熊國順，張從鵬，謝佳成，解毅， 張堉 晨

（北方工業(yè)大學(xué)機械與材料工程學(xué)院，北京100144）

0 引 言

結(jié)核桿菌T細胞酶聯(lián)斑點（T-Spot）檢測具有靈敏度高、特異度高的優(yōu)點，是臨床結(jié)核病診斷的重要手段[1]。目前，對酶聯(lián)斑點的計數(shù)主要依靠人工方法，對臨床醫(yī)生的專業(yè)水平要求高，同時存在效率低、勞動強度大等不足。近年來，Corkidi G等[2]利用微生物菌落表面的光學(xué)特性，采用多級閾值方法實現(xiàn)對粘連及大小不均菌落的分離和計數(shù)；周螢莉等[3]提出用Otsu算法結(jié)合Hough變換提取目標區(qū)域，用距離變換和分水嶺算法分割菌落，對分割后的菌落篩選計數(shù)；司秀娟等[4]設(shè)計了基于Android平臺的菌落計數(shù)系統(tǒng)。張立新等[5]提出一種基于改進水平集的全自動菌落分割、計數(shù)方法。國內(nèi)外學(xué)者對在斑點自動識別計數(shù)方面取得了一定的研究成果[6-7]，但對T-Spot顯微圖像的自動計數(shù)研究較少，本文以開發(fā)細胞酶聯(lián)斑點自動檢測儀為目標，研究酶聯(lián)斑點自動識別計數(shù)技術(shù)，具有重要理論與現(xiàn)實意義。

1 系統(tǒng)描述

T-Spot顯微視覺平臺由運動控制系統(tǒng)和計算機顯微視覺系統(tǒng)組成[8]。實現(xiàn)對T-Spot的逐孔掃描采集和圖像處理，如圖1所示。選用500萬像素的UM012C型數(shù)碼顯微鏡，放大倍率為300倍；T-Spot標板選用標準的96孔酶標板。

2 目標區(qū)域提取

2.1 自動閾值分割

由于環(huán)形光源和標板小孔視野中心很難重合，存在非均勻照明現(xiàn)象，造成目標區(qū)域輪廓的圖像灰度不一致，無法通過單一閾值對圖像進行分割，如圖2(a)所示。本文采用自動閾值分割方法[9]，分割流程圖如圖3所示：通過判斷原圖像和參考圖像對應(yīng)點的像素差值是否大于局部閾值，來分割目標區(qū)域和背景區(qū)域。通過自動閾值算法分割效果如圖2 (b)所示。

圖1 顯微視覺平臺

圖2 分割對比圖

圖3 自動閾值分割流程圖

通過自動閾值分割，可以得到目標區(qū)域的大致輪廓，排除大部分背景像素干擾，為進一步邊緣輪廓提取打下基礎(chǔ)。

2.2 邊緣輪廓提取

如圖2(b)所示，粗分割后的圖像具有豐富的邊緣輪廓信息及邊緣干擾信息；酶標板單孔內(nèi)邊界為圖像的真實邊界，由于光照不均造成的投影邊界、附著在邊界的斑點及雜質(zhì)等均為干擾信息。邊緣輪廓提取的目的是排除干擾因素，獲取目標區(qū)域真實邊界，實現(xiàn)精確分割。首先對分割后的圖像進行連通域劃分，根據(jù)酶標板單孔面積及圓度特征初步提取出邊緣輪廓，如圖4(a)所示。

2.2.1 邊緣輪廓篩選

對邊緣輪廓進行篩選之前需要對“粗”輪廓邊緣進行光滑處理。通過對平滑算法的研究及實驗驗證，采用基于形態(tài)學(xué)的閉運算來平滑邊界區(qū)域[10]。通過閉運算光滑處理后區(qū)域邊緣輪廓線變得光滑，適合對邊緣輪廓進行篩選。對邊緣輪廓區(qū)域重新劃分連通域，觀察發(fā)現(xiàn)，新的連通域由圓弧和局部自封閉輪廓組成，通過限制矩形度選出所有的圓弧區(qū)域，篩選后的輪廓圖如4(b)所示。

2.2.2 邊緣擬合

針對常規(guī)最小二乘法擬合圓對于離群值魯棒性較差的問題，引入權(quán)重來減小離群值帶來的影響[11]。權(quán)值大小與輪廓點到擬合圓的距離成反比。

擬合圓的處理流程為：首輪計算時對參與計算的每個輪廓點賦予相同的權(quán)重，擬合出圓；計算輪廓點到擬合圓的距離，根據(jù)權(quán)重函數(shù)賦予每個點對應(yīng)的權(quán)值，擬合出更精確的圓；這樣，根據(jù)上一次擬合結(jié)果計算輪廓點到擬合圓的距離，通過權(quán)重函數(shù)賦予每個點新的權(quán)重，多次迭代可以得到理想的擬合結(jié)果[12]。擬合結(jié)果如圖5(a)所示，通過對擬合結(jié)果添加半徑約束得到最終擬合結(jié)果。

經(jīng)過邊緣擬合得到目標區(qū)域的精確邊緣輪廓，根據(jù)擬合結(jié)果的圓心坐標及半徑信息可以從原圖中準確分割出目標區(qū)域。

圖4 邊緣提取

3 識別計數(shù)

圖5 擬合結(jié)果

3.1 基于距離變換的分水嶺分割

分割后的目標區(qū)域如圖5(b)所示，部分斑點存在明顯的粘連現(xiàn)象，本文選用基于距離變換的分水嶺算法[13]對斑點圖像進行處理。算法分割流程如圖6所示。

3.2 計數(shù)

通過分水嶺算法分割目標，通常會存在過分割現(xiàn)象，在實際應(yīng)用中需要對算法進行優(yōu)化[14]。本文通過對距離變換前的圖像進行形態(tài)學(xué)處理，消除噪聲、鋸齒邊緣等干擾因素；對于分水嶺分割后的區(qū)域選取合適的面積閾值，過濾由偽局部極小值點造成的過分割區(qū)域。經(jīng)驗證，該方法能夠有效提高分割精度，抑制過分割現(xiàn)象，優(yōu)化后的分割效果圖如圖7(b)所示；對經(jīng)過篩選后的區(qū)域進行連通域劃分，通過計算連通域個數(shù)即可得到斑點個數(shù)。

4 實驗

通過如圖1所示顯微視覺平臺對標準的96孔酶標板進行圖像采集，共采集圖像384幅，分為128組，每組包含陽性對照孔、陰性對照孔、抗原孔圖片。利用本文設(shè)計的圖像處理程序?qū)Π唿c進行計數(shù)，根據(jù)酶標板廠家提供的標準對結(jié)果判讀。

判讀標準為[15]：若陰性對照孔斑點數(shù)為0～5，抗原孔斑點數(shù)減去陰性對照孔斑點數(shù)大于等于6，結(jié)果判定為陽性，小于6為陰性；若陰性對照孔斑點數(shù)大于等于6，抗原孔斑點數(shù)大于等于2倍陰性對照孔點數(shù)，結(jié)果判定為陽性，否則為陰性。實驗統(tǒng)計結(jié)果如表1所示。

實驗結(jié)果顯示：結(jié)核病檢驗測試的靈敏度為96.19%, 特異度為91.30%，假陽性率為3.81%，假陰性率為8.70%，綜合準確率為95.31%。對比美國FDA臨床研究數(shù)據(jù)[16]，T-SPOT.TB用于結(jié)核病的診斷特異度為97.1%，靈敏度為95.6%；本文算法在靈敏度方面與國外研究持平。

對于儀器檢驗結(jié)果，臨床醫(yī)生僅需對照放大圖像進行復(fù)核，即可出具診斷報告，從而大大降低了醫(yī)生的勞動強度，提高了檢驗效率。

圖6 識別計數(shù)流程圖

圖7 斑點識別計數(shù)

表1 本文算法實驗結(jié)果

5 結(jié) 論

本文針對酶聯(lián)斑點人工計數(shù)存在的問題，設(shè)計了一套基于圖像處理的酶聯(lián)斑點自動識別計數(shù)算法；通過自動閾值和精確擬合方法，實現(xiàn)了復(fù)雜背景下的目標區(qū)域圖像的準確提?。粚δ繕藚^(qū)域中粘連斑點實現(xiàn)有效分割，減少了過分割現(xiàn)象。實驗結(jié)果表明：采用本文算法對酶聯(lián)斑點自動識別計數(shù)并進行結(jié)果判讀，在陽性樣本識別方面表現(xiàn)良好，綜合準確率達到95.31%，可作為輔助醫(yī)師臨床檢驗的有效工具。