王家雄，劉彩釗，韓慕天，邢時雨，沈麗燕，馬勇，李紅，楊慎敏

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院生殖與遺傳中心，蘇州 215002)

男性不育一直困擾著許多育齡家庭，臨床上對男性生育力的檢測指標(biāo)多種多樣，但諸多指標(biāo)仍然存在不確定性[1]。目前臨床上最常見的評價精液質(zhì)量的參數(shù)是精子濃度分析、精子活動力分析與精子形態(tài)分析等。進(jìn)行精子濃度與活動力分析時，無論是采用計算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)(CASA)還是人工計數(shù)，都無法看到一份精液中精子的全貌；同理，精子形態(tài)觀察時亦只能取部分視野觀察幾百條精子，雖然可以有效體現(xiàn)精子特異性畸形，但也難以概括精子的全貌。流式細(xì)胞術(shù)由于其高通量和重復(fù)性好的優(yōu)勢，可以在短時間內(nèi)分析成千上萬個細(xì)胞，配合特異抗體時還可以捕獲每個細(xì)胞的多方面特征，因此流式細(xì)胞術(shù)在精液質(zhì)量分析中的應(yīng)用越來越廣泛[2]；且流式細(xì)胞術(shù)可以在單一細(xì)胞水平進(jìn)行分析，可以克服目前大多數(shù)技術(shù)僅提供整體精液平均值的弊端，但是流式細(xì)胞術(shù)的檢測價格不菲[3]，增大了醫(yī)療成本。

目前，流式細(xì)胞術(shù)在男科臨床檢驗(yàn)中主要用于檢測精子DNA碎片[4]、頂體反應(yīng)[5]、線粒體狀態(tài)[6]、凋亡標(biāo)志物[7]、活性氧[8]等。精液內(nèi)不僅有精子，還有不成熟的生精細(xì)胞、各類圓細(xì)胞以及細(xì)胞碎片等，它們與精子的大小存在明顯差異。受到臨床血液學(xué)檢測中紅細(xì)胞分布寬度(RDW)用于貧血鑒別診斷[9]的啟發(fā)，這個思路是否可以用于精子質(zhì)量的判斷？即精液內(nèi)細(xì)胞直徑大小異質(zhì)性越大，精子質(zhì)量越差。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)分析患者精液內(nèi)細(xì)胞大小的異質(zhì)性與精子濃度、活動力、形態(tài)及DNA碎片等質(zhì)量參數(shù)之間的關(guān)系，試圖引入一個新的、簡便高效的精子質(zhì)量參數(shù)指標(biāo)，并探究其作為一個檢驗(yàn)參數(shù)，對精子質(zhì)量是否存在一定的預(yù)測價值。

資料與方法

一、研究對象

收集2019年3～4月在本中心行精液檢查的男性不育患者的241例精液樣本。精液采集方式為：要求患者禁欲2～7 d，手淫方式取精。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者染色體正常，無遺傳性疾病家族史，近期無泌尿生殖系統(tǒng)感染史，無慢性代謝性疾病。排除精液體積過小(<1 ml)、精液pH異常、精子凝集異常、精液中出現(xiàn)大量圓細(xì)胞的樣本。

二、研究方法

1.精液常規(guī)分析：精液取出后置于37℃溫箱進(jìn)行保存，待精液完全液化后，采用CASA系統(tǒng)(上海北昂醫(yī)藥科技)進(jìn)行精液常規(guī)分析，記錄精子濃度、活動精子百分率、前向運(yùn)動精子百分率等。

2.精子形態(tài)分析：按照《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊》第5版(WHO手冊第5版)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行精子濕片制備，采用改良巴氏染色液(南京欣迪生物)進(jìn)行精子涂片染色后，使用1 000倍光學(xué)顯微鏡對精子涂片進(jìn)行觀察，并兩兩比對，記錄精子頭部異常、中段異常、主段異常和正常形態(tài)精子百分率。

3.精子DNA碎片檢測：采用精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析實(shí)驗(yàn)(sperm chromatin structure assay，SCSA)檢測精子DNA完整性。先使用染色試劑盒(浙江星博生物)對精子進(jìn)行吖啶橙染色，熒光信號通過Navios流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter，美國)進(jìn)行分析；流式分析的結(jié)果通過DFI Viewer軟件進(jìn)行處理，最終得出DNA碎片指數(shù)(DNA fragment index，DFI)和高DNA著色性(high DNA stainability，HDS)數(shù)據(jù)。

4.流式細(xì)胞檢測精液內(nèi)細(xì)胞大小異質(zhì)性：采用Navios流式細(xì)胞儀檢測精子DNA碎片的同時，記錄前向散射光(forward scatter，F(xiàn)SC)通道反應(yīng)的精液中細(xì)胞大小的整體變異系數(shù)(Coefficient of variation，CV)。在流式細(xì)胞檢測中CV值表示的是檢測數(shù)據(jù)的分布情況，分布的越散，CV越大；數(shù)值越集中，CV越小。在流式圖形中峰看起來越寬，相對應(yīng)的CV值也比較大，說明檢測的細(xì)胞大小差異大；反之，CV就很小。并通過流式細(xì)胞儀FSC通道的正態(tài)分布圖設(shè)門B、C、D區(qū)，分別對應(yīng)大細(xì)胞區(qū)(大頭精子、膨脹凋亡精子、紅細(xì)胞、白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、生精細(xì)胞)、普通細(xì)胞區(qū)(形態(tài)正常精子)與小細(xì)胞區(qū)(圓形精子等形態(tài)異常精子、細(xì)胞碎片)，記錄C區(qū)內(nèi)部CV值。

5.CV值預(yù)測精子質(zhì)量評價：參考WHO手冊第5版活動精子百分率(40%)、前向運(yùn)動精子百分率(32%)以及正常形態(tài)精子百分率(4%)的正常參考值繪制受試者工作特征曲線(ROC曲線)，用整體CV值評價活動精子百分率、前向運(yùn)動精子百分率以及正常形態(tài)精子百分率這3個參數(shù)是否正常，進(jìn)而評估整體CV值預(yù)測精子質(zhì)量的可靠性。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般資料

所納入患者年齡24～55歲，平均年齡(31.9±5.0)歲。納入樣本的精液參數(shù)情況見表1。如圖1所示，F(xiàn)SC通道圖上從左到右是細(xì)胞大小遞增，圖像越是呈正態(tài)分布(圖1A)，精液中雜細(xì)胞越少，精子大小越趨于一致且正常(圖1C)；反之流式圖像越不規(guī)則(圖1B)，光鏡下精子畸形越嚴(yán)重，且出現(xiàn)不成熟的生精細(xì)胞以及細(xì)胞碎片(圖1D)。

表1 精液質(zhì)量參數(shù)與精液細(xì)胞異質(zhì)性參數(shù)(-±s)

A：正態(tài)分布的流式圖，按細(xì)胞大小分B、C、D三區(qū)；B：異常分布的流式圖；C：正態(tài)分布的流式圖對應(yīng)的精子形態(tài)正常、大小均一；D：異常分布的流式圖對應(yīng)的精子畸形多、精液內(nèi)細(xì)胞碎片多圖1 精液細(xì)胞大小異質(zhì)性與對應(yīng)精子形態(tài)圖片

二、精子大小異質(zhì)性參數(shù)與精液質(zhì)量相關(guān)性

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，精液內(nèi)所有細(xì)胞分布的異質(zhì)性(總CV值)以及多數(shù)精子分布的異質(zhì)性(C區(qū)CV值)與精子濃度、活動精子百分率、前向運(yùn)動精子百分率、正常形態(tài)精子百分率均呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，而與DFI、HDS呈顯著正相關(guān)(P<0.01)(表2)，提示精液內(nèi)細(xì)胞以及精子大小均一性越好，精子質(zhì)量越好。

B區(qū)細(xì)胞所占百分率與精子濃度、頭部畸形精子百分率和DFI呈顯著正相關(guān)(P<0.01)，與正常形態(tài)精子百分率呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)(表2)；B區(qū)為小細(xì)胞區(qū)，精子如果多數(shù)處于該區(qū)，即提示精子頭部異常變多，從而影響精子質(zhì)量。

C區(qū)細(xì)胞所占百分率與精子濃度、活動精子百分率、前向運(yùn)動精子百分率、正常形態(tài)精子百分率均呈顯著正相關(guān)(P<0.01)，而與DFI、HDS呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)(表2)，提示精子大小越是集中在均值左右，精子質(zhì)量越好。

D區(qū)細(xì)胞所占百分率與DFI、HDS呈顯著正相關(guān)(P<0.01)，與精子濃度、活動精子百分率、前向運(yùn)動精子百分率、正常形態(tài)精子百分率呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)(表2)；D區(qū)為大細(xì)胞區(qū)，細(xì)胞如果多數(shù)集中在該區(qū)，即精液中大細(xì)胞多，提示可能存在精子頭部膨脹、凋亡，圓細(xì)胞數(shù)量增多等情況，精子濃度、降低精子質(zhì)量降低。

表2 精液細(xì)胞大小異質(zhì)性參數(shù)與精液質(zhì)量相關(guān)性

三、精子大小異質(zhì)性參數(shù)作為衡量精液質(zhì)量指標(biāo)的可行性

參考WHO手冊第5版中活動精子百分率(40%)、前向運(yùn)動精子百分率(32%)以及正常形態(tài)精子百分率(4%)的正常參考值，采用整體CV值判斷這3個參數(shù)的ROC曲線如圖2。3個ROC曲線的曲線下面積分別為0.723、0.713、0.607，表明整體CV值對這3個參數(shù)有一定的預(yù)測價值，預(yù)測效果適中。

A：活動精子百分率；B：前向運(yùn)動精子百分率；C：正常形態(tài)精子百分率圖2 整體CV值評價活動精子百分率、前向運(yùn)動精子百分率和正常形態(tài)精子百分率的ROC曲線

討 論

精子質(zhì)量評估是目前臨床評價男性生育力最直觀的手段，常用的指標(biāo)有精子濃度、精子活動力、精子形態(tài)及精子DNA碎片。近年來，評估精子質(zhì)量的指標(biāo)層出不窮，然而由于受孕過程的多因素性，沒有一個單一的指標(biāo)可以完全預(yù)測男性生育力[10]。精子濃度、精子活力等指標(biāo)，雖然提供了有價值的定量數(shù)據(jù)，但不能提供精子具體功能等信息，如精子穿透透明帶的能力等[11]。精子形態(tài)分析雖然多年來一直被沿用，也有一定的指導(dǎo)價值，但是許多精子畸形并不是病理性的，而是生理性的，因此除了針對某些特定的精子缺陷，尤其是遺傳病因?qū)е碌木踊?圓頭精子、大頭多尾畸形、無頭精子和精子鞭毛多發(fā)性形態(tài)異常等)外，精子形態(tài)學(xué)評估對男性不育癥診斷的敏感性和特異性都較差[12]。而且上述方法都存在低通量、低效率以及容易受主觀影響的缺點(diǎn)。隨著流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展，精子DNA碎片檢測逐漸普遍。檢測精子DNA碎片的方法有許多種，臨床最常用的是精子染色體擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)(sperm chromatin dispersion，SCD)[13]和SCSA法[14]，其中SCSA由于其高通量、高準(zhǔn)確性而被廣泛使用。本課題組的前期研究也證明了精子DNA碎片對精子質(zhì)量均有較好的預(yù)測價值[15]。雖然國內(nèi)外關(guān)于精子DNA完整性用于預(yù)測男性精子受精能力的研究越來越多，但其臨床效用尚待確定[16]，有待于完善實(shí)驗(yàn)設(shè)計的前瞻性研究加以探討。

臨床上采用SCSA檢測DFI是通過吖啶橙染色，借助流式細(xì)胞儀檢測熒光信號后計算結(jié)果。流式細(xì)胞儀可以同時給出很多信號，特定的熒光信號只是其中之一。FSC信號可以反映細(xì)胞的相對大小，但是想要直接測量細(xì)胞體積大小是不可靠的。有研究者曾試圖通過數(shù)學(xué)算法將FSC信號用于分析精子形態(tài)學(xué)變化，但是將這些數(shù)據(jù)外推到真正的精子形態(tài)學(xué)上是比較困難的[17]。盡管我們無法給出每一個精子精確的大小數(shù)據(jù)，但是通過FSC通道的圖像仍然可以看出精子大小分布的情況，從本研究結(jié)果看，整體CV值越小，精子大小分布越趨近，分布寬度越小，精子質(zhì)量越好；反之，精子大小均一性越差，精子質(zhì)量越低。流式細(xì)胞儀檢測的精子大小主要為精子頭部大小，巴氏染色的正常精子頭部長度中位數(shù)一般為4.1 μm，寬度中位數(shù)一般為2.8 μm[18]，頭部過大或過小提示精子可能伴隨著各種類型的畸形。有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)一份精液中存在高百分比的小頭精子時，患者輔助生殖的受精率降低且胚胎結(jié)局差[19]。部分小頭精子還可能提示患者存在某種遺傳缺陷，有研究發(fā)現(xiàn)1例患者精液中多為小頭精子，測序發(fā)現(xiàn)其存在無名指蛋白220(ring finger protein 220，RNF220)編碼基因的致病突變[20]。精子頭部大提示可能存在精子減數(shù)分裂異常和染色質(zhì)濃縮障礙，進(jìn)而影響精子質(zhì)量和受精能力。Guthauser等[21]通過測量精子大小與染色質(zhì)濃縮程度，發(fā)現(xiàn)測量的所有精子染色質(zhì)的平均解聚率為46%，而大頭形式則達(dá)到了64%。與小頭精子類似，部分大頭精子病例也提示存在遺傳缺陷，極光激酶C(aurora kinase C，AURKC)編碼基因缺陷已經(jīng)成為大頭精子致病畸形基因篩選的重要位點(diǎn)[22]。流式細(xì)胞儀檢測到精子偏大可能是由于大頭缺陷，也有可能提示有過量胞漿殘留，過量的胞漿殘留對精子質(zhì)量有著嚴(yán)重?fù)p害[23]。精子大小的異質(zhì)性對于生育力的預(yù)測一直是大家關(guān)注的問題，早在上個世紀(jì)就有研究者對精子大小分布與生育力的相關(guān)性進(jìn)行了研究，Aziz等[24]比較了生育組與未生育組之間的精子頭大小分布，發(fā)現(xiàn)其存在顯著差異：與未生育組相比，生育組的精子頭面積和長軸均一性更高。Mossman等[25]對從500名男子中隨機(jī)選擇103名男子提供的精液進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不僅是精子頭部的長度，甚至其長度變化的均一性也對精子質(zhì)量有預(yù)測作用。這些結(jié)論都與本研究結(jié)果相似，但是與以往研究采用光學(xué)顯微鏡觀測相比，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測的通量更高，更簡便。

綜上所述，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測精子大小異質(zhì)性，繼而反映精子質(zhì)量是一種相對簡便可行的方法。但本研究仍存在一些不足，由于特異性熒光抗體的缺乏，本研究檢測的其實(shí)是精液中所有細(xì)胞的大小分布，并沒有完全針對精子，雖然我們在篩選入組病例時排除了鏡下雜細(xì)胞多的患者，而且紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等圓細(xì)胞體積均遠(yuǎn)大于精子，但目前的結(jié)果仍不是最精準(zhǔn)的。近年來有部分研究探索了在流式細(xì)胞檢測中采用精子特異性抗體，但都沒有廣泛使用[2]，后續(xù)研究需要采用更好的抗體標(biāo)記與更好的精子分離手段加以完善。