芮懷瑾，劉郁，白云，聶錦濤，潘晶晶，丁雪兒

（1.徐州工業(yè)職業(yè)技術學院化學工程學院，江蘇徐州221140；2.南京農(nóng)業(yè)大學江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京210095）

玉米須（Stigma maydis）是禾本科作物玉米的干燥花柱和柱頭，是我國傳統(tǒng)中藥材，具有利尿、消腫、降壓、止血等功效。玉米在我國各地均有種植，產(chǎn)量極高，2019年全國玉米產(chǎn)量達到26 077萬噸，其中玉米須占玉米產(chǎn)量的5%。玉米須中含有多種生物活性成分，如黃酮類、多糖類、氨基酸類、揮發(fā)性成分、有機酸、生物堿等，其藥用價值和保健功能較高[1]。Deng等發(fā)現(xiàn)，玉米須多糖可以有效降低高血脂癥小鼠體內(nèi)總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇的含量[2]；宋有洪等從玉米須的生物活性成分和藥理保健功能進行綜合論述，闡明玉米須應用前景廣闊，應加大其高附加值研發(fā)力度[3]。

牛蒡（Arctium lappa Linn）為菊科牛蒡屬植物，藥食同源，含有菊糖、綠原酸、咖啡酸、蘆丁、槲皮素、槲皮苷等多種功能性成分[4-5]，具有降血脂、降血糖、降血壓、消炎、防癌等功效[6-8]。已有部分研究者利用牛蒡的保健功能進行了產(chǎn)品研制，如牛蒡茶、牛蒡酸奶、牛蒡飲料等，并不斷有新的產(chǎn)品被開發(fā)研究，未來市場發(fā)展趨勢良好[9-11]。

植物復合飲料常會因果膠及蛋白質等大分子物質而出現(xiàn)渾濁、產(chǎn)生沉淀的現(xiàn)象。為解決這類問題，生產(chǎn)過程中一般添加果膠酶或纖維素酶進行過濾澄清處理，以改善飲料的穩(wěn)定性[12-13]。但這類游離酶制劑存在難回收、易失活、成本高的問題，而固定化酶因可以反復使用、穩(wěn)定性高逐漸受到關注[14-15]。

目前，對以玉米須和牛蒡為原料的產(chǎn)品研發(fā)類型較多，但將兩者復合研究尚屬空白，且原料浸提液的制備多以感官評價為指標，標準單一，沒有考慮兩者包含的生物活性成分的提取效果。有研究證明，玉米須和牛蒡含有大量黃酮，抗氧化活性較高，應用價值較高[16-17]。本試驗以玉米須和牛蒡為原料，以黃酮含量為浸提液制備條件選擇依據(jù)研制復合飲料。以殼聚糖固定化復合酶為澄清劑，研究其在玉米須牛蒡復合飲料中的澄清效果，評價其多次使用操作穩(wěn)定性。通過降低產(chǎn)品生產(chǎn)成本，加快玉米須和牛蒡加工產(chǎn)業(yè)鏈的升級，充分利用產(chǎn)量優(yōu)勢，推動農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛蒡干：市售；成熟玉米須：徐州市區(qū)菜場，清洗、晾干，粉碎，過40目篩。

維生素C、檸檬酸、白砂糖均為食品級：浙江一諾生物科技有限公司；果膠酶（酶活20 U/mg）、纖維素酶（酶活50 U/mg）、殼聚糖（分析純）、DPPH（分析純）、蘆丁標準品（純度≥98%）、葡萄糖標準品（純度≥98%）：美國Sigma公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇、硫酸、蒽酮等（均為分析純）：南京化學試劑有限公司。

FA1004電子天平：常熟市百靈天平儀器有限公司；JYL-C012九陽料理機：九陽股份有限公司；UV-7504紫外可見分光光度計：上海欣茂儀器有限公司；HH型恒溫水浴鍋：江蘇金壇鐘大儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 殼聚糖固定化復合酶的制備

參考頡向紅等的方法，并做適當修改[15，18]。取1 g殼聚糖溶解于100 mL 1%冰醋酸溶液中，攪拌均勻，用注射器滴入10%氫氧化鈉-乙醇溶液，加入少許5%戊二醛，得到殼聚糖微球。按復合酶（纖維素酶與果膠酶質量比為1∶2）∶殼聚糖質量比為1∶10的比例混合，在80 r/min轉速下振蕩1 h，4℃條件下固定6 h，用蒸餾水清洗過濾，即得到殼聚糖固定化復合酶。

1.2.2 黃酮含量的測定

參考方敏等的方法，并作適當修改[19]。準確稱取20 mg干燥至恒重的蘆丁標準品，用95%乙醇溶解，并定容到50 mL，充分混勻后得到0.4 mg/mL的蘆丁標準溶液。分別吸取 0.0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12.0 mL蘆丁標準溶液于50 mL容量瓶中，加入95%乙醇溶液12 mL，5%亞硝酸鈉溶液2 mL，混勻后靜置6 min，加入10%硝酸鋁溶液2 mL，混勻、靜置6 min，加入10%氫氧化鈉溶液20 mL，定容至50 mL。靜置15 min后，以空白試劑做參比，在510 nm波長處測定其吸光度。以吸光度為縱坐標，蘆丁標準溶液濃度為橫坐標繪制標準曲線。取適當量的樣液按上述方法操作，于510 nm波長處測定吸光度，計算樣液中黃酮含量。

1.2.3 多糖含量的測定

參考惠秋沙的方法，并作適當修改[20]。準確稱取100 mg干燥至恒重的葡萄糖標準品，蒸餾水溶解并定容至100 mL，充分混勻后得到1.00 mg/mL葡萄糖標準溶液。分別吸取 0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 葡萄糖標準溶液置于25 mL容量瓶中。加硫酸蒽酮溶液定容至刻度線。沸水浴15 min，冷卻后于625 nm波長處測定其吸光度。以吸光度為縱坐標，葡萄糖標準溶液濃度為橫坐標繪制標準曲線。

取適量玉米須復合飲料溶液，置離心管中3 000 r/min的轉速離心10 min，精密量取10 mL，加入無水乙醇40 mL，靜置過夜。抽濾，按順序加入無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌沉淀。將帶粗多糖的濾紙于烘箱中烘干后置于60 mL熱水中溶解趁熱抽濾。濾液用蒸餾水定容至100 mL，搖勻。按照測定標準曲線的方法操作測定625 nm波長處其吸光度，計算飲料中多糖含量。

1.2.4飲料工藝流程

1.2.5 主要工藝要點

1.2.5.1 玉米須浸提液的制備

1）單因素試驗

稱取粉碎后的玉米須10 g，以水做提取劑，按照1.2.2測定浸提液中黃酮的吸光度，以吸光度表示黃酮含量，并以其為指標，進行單因素試驗，考察的因素水平為料液比 1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60（g/mL），浸提時間 40、50、60、70、80 min，浸提溫度 50、60、70、80、90 ℃，pH 值 6、6.5、7、7.5、8。

2）正交試驗

通過單因素試驗獲得各因素水平，設計四因素三水平正交試驗確定玉米須浸提液最佳制備條件，因素水平設計見表1。

表1 玉米須浸提條件正交試驗因素水平表Table 1 Factor and level of orthogonal experiment of extracting conditions for corn silk

1.2.5.2 牛蒡浸提液的制備

1）單因素試驗

稱取粉碎后的牛蒡10 g，以水做提取劑，按照1.2.2測定浸提液中黃酮的吸光度，以吸光度表示黃酮含量，并以其為指標，進行單因素試驗，考察的因素水平為料液比 1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60（g/mL），浸提時間 30、40、50、60、70 min，浸提溫度 50、60、70、80、90 ℃，pH 值 6、6.5、7、7.5、8。

2）正交試驗

經(jīng)過單因素試驗獲得各因素水平，設計四因素三水平正交試驗確定牛蒡浸提液最佳制備條件，因素水平設計見表2。

1.2.5.3 飲料的配制

1）單因素試驗

以感官評分為指標，進行單因素試驗，考察牛蒡浸提液和玉米須浸提液體積比 2 ∶8、3 ∶7、4 ∶6、5 ∶5、6∶4，檸檬酸添加量 0.06%、0.08%、0.1%、0.12%、0.14%，白砂糖添加量 2%、4%、6%、8%、10%，殼聚糖固定化復合酶添加量0.4%、1.2%、2.0%、2.8%、3.6%對飲料感官品質的影響。

表2 牛蒡浸提條件正交試驗因素水平表Table 2 Factor and level of orthogonal experiment of extracting conditions for burdock

2）正交試驗

經(jīng)過單因素試驗獲得各因素水平，設計四因素三水平正交試驗玉米須牛蒡飲料的最佳配方，因素水平設計見表3。

表3 飲料工藝正交試驗因素水平表Table 3 Factor and level of orthogonal experiment of beverage processing

1.2.6 感官評定

參照寧楚潔等和徐輝對玉米須飲料和牛蒡飲料感官評價體系的建立，做適當修改[11，21]。選20名專業(yè)的感官鑒評人員（10男10女），鑒評人員利用其視覺、嗅覺、味覺逐一評價飲料的色澤、組織狀態(tài)、氣味、風味，進行綜合評分，并去掉最高值與最低值取其平均值。評分標準見表4。

表4 飲料感官評分標準Table 4 Standard of sensory evaluation of beverage

續(xù)表4 飲料感官評分標準Continue table 4 Standard of sensory evaluation of beverage

圖1 料液比、浸提時間、浸提溫度、pH值對玉米須浸提液黃酮含量的影響Fig.1 Effects of liquid-solid ratio，extraction time，extraction temperature，and pH value on flavonoids content in corn silk extract solution

1.2.7 飲料澄清度的測定

取最適添加量的殼聚糖固定化復合酶于復合飲料中，連續(xù)澄清操作，反復使用10次，每次使用后用蒸餾水反復清洗殼聚糖固定化復合酶，分別測定復合飲料在900 nm波長下的透光率，以此表示復合飲料的澄清度[14-15]。

1.2.8 統(tǒng)計分析

每個試驗均做3次。試驗數(shù)據(jù)利用Origin10.0系統(tǒng)計算方差，差異由Duncan’s多重比較法獲得，5%為顯著水平。

2 結果與分析

2.1 玉米須浸提液的制備條件

2.1.1 玉米須浸提液制備條件的單因素試驗

玉米須浸提液制備條件的單因素試驗結果見圖1。

玉米須浸提液中的黃酮含量在制備過程中受諸多因素影響。由圖1（A）可以看出，玉米須浸提液吸光度隨著料液比的變化而不斷提高。當料液比達到1∶50（g/mL）時吸光度最高，之后有所下降，但未形成顯著差異（P＞0.05），因此為節(jié)約提取劑用量，選擇最適料液比為 1 ∶50（g/mL）。由圖 1（B）可以看出，隨著浸提時間的延長，玉米須浸提液吸光度不斷升高。浸提時間為70 min時，吸光度浸提逐漸趨于平衡，浸提80 min時，吸光度未見顯著增加（P＞0.05），因此為節(jié)省工藝時間，選擇最適浸提時間為70 min。由圖1（C）可以看出，隨著浸提溫度的升高，玉米須浸提液吸光度逐漸升高，當溫度達到70℃后，吸光度無顯著變化（P＞0.05）。因此為減少能源消耗，選擇最適浸提溫度為70℃。由圖1（D）可以看出，浸提液pH值為7.0時吸光度顯著高于其他處理組（P＜0.05），pH值可能影響黃酮類化合物的極性，影響其在水中的溶解性，因此選擇最適浸提pH值為7.0。

2.1.2 玉米須浸提液制備條件的正交試驗結果

正交試驗結果見表5。

由表5可知，通過極差（R）結果分析4個因素影響玉米須浸提液吸光度的大小順序為：料液比＞pH值＞浸提時間＞浸提溫度。通過直觀分析得出玉米須浸提液最佳制備條件為A2B3C3D2，另外9組試驗中直接得到的最優(yōu)組合為A1B3C3D3。驗證試驗結果表明，A2B3C3D2工藝浸提液的吸光度為0.769，顯著高于A1B3C3D3的吸光度 0.718（P＜0.05），最終確定玉米須浸提液最佳制備條件為：料液比1∶50（g/mL），浸提時間80 min，浸提溫度80℃，pH 7.0。

表5 玉米須浸提條件正交試驗結果Table 5 Results of orthogonal experiment of extracting conditions for corn silk

2.2 牛蒡浸提液的制備條件

2.2.1 牛蒡浸提液制備條件的單因素試驗結果

牛蒡浸提液制備條件的單因素試驗結果見圖2。

圖2 料液比、浸提時間、浸提溫度、pH值對牛蒡浸提液黃酮含量的影響Fig.2 Effects of liquid-solid ratio，extraction time，extraction temperature，and pH value on flavonoids content in burdock extract solution

由圖2可以看出，在以水為提取劑進行牛蒡浸提液的制備過程中，料液比對吸光度影響較大，料液比為1∶40（g/mL）時浸提液吸光度顯著高于其他處理組（P＜0.05），故選擇最適料液比為 1 ∶40（g/mL）。隨著牛蒡浸提時間的延長，吸光度不斷升高，當浸提時間到達60 min后，牛蒡黃酮浸提逐漸趨于平衡，與浸提70 min的吸光度未見顯著差異（P＞0.05）。與玉米須黃酮類似，牛蒡黃酮類化合物均為生物活性物質，高溫條件下浸提時間過長容易導致活性降低，同時為節(jié)約工藝時間，故選擇最適浸提時間為60 min。隨著浸提溫度的升高，浸提液吸光度逐漸升高，當溫度到達70℃后，黃酮浸提效果未見顯著提高（P＞0.05），當溫度升高至90℃后，黃酮類化合物可能由于失活、分解，吸光度下降，故選擇最適浸提溫度為70℃。浸提液pH值對牛蒡中黃酮的浸提效果影響幅度變化較大，這可能與玉米須浸提液pH值的影響原理一樣，即浸提液的pH值影響黃酮的極性。當浸提液pH值為7.0時，吸光度最高，故選擇最適pH值為7.0。

2.2.2 牛蒡浸提液制備條件的正交試驗結果

正交試驗結果見表6。

由表6可以看出，通過極差（R）結果分析影響牛蒡浸提液的吸光度大小順序為：料液比＞浸提時間＞pH值＞浸提溫度。9組試驗中直接找出的最優(yōu)制備條件組合為試驗號9，即A3B3C2D1，而直觀分析得出的最佳制備條件為A3B3C1D1。驗證試驗結果表明，直觀分析的最佳組合A3B3C1D1得到的牛蒡浸提液的吸光度為0.782，A3B3C2D1的吸光度為0.709，兩者形成顯著差異（P＜0.05）。因此，牛蒡浸提液最佳制備條件為：料液比1 ∶50（g/mL），浸提時間 70 min，浸提溫度 60 ℃，pH 6.5。

表6 牛蒡浸提條件正交試驗結果Table 6 Results of orthogonal experiment of extracting conditions for burdock

2.3 玉米須牛蒡復合飲料的制備工藝

2.3.1 玉米須牛蒡復合飲料制備工藝的單因素試驗結果

玉米須牛蒡復合飲料制備工藝的單因素試驗結果見圖3。因殼聚糖固定化復合酶對飲料感官品質的影響不顯著，本文未分析該因素的影響結果。

圖3 牛蒡浸提液和玉米須浸提液體積比、檸檬酸添加量、白砂糖添加量對飲料感官品質的影響Fig.3 Effects of compound of juice of burdock and corn silk，citric acid amount and sugar amount on sensory quality of beverage

由圖3（A）可知，牛蒡浸提液和玉米須浸提液體積比對飲料感官評分的影響隨著體積比的變化而改變。體積比為2∶8時，玉米須味道過重，顏色較淺；體積比為6∶4時，牛蒡味過重，味道較苦，顏色過深，風味均不佳，感官評分低，都不受歡迎。體積比為4∶6時，牛蒡與玉米須的味道和諧，色澤鮮亮，感官評分顯著高于其他處理組（P＜0.05），故選擇最適牛蒡浸提液和玉米須浸提液體積比為 4 ∶6。由圖 3（B）、（C）可知，檸檬酸和白砂糖的添加量不適當使得飲料的糖酸比不佳，會影響飲料風味，即味道過淡、過甜或過酸，均不受歡迎，感官評分較低。檸檬酸添加量0.10%的感官評分顯著高于其他處理組（P＜0.05），白砂糖添加量8%的感官評分顯著高于其他處理組（P＜0.05），故選擇最適檸檬酸添加量為0.10%，最適白砂糖添加量為8%。

2.3.2 玉米須牛蒡復合飲料制備工藝的正交試驗結果正交試驗結果見表7。

表7 飲料工藝正交試驗結果Table 7 Results of orthogonal experiment of beverage processing

由表7可知，通過極差（R）結果判斷出影響飲料感官品質的大小順序為：牛蒡浸提液和玉米須浸提液體積比＞檸檬酸添加量＞白砂糖添加量＞殼聚糖固定化復合酶添加量。其中復合酶作為改善加工工藝、提高產(chǎn)品澄清度進行使用，不能影響產(chǎn)品風味，該特點通過極差結果得到證明。通過直觀分析得出復合飲料的最佳制備工藝為A1B2C2D2或A1B2C2D3，與9組試驗中直接找出的最優(yōu)組合試驗號2，即A1B2C2D2重合。因此，確定玉米須牛蒡復合飲料的最佳制備工藝為：牛蒡浸提液和玉米須浸提液體積比3∶7，檸檬酸添加量0.10%，白砂糖添加量8%，殼聚糖固定化復合酶添加量2.8%。

2.4 主要功能性成分含量測定

2.4.1 飲料黃酮含量的測定結果

蘆丁標準曲線見圖4。

圖4 蘆丁標準曲線Fig.4 Standard curve of rutin standard

如圖4所示，蘆丁標準曲線的線性回歸方程為y=0.009 5x+0.000 1，R2=0.999 5。將最佳制備工藝得到的復合飲料中黃酮吸光度帶入方程，計算得到飲料中黃酮含量為0.306 mg/mL。

2.4.2 飲料多糖含量的測定結果

葡萄糖標準曲線見圖5。

圖5 葡萄糖標準曲線Fig.5 Standard curve of glucose standard

如圖5所示，葡萄糖標準曲線的線性回歸方程為y=0.050 2x-0.003 2，R2=0.999 5。將最佳制備工藝得到的復合飲料中多糖吸光度帶入方程，計算得到飲料中多糖含量為0.661 mg/mL。

2.5 飲料澄清度的測定結果

最佳制備工藝得到的飲料在不同澄清次數(shù)下的透光率，結果見圖6。

圖6 殼聚糖固定化復合酶澄清玉米須牛蒡復合飲料的操作穩(wěn)定性Fig.6 Stability of chitosan immobilized complex enzyme on clarification of corn silk and burdock compound beverage

隨著澄清次數(shù)的增加，透光率逐漸下降，該結果與林建城和秦珂等結果類似，酶反復作用于不同原料，可能均會因為酶本身部分失活或回收損失使得澄清效果降低[14，22]。澄清操作8次后，透光率下降至78.3%，肉眼觀察無明顯變化，外觀可接受，說明固定化酶具有較好的操作穩(wěn)定性，若應用于生產(chǎn)實踐，可直接降低飲料生產(chǎn)成本。

3 結論

通過單因素試驗和正交試驗，以吸光度表示黃酮含量，并以其為指標，確定了以水為提取劑的玉米須浸提液和牛蒡浸提液的最佳制備條件。玉米須浸提液最佳制備條件為料液比1∶50（g/mL），浸提時間80 min，浸提溫度80℃，pH 7.0；牛蒡浸提液最佳制備條件為料液比 1∶50（g/mL），浸提時間 70 min，浸提溫度60℃，pH 6.5。同樣利用單因素試驗和正交試驗，以感官評分為指標，確定了玉米須牛蒡復合飲料的最佳工藝配方，即牛蒡浸提液和玉米須浸提液體積比3∶7，檸檬酸添加量0.10%，白砂糖添加量8%，殼聚糖固定化復合酶添加量2.8%，對復合飲料的感官品質的影響順序為牛蒡浸提液和玉米須浸提液體積比＞檸檬酸添加量＞白砂糖添加量＞殼聚糖固定化復合酶添加量。最佳工藝條件下得到的復合飲料中的黃酮含量為0.306 mg/mL，多糖含量為0.661 mg/mL。殼聚糖固定化復合酶對飲料感官品質無顯著影響，并起到較好的澄清效果，且可以反復使用，操作穩(wěn)定性較好，在實際生產(chǎn)過程中可降低飲料加工成本，具有較好的應用前景。