-1的PAE標準溶液。在波長282 nm 處，對10個標準溶液進行高效液相色譜分析，得到出峰位置的峰面積，并以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行回歸分析，計算得到標準曲線：y= 4 077.9x+ 7 760.7，R2= 0.999 9，表明在10～800μg.mL-1PAE 濃度與峰面積之間有良好的線性關系。

2.2.2 PAE-ULIP的制備

采用乙醇注入法制備PAE-ULIP，準確稱取適量的高純蛋黃卵磷脂和膽固醇、吐溫-20于燒杯中，并加入適量無水乙醇使其充分溶解作為有機相；準確稱取適量PAE 于燒杯中，加入一定量的純水使其溶解，溶解后全部轉入錐形瓶；將錐形瓶置于恒溫磁力攪拌水浴鍋中，維持溫度并攪拌，然后將有機相緩慢注入錐形瓶中即得到PAE-ULIP。通過水浴超聲對脂質體進行分散勻化，乙醇的去除可以通過減壓蒸發(fā)的方式[12]，脂質體溶液于4℃冰箱冷藏保存。

2.2.3包封率的測定

精密稱取0.1 mL 的脂質體混懸液于10 mL 離心管中，加入0.3 mL 魚精蛋白(10 mg.mL-1)攪勻[13]。靜置3 min，加入5.0 mL 生理鹽水，3 500 r.min-1離心20 min，吸取上清液，高效液相色譜測定，計算藥物游離量；另稱取0.1 mL脂質體混懸液于10 mL 離心管中，加入5.0 mL乙醇破乳，高效液相色譜測定，計算藥物總量。脂質體的包封率EE計算如下式：

2.2.4凝膠的制備

凝膠的制備主要包括PAE-ULIP凝膠的制備與PAE 凝膠的制備。

PAE-ULIP為混懸液，用于皮膚給藥時存在諸多不便，而凝膠基質可以較好地施敷[14-15]。稱取1.2 g的1,2-丙二醇與10 mL 去離子水混合均勻，制成混合液；同時稱取0.8 g 卡波姆-940置于混合液中，充分溶脹后得到凝膠基質。取15 mL PAE-ULIP混懸液與凝膠基質混合攪拌均勻，得到PAE-ULIP凝膠。

稱取PAE 300 mg 溶解于15 mL 純水中，同時取凝膠基質10 mL，將二者充分混合均勻，即得到PAE凝膠。

2.2.5體外釋藥與透皮實驗

將制備的PAE-ULIP凝膠、PAE-LIP凝膠、PAE凝膠采用透析袋法分析比較這3種凝膠的體外釋放度。接受介質為pH=7.4的PBS緩沖溶液，調節(jié)至適宜的電磁攪拌速度，保證釋放介質與透析袋流動接觸，測量0、0.5、1、2、4、6、8、12、24、36 h 的釋藥量，每次取樣后補充相同體積的新鮮釋放介質，使用HPLC測量PAE 活性物質的含量。

皮膚是藥物經皮給藥的吸收途徑，同時也是藥物進行滲透傳遞的主要生理屏障[16]。PAE 中含有大量的生物大分子，不易通過角質層到達活性表皮層[17]。通過制備柔性脂質體凝膠包載PAE時，能夠使其較好地進入皮膚組織發(fā)揮藥效。以PAE 凝膠為對照，PAE-ULIP凝膠為實驗組，采用人工皮膚膜Strat-M 進行體外透皮研究，考察PAE-ULIP凝膠的體外透皮性能。

Strat-M膜是擴散透皮測試專用人工生物膜，高分子量藥物通過Strat-M的滲透與人體皮膚非常相似，專用于各種醫(yī)學實驗，皮膚專用[18-19]。

將裁剪合適的人工膜固定在透皮實驗裝置的擴散池和接收池之間。接收池(15 mL，d=15 mm)中加入含0.1%吐溫-80的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4)，設定溫度為37℃、轉速為300 r.min-1。實驗組在擴散池中加入0.5 g 柔性脂質體凝膠，分別于0.5、1、2、4、6、8、12、24 h 取樣0.5 mL，每次取樣后補充0.5 mL 新鮮的釋放介質。HPLC測定樣品中PAE 濃度，計算單位面積累積釋放量；對照組以同樣方法進行。累計釋放量計算如下式：

式中：Qn為藥物的累積釋放量，V為接收室總體積(15 mL)，ρn為第n次取樣時接收液中藥物的質量濃度，ρ i為第n次取樣前所檢測到藥物的質量濃度，Vi為取樣量體積(0.5 mL)，A為有效擴散面積(1.77 cm2)。

2.2.6抗炎性能

采用酶聯免疫吸附法檢測PAE-ULIP凝膠的抗炎性能。脂多糖(LPS)能夠刺激RAW264.7細胞產生炎癥反應，釋放炎癥因子，通過測量細胞培養(yǎng)液中炎癥因子TNF-α 的濃度間接表征藥物的抗炎性能。

測定原理：采用抗原與抗體的特異反應將待測物與酶連接，再利用酶與底物產生的顏色反應，在450 nm 最大吸收波長處測定有色產物的吸光值，吸光值大小與待測物濃度成正比，可用于定量測定RAW264.7細胞中TNF-α 等細胞因子濃度，進而直接反映炎癥發(fā)生的程度，并由此推斷藥物抗炎性能。

3 結果與分析

3.1 正交試驗極差分析法優(yōu)選配方

根據相關文獻[20-23]中制備過程因素對性能的影響，主要考察的因素有5個，分別是：溫度θ(A)、攪拌轉速N(B)、有機相與水相的比例Qa:Qw(C)、卵磷脂與膽固醇的比例ρ(EPC):ρ(CHO)(D)、卵磷脂的質量濃度ρ(EPC)(E)；每個因素選取4個水平，以包封率EE 為考察指標對正交方案進行極差分析，并最終得出最優(yōu)方案。設計L16(45)的正交試驗因素與水平表1。

表1 正交試驗因素與水平表Table 1 Factors and levelsfor orthogonal tests

正交試驗結果如表2所示，其中Mij(i=1,2,3,4；j=1,2,3,4,5)為j列不同水平i所對應的EE 之和，根據極差Rj大小可以排列出因素的主次順序，EE 影響的主次順序為：C＞E＞B＞D＞A。由Rj的大小可以看出，因素Qa:Qw極差最大，也就是說其對EE 的影響也最大，故在制備過程中要控制好因素Qa:Qw；而卵磷脂濃度、轉速、ρ(EPC):ρ(CHO)3者對EE 的影響相近，其中又以卵磷脂濃度影響最大，故制備過程中也應控制好卵磷脂濃度；溫度對EE的影響最小。所以PAE-LIP制備較好的因素水平搭配是A3B3C1D3E4。具體就是溫度為40℃，轉速為750 r.min-1，Qa:Qw=1:1，ρ(EPC):ρ(CHO)= 7.5:1，ρ(EPC)= 20 mg.mL-1。

通過正交試驗的極差分析，提升有機相中卵磷脂的濃度最有可能提高脂質體的EE(24.6%)，因此保持其他條件不變(溫度：40℃，轉速：750 r.min-1，Qa:Qw=1:1，ρ(EPC):ρ(CHO) =7.5:1)，設置卵磷脂的質量濃度分別為20、30、45、60、90、120、150 mg.mL-1，進行實驗，得到一個較高EE(41.6%)下卵磷脂的質量濃度為45 mg.mL-1。對吐溫20的最佳用量進行探究，以EE為考察指標，設計不同濃度梯度的吐溫20用量的實驗組，分別為(卵磷脂：表面活性劑)6:1、8:1、10:1、12:1、15:1。實驗結果如表3所示，當質量比m(EPC):m(表面活性劑)=10:1時，EE最高，為46.2%。對于乙醇注入法，如果包封材料溶于水相，EE 通常比較低[24]，本研究針對乙醇注入法，通過優(yōu)化實驗方案，得到的EE 處于較高水平。

電鏡下觀察PAE-ULIP混懸液的樣品，如圖1(a)、(b)所示，其分散良好，呈球形，結構完整；該脂質體具有明顯的磷脂雙分子層結構，如圖1(c)所示，為7～10 nm，與文獻[25]報道所測結果(～10 nm)一致。使用納米粒徑電位分析儀對PAE-ULIP的粒徑分布進行測量，平均粒徑為458.7 nm，PDI 為0.149，粒徑分布較為均勻。

表2 正交試驗結果Table 2 Resultsof theorthogonal test

表3 不同吐溫20的用量對包封率的影響Table 3 Effectsof Tween-20 ratios on encapsulation efficiency

圖1 脂質體的電鏡形貌Fig.1 Electron micrographs of liposomes

3.2 體外釋藥實驗結果

體外釋藥結果如圖2所示，PAE-ULIP凝膠、PAE 凝膠、PAE-LIP凝膠3者均在24 h 達到釋放平衡，其累計釋放率分別為61.8%、60.4%、52.1%，3者均具有一定的緩釋效果；在總體釋放特性上，PAE-ULIP凝膠與PAE 凝膠相似，PAE-LIP凝膠在整個釋藥過程內其釋藥量始終低于另外2者；柔性脂質體相比普通脂質體有一個更好的磷脂膜變形能力，更容易透過透析袋，導致PAE-ULIP凝膠0～2 h 釋藥速率快于PAE-LIP凝膠，其累計釋放率分別為22.1%、17.5%，有相對優(yōu)異的初始釋放速率；2 h 后PAE-ULIP凝膠釋放減緩，表現出更持久的緩釋效果。

圖2 PAE凝膠、PAE-LIP凝膠與PAE-ULIP 凝膠體外釋放曲線(0～36 h)Fig.2 In vitro release curves of PAEgel,PAE-LIP gel and PAE-ULIP gel(0～36 h)

圖3 PAE-LIP凝膠、PAE-ULIP凝膠與PAE凝膠Strat-M 膜透過實驗結果Fig.3 The Strat-M permeation results of PAE-LIP gel,PAE-ULIP gel and PAEgel

3.3 體外透皮實驗結果

PAE-LIP凝膠、PAE-ULIP凝膠與PAE凝膠單位面積累積釋放量隨時間變化曲線如圖3所示。其中所制備的PAE-ULIP凝膠表面光澤、細膩，放置48 h 無分層，其黏度為46.7 Pa·s，pH為6.5，根據《中華人民共和國藥典》2015版(第4部)及相關文獻[26-27]，黏度與pH均在優(yōu)良范圍內；可以看到，PAE凝膠幾乎很難透過Strat-M 膜，而PAE-ULIP凝膠能夠較好地透過Strat-M膜，且PAE-ULIP凝膠的透過性優(yōu)于PAE-LIP凝膠。24 h 的PAE-ULIP凝膠的單位面積累積釋放量為(690±38)μg.cm-2，PAE-LIP凝膠的單位面積累積釋放量為(550±36)μg.cm-2，PAE凝膠幾乎不能透過Strat-M 膜。表明柔性脂質體凝膠包載PAE 時，能夠在一定程度上增強藥物的皮膚透過性能。

3.4 PAE-ULIP 凝膠抗炎性能表征結果

對PAE-ULIP凝膠進行抗炎性能表征，并將結果同PAE 藥液的抗炎性能進行比較，所得結果如表4所示。未加藥物時，細胞上清液中的TNF-α 濃度為1 181.6 ng.mL-1，分別加入2種劑型的藥物后，細胞上清液中TNF-α 的濃度分別為667.7和862.6 ng.mL-1，炎癥因子的釋放均得到了抑制；加入LPS刺激后，細胞上清液中的TNF-α 濃度為1 529.3 ng.mL-1，分別加入2種劑型的藥物后，細胞上清液中TNF-α 的濃度分別為1 153.6和1 095.9 ng.mL-1，炎癥因子的釋放也得到了抑制。說明本研究中的PAE-ULIP凝膠劑型對PAE 的有效成分的抗炎活性沒有明顯影響，同樣具有抗炎活性。

表4 PAE對LPS刺激和未刺激RAW264.7細胞釋放細胞因子TNF-α 的影響Table 4 Effects of PAE on thereleaseof cytokine TNF-αfrom LPS-stimulated and unstimulated RAW264.7 cells

4 結 論

(1)通過乙醇注入法，以包封率為考察指標設計正交試驗，最終得到制備PAE-ULIP凝膠的優(yōu)選配方；所制備的PAE-ULIP包封率為46.2%，平均粒徑為458.7 nm。

(2)對于本研究的生物大分子藥物體系，通過Strat-M 的滲透與人體皮膚是十分相似。0～24 h 的實驗結果表明PAE凝膠幾乎不能透過該生物膜，但PAE-ULIP凝膠單位面積累積透過量達690μg.cm-2，有較好的皮膚透過性能；

(3)抗炎性能實驗表明，PAE-ULIP凝膠與PAE 藥液抗炎效果基本一致。