張釧，郝勝菊，張慶華，周秉博，陳雪，馮暄，劉芙蓉，王曉黎，李富萍，劉亞利，劉青，馬旭，曹宗富*

(1.國家衛(wèi)生健康委科學技術研究所，北京 100081；2.北京協(xié)和醫(yī)學院研究生院，北京 100730；3.甘肅省婦幼保健院醫(yī)學遺傳學中心，蘭州 730050)

子宮內膜癌是婦科三大惡性腫瘤之一，約占女性全身惡性腫瘤的7%[1]。子宮內膜癌病死率較高，據(jù)統(tǒng)計，2015年，中國的子宮內膜癌新發(fā)病例約63 400例，死亡病例21 800例，死亡率約為34.4%[2]；2017年，美國的子宮內膜癌新發(fā)病例為63 230例，死亡11 350例，死亡率達到18.0%[3]。2013年，美國癌癥基因組計劃提出通過分子特征來對子宮內膜癌進行分型，并將子宮內膜癌分為POLE超突變組、微衛(wèi)星不穩(wěn)定高突變組、低拷貝數(shù)變異組及高拷貝數(shù)變異組。同年，Nature雜志發(fā)表研究報道稱通過基因拷貝數(shù)變異(CNV)對子宮內膜癌進行重新分級，可能會影響患者的術后輔助治療方案及療效，從而為子宮內膜癌患者提供個體化的治療提供依據(jù)[4]。

目前國內外關于子宮內膜癌的基因拷貝數(shù)變異研究仍然較少，本研究中我們對10例子宮內膜癌患者的癌組織及其癌旁組織進行拷貝數(shù)變異分析，以分析子宮內膜癌的拷貝數(shù)變異特點，為給患者提供個體化診療方案提供基礎。

資料與方法

一、研究對象

收集2018年8月至2019年7月在甘肅省婦幼保健院確診的10例子宮內膜樣腺癌I期患者的癌組織與癌旁組織進行研究，患者平均年齡(54.3±6.72)歲，組織大小為0.5 cm×0.5 cm。排除其他腫瘤及疾病。所有患者均簽署了知情同意書，本研究經(jīng)甘肅省婦幼保健院倫理委員會批準，批準號：[2016]院倫審研第(4)號。

二、研究方法

1.基因組DNA提?。翰±砬衅?，經(jīng)HE染色(圖1)排除污染的組織進行DNA提取。應用北京天根公司(中國)生產的石蠟包埋組織基因組DNA提取試劑盒，按照試劑盒說明書進行。使用Nanodrop 2 000核酸定量儀(Thermo Scientific，美國)測定DNA純度和濃度，OD260/OD280在1.8～2.0之間及DNA濃度>50 ng/μl為初篩合格的DNA樣本。使用TE緩沖液將DNA濃度調整至50 ng/μl左右，-20℃保存。

A：癌組織 ×40；B癌旁組織 ×10圖1 子宮內膜癌患者癌組織與癌旁組織HE染色

2.基因芯片檢測：全基因組DNA拷貝數(shù)分析采用昂飛公司(Thermo Scientific，美國)的750 K基因芯片，該芯片包含550 000個檢測拷貝數(shù)的探針位點及200 000個單核苷酸多態(tài)性(SNP)探針位點。除可以進行拷貝數(shù)檢測外，還可以對雜合性缺失(LOH)和單親二倍體(UPD)進行分析。實驗操作按照文獻報道的AffymetrixCytoScanTMAssay 的操作流程進行[5]。主要操作步驟為：初篩合格的基因組DNA經(jīng)消化和連接后進行PCR擴增，產物進行2%瓊脂糖膠電泳檢測，5 V/cm 進行 45 min，將主要條帶在150～2 000 bp的PCR產物使用磁珠法進行純化，Nanodrop 2000核酸定量儀測定純化后的PCR產物濃度，最后產物的濃度≥3.0 μg/μl，產物OD260/OD280在1.8～2.0之間為二次篩選合格的DNA樣本；然后將二次篩選合格的DNA樣本進行片段化，片段化后的產物經(jīng)2%瓊脂糖膠電泳檢測，5 V/cm 進行 45 min，片段分布在25～125 bp之間的產物經(jīng)Labeling 試劑標記后進行芯片雜交，雜交條件為50℃，60 轉/min，16～18 h；芯片雜交好以后分別經(jīng)過500 μl Stain Buffer 1、500 μl Stain Buffer 2 及800 μl Array Holding Buffer洗滌后進行數(shù)據(jù)掃描。

3.數(shù)據(jù)分析：通過ChAS軟件(美國)對芯片掃描數(shù)據(jù)進行分析。當被檢測數(shù)據(jù)的質量控制(Quality Control，QC)數(shù)據(jù)SNP-QC≥15.0、絕對對差中值(MAPD)≤0.25及Waviness-SD≤0.12時，說明被檢測數(shù)據(jù)的質量高。MAPD表示相對于log2值的探針之間的距離。SNP-QC代表各個探針聚集的基因型簇之間的分離程度。Waviness-SD代表探針組之間的差異。這些質量控制指標可以評估SNP芯片檢測數(shù)據(jù)的整體質量。根據(jù)人類基因組版本GRCh37(hg19)注釋對微陣列數(shù)據(jù)進行解釋。選擇符合QC標準并CNV片段超過100 Kb和出現(xiàn)至少10個連續(xù)異常探針的區(qū)域進行進一步分析。根據(jù)log2值來判斷拷貝數(shù)狀態(tài)(copy state，CN)，CN=2為正常，CN=3為重復(duplication，dup)，CN=1為缺失(deletion，del)，當CN介于1～2或者2～3之間時代表存在嵌合缺失或者重復，根據(jù)CN的值來判斷缺失或重復在癌組織標本中的比例。將檢測出的CNV在DGV(http：//dgv.tcag.ca/dgv/app/home)、Decipher (https：//decipher.sanger. ac.uk/browser)、ClinVar (https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)中進行對比，以排除健康人群中的多態(tài)性變異。

結 果

一、標本數(shù)據(jù)質量檢測

10例患者癌組織及癌旁組織標本的CNV均檢測成功，SNP-QC≥15.0、MAPD≤0.25及Waviness-SD≤0.12(圖2)。

圖2 ChAS軟件分析樣本質量

二、10例子宮內膜癌患者癌組織與癌旁組織樣本CNV分析

10例癌組織標本中，經(jīng)過ChAS軟件分析，有6例檢測到了CNVs，其中5例患者癌組織標本僅檢測到重復或嵌合重復，例如：8號患者癌組織標本中1號染色體長臂存在重復，8號染色體存在嵌合重復(圖3)，1例患者中既檢測到了重復或嵌合重復也檢測到了缺失及嵌合缺失。在10例癌旁組織中均未檢測到100 Kb以上CNVs(表1)。

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藍色框表示1號染色體長臂存在重復；紅色箭頭所指為8號染色體存在嵌合重復。圖3 ChAS軟件分析8號患者癌組織中的CNVs

在癌組織中，CNVs范圍為10～146 Mb，平均為(75.35±40.00) Mb，分布在1、4、6、8、10、13、14、16、17、19、22號染色體上，其中，1q21.1q44 dup 103 Mb及8p23.3q24.3 dup 146 Mb出現(xiàn)了2次；在6例患者的癌組織標本中共檢測到20種CNVs，缺失及嵌合缺失有9種，重復及嵌合重復有11種；Decipher及ClinVar數(shù)據(jù)庫分析這些CNVs的致病性，結果表明有9種CNYs是致病的，其余11種為可能致病(表2)。

表1 10例子宮內膜癌患者癌組織與癌旁組織的CNVs檢出情況

表2 子宮內膜癌組織CNV類型及致病性

討 論

本研究對10例子宮內膜癌患者的癌組織及癌旁組織標本進行了CNV檢測分析。有6例癌組織標本檢測到了CNVs，檢出率為60%，其中，除1例癌組織標本僅檢測到1種CNV外，其他5例均檢測到2種以上CNVs。10例癌旁組織均未檢測到CNVs。本研究的癌癥組織樣本中共發(fā)現(xiàn)20種CNVs，主要集中在8號和10號染色體上，分別占20%(4/20)與25%(5/20)，其中，1q21.1q44 dup 103 Mb與8p23.3q24.3 dup 146 Mb比例較高，均出現(xiàn)2次。

我們對本研究中發(fā)現(xiàn)的20種 CNVs進行了致病性分析，發(fā)現(xiàn)其中11種為可能致病性變異，9種為致病性變異。Decipher及ClinVar數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)報道的與這些CNVs片段長度相似的臨床表型多為一些綜合征表型，包括耳廓異常、先天性小頭畸形、瞼裂下垂、嘴角下傾等特殊面容；腎上腺發(fā)育不全、異位肛門、嬰兒進食困難及先天性心臟病、全面發(fā)育遲緩等。但是關于這些CNVs與子宮內膜癌的發(fā)生發(fā)展及治療預后情況卻未見相關收錄信息。

2011年，Karageorgi等[6]研究發(fā)現(xiàn)：谷胱甘肽巰基轉移酶-T1(GST-T1)基因拷貝數(shù)變異可能會使子宮內膜癌的患病風險增加。2013年，Nature雜志報道稱：子宮內膜癌的特色基因包括低拷貝數(shù)基因和高拷貝數(shù)基因，它們可能會影響子宮內膜癌患者的術后輔助治療，可根據(jù)子宮內膜癌的基因組特征對其進行重新分類；并且建議臨床醫(yī)師對存在有CNVs的子宮內膜癌患者應考慮使用化療而不是輔助放療[4]。Moir-Meyer等[7]發(fā)現(xiàn)子宮內膜癌組織中存在罕見的種系缺失CNVs，這些CNVs分布于功能基因、CpG島與sno/miRNAs區(qū)域，并對這些區(qū)域進行破壞，例如：病例組與對照組的sno/miRNA區(qū)域被這種罕見CNVs缺失造成的破壞比例高達30∶1。如果被罕見CNVs缺失破壞的區(qū)域還包括DNA修復基因，則可導致DNA修復基因調節(jié)異常而發(fā)生腫瘤[7]。當然，個別基因的缺失及失活也與子宮內膜癌的發(fā)生及預后相關，如ZFHX3基因失活或缺失不僅會影響子宮內膜癌的發(fā)生，還會影響患者的預后[8]。

子宮內膜癌組織的CNVs存在種族差異，有研究發(fā)現(xiàn)，尼格羅人攜帶高CNVs的比例顯著高于高加索人(P<0.05)，與攜帶高CNVs的高加索人比較，攜帶高CNVs的尼格羅人的子宮內膜癌的無進展生存率較差[9]。因此，通過對子宮內膜癌組織CNVs數(shù)據(jù)的深入探索及綜合分析，可以獲取更多相關的生物學信息，從而更好地了解其進展規(guī)律及惡化機制，為今后子宮內膜癌的防治及個體化治療打下基礎[10]。但目前國內外關于這方面的研究報道較少。

本研究的10例子宮內膜癌樣本中，有6例樣本檢出了CNVs，分布在1、4、6、8、10、13、14、16、17、19、22號染色體上，主要集中在8號和10號染色體。共發(fā)現(xiàn)20種CNVs，其中重復及嵌合重復有11種，占55%，缺失及嵌合缺失有9種，占45%，這說明子宮內膜癌的細胞分子特性存在一定異質性，并不是所有癌細胞均存在CNVs，這與以外文獻報道一致[11-14]。分子診斷可以對組織病理學進行補充，為一些疑難病例提供更精確的診斷，但應用到臨床實踐中的仍然較少[15]。在今后的子宮內膜癌的治療中，是否可以根據(jù)癌組織的CNVs及嵌合情況來對患者進行更加精準的治療，還需進一步研究。

本研究僅分析了10例子宮內膜癌患者的癌組織與癌旁組織的CNVs情況，由于標本量有限，尚不能完全說明子宮內膜癌組織的CNVs對該疾病治療及預后的價值。雖然有一定缺陷，但本研究發(fā)現(xiàn)這些CNVs主要集中在8號和10號染色體上，這可能對今后子宮內膜癌的個體化治療有一定的意義。今后我們將繼續(xù)擴大樣本量進行研究，并隨訪患者生存及預后情況，以揭示檢測子宮內膜癌組織CNVs對患者進行精準治療的價值。