朱序理，趙志明，杜元杰，周亮，王躍，孫慶云，曹金鳳，郝桂敏

(河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院生殖醫(yī)學科，石家莊 050000)

體外受精技術的主要挑戰(zhàn)和目標是培養(yǎng)和選擇出最具有種植潛能的胚胎，使母胎共同得到最好的臨床結局。為了降低圍產(chǎn)期產(chǎn)科及新生兒科的并發(fā)癥，許多中心采取單囊胚移植來降低多胎妊娠，但由于各中心囊胚冷凍標準及策略不同，以及囊胚形態(tài)學評分存在主觀性因素等，關于囊胚不同的評估參數(shù)對臨床妊娠結局的預測權重存在諸多爭議[1-2]。因此，本研究旨在通過分析囊胚的形態(tài)學評估參數(shù)與凍融胚胎臨床結局的關系，探討囊胚形態(tài)學參數(shù)中對囊胚凍融周期臨床結局的主要影響因素，為胚胎冷凍、解凍、移植等策略提供依據(jù)。

資料與方法

一、研究對象及分組

回顧性分析2018年1月至2020年2月在河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院生殖醫(yī)學科行D5或D6單囊胚凍融胚胎移植的患者臨床資料。納入標準：(1)冷凍囊胚為D5或D6、擴張期為3期及以上，囊胚內(nèi)細胞團與滋養(yǎng)層細胞評分不同時為C；(2)凍融周期采用人工周期內(nèi)膜準備方案；(3)解凍后為存活囊胚，移植時擴張程度大于50%以上，且為單囊胚移植；(4)排除行PGT周期。

共納入790個移植周期，分別按發(fā)育天數(shù)、囊胚擴張程度、內(nèi)細胞團級別、滋養(yǎng)層細胞級別分組比較。按發(fā)育天數(shù)分為D5組(n=650)和D6(n=140)組；按囊胚擴張程度分為6期組(n=45)、5期組(n=57)、4期組(n=585)和3期組(n=103)；按滋養(yǎng)層細胞評分分為A1組(n=35)、B1組(n=613)和C1組(n=142)；按內(nèi)細胞團評分分為A2組(n=51)、B2組(n=652)和C2組(n=87)。

二、研究方法

1.囊胚培養(yǎng)：按照本中心常規(guī)操作，在受精后D5、D6胚胎觀察，達到囊胚冷凍標準，進行玻璃化冷凍。囊胚冷凍標準：D5或D6為3期及以上的囊胚，內(nèi)細胞團(ICM)和滋養(yǎng)層細胞(TE)級別評分不同時為C級，即評分為AA、AB、AC、BA、BB、BC、CA、CB。

2.囊胚評分：采用Gardner囊胚評分系統(tǒng)[3]，囊胚擴張程度：1期(早期囊胚)；2期(囊胚)；3期(完全囊胚)；4期(膨大囊胚)；5期(孵化囊胚)，6期(孵出囊胚)。ICM的評分分為：A：緊密堆積的ICM，有許多細胞；B：松散組合的，有幾個細胞；C：很少細胞，排列紊亂。TE的評分分為：A：許多細胞形成一個內(nèi)聚的上皮；B：少數(shù)細胞形成一個松散的上皮；C：很少有大細胞。

3.囊胚冷凍及解凍：冷凍前行激光人工皺縮。玻璃化冷凍和解凍采用商品化試劑盒(Kitazato，日本)按照Kuwayama[4]報道的Crytop方法步驟進行，解凍最后在培養(yǎng)液中清洗數(shù)遍最后轉移至已平衡過夜囊胚培養(yǎng)液(G-2plus，Vitrolife，瑞典)中，放入37℃，6%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，囊胚移植前根據(jù)擴張程度重新判斷胚胎是否存活。

4.人工周期內(nèi)膜的準備：從月經(jīng)周期第3天給予口服戊酸雌二醇(補佳樂，拜耳，德國)2～4 mg，2次/d，根據(jù)患者的內(nèi)膜情況調(diào)整用藥劑量，待子宮內(nèi)膜厚度≥8 mm及血清E2≥732 pmol/L時進行內(nèi)膜轉化，給予肌肉注射黃體酮(黃體酮注射液，浙江仙琚)40 mg，1次/d，或陰道給藥90 mg(雪諾酮，雪蘭諾，英國)，1次/d，行黃體支持。記錄內(nèi)膜形態(tài)及厚度。

5.囊胚移植：解凍移植根據(jù)囊胚冷凍前發(fā)育天數(shù)和擴張程度準備，發(fā)育天數(shù)為D6的5期、6期囊胚按D6準備，即黃體轉化的第7天解凍移植，發(fā)育天數(shù)為D5、D6的3期、4期囊胚按D5準備，即黃體轉化的第6天解凍移植。移植囊胚數(shù)目均為1枚。

6.臨床妊娠判定：移植后12 d檢測血β-HCG，血HCG≥50 U/L為HCG陽性；移植4～5周行超聲檢查可見妊娠囊及原始心管搏動確定為臨床妊娠。記錄孕囊數(shù)目。

7.分類決策樹建模：采用SPSS 23.0軟件卡方自動交互檢驗(CHAID)，指定項：以是否臨床妊娠為因變量，以發(fā)育天數(shù)、擴張時期、內(nèi)細胞團、滋養(yǎng)層細胞為自變量，年齡為影響變量。使用生長法，在每一步CHAID選擇與因變量有最強交互作用的自變量，如果自變量的類別與因變量并非顯著不同，則合并這些類別。從開始生成兩個分區(qū)，在每個分區(qū)中執(zhí)行相同的過程，直到?jīng)]有變量向樹添加值，建立分類決策樹模型。

三、統(tǒng)計學處理

結 果

一、胚胎發(fā)育天數(shù)對妊娠結局的影響

D5和D6兩組患者的體重指數(shù)(BMI)、不孕年限、內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜類型之間差異均無統(tǒng)計學意義；D6組平均年齡顯著高于D5組，而臨床妊娠率顯著低于D5組(P<0.05)(表1)。

表1 D5與D6患者的一般情況及臨床妊娠結局比較[(-±s)，%]

二、囊胚擴張程度對妊娠結局的影響

按囊胚擴張程度(6期、5期、4期、3期)分組的4組患者在平均年齡、體重指數(shù)、不孕年限、內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜類型臨床妊娠率差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表2)。

三、滋養(yǎng)層細胞評分不同患者間妊娠結局比較

統(tǒng)計結果顯示，滋養(yǎng)層細胞評分不同的3組患者在平均年齡、體重指數(shù)、不孕年限、內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜類型的差異均無統(tǒng)計學意義；3組患者的臨床妊娠率隨滋養(yǎng)層細胞評分下降逐漸降低(P<0.05)(表3)。

四、內(nèi)細胞團級別不同患者間妊娠結局比較

統(tǒng)計結果顯示，內(nèi)細胞團評分不同的3組患者在平均年齡、體重指數(shù)、不孕年限、內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜類型差異上均無統(tǒng)計學意義；3組患者的臨床妊娠率隨內(nèi)細胞團級別評分下降逐漸降低(P<0.05)(表4)。

表2 囊胚擴張程度不同的患者一般情況及臨床妊娠結局比較[(-±s)，%]

表3 滋養(yǎng)層細胞評分不同的患者一般情況及臨床妊娠結局比較[(-±s)，%]

表4 內(nèi)細胞團評分不同的患者一般情況及臨床妊娠結局比較[(-±s)，%]

五、影響臨床妊娠結局的多因素logistic回歸分析結果

Logistic回歸分析結果表明，年齡[OR=0.945，95%CI(0.913，0.979)]和內(nèi)細胞團等級[OR=0.527，95%CI(1.213，2.475)]與臨床妊娠結局顯著相關(P<0.05)；而發(fā)育天數(shù)、擴張程度、滋養(yǎng)細胞等級與臨床妊娠結局無關(P>0.05)(表5)。

表5 影響妊娠結局多因素回歸分析

六、分類決策樹模型結果

模型中納入的自變量為擴張時期、內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層細胞級別；結果顯示決策樹包含3層，共生成6個節(jié)點：(1)第一層為內(nèi)細胞團(C級 vs A，B級；χ2=13.7，P=0.001)；(2)第二層為擴張時期(6，3期 vs 4，5期；χ2=11.1，P=0.006)；(3)第三層為滋養(yǎng)層細胞(C級 vs A，B級；χ2=6.367，P=0.035)；交叉驗證正確百分比57.8%(圖1)。

注：Adj.表示調(diào)整后統(tǒng)計值，n表示周期數(shù)，節(jié)點1為內(nèi)細胞團為C級的囊胚，節(jié)點2為內(nèi)細胞團為A或B級的囊胚，節(jié)點3和節(jié)點4為節(jié)點2的子節(jié)點分別為擴張期(6期，3期)和(5期，4期)囊胚，節(jié)點5和節(jié)點6為節(jié)點4的子節(jié)點分別為滋養(yǎng)層細胞(A，B級)和C級囊胚。圖1 分類決策樹

討 論

近年來隨著囊胚培養(yǎng)技術的發(fā)展，選擇性囊胚移植為臨床策略提供了更多的方案，且獲得較高的臨床妊娠率。囊胚移植提高妊娠率的同時，多個囊胚移植，多胎率也高，因此很多生殖中心采用單囊胚移植，在保證妊娠率的同時降低多胎率。但囊胚目前形態(tài)學評分的參數(shù)包括囊胚發(fā)育天數(shù)、擴張期別及滋養(yǎng)層細胞和內(nèi)細胞團的級別等，如何挑選更具有發(fā)育潛能的囊胚，從而縮短到達臨床妊娠的時間，成為各中心的需要解決的問題。而且，目前各中心通常采用Gardner囊胚評分方法[3]，胚胎擴張程度、內(nèi)細胞團、滋養(yǎng)細胞這三者之間具有相對獨立性，各參數(shù)對臨床結局的影響，國內(nèi)外文獻報道存在爭議[5-8]，因此，移植時給囊胚選擇帶來一定困惑。

新鮮周期中臨床妊娠和胚胎種植的影響因素很多，包括卵巢刺激造成的高水平的雌激素或提前的孕激素的升高等對內(nèi)膜容受性的影響，因此在本研究中我們對凍融的單囊胚移植周期進行回顧性分析，采用人工周期內(nèi)膜準備方案，以期將激素對內(nèi)膜的影響降至最低，探討囊胚的各項評估參數(shù)與凍融周期臨床結局的關系，為凍融胚胎移植策略提供依據(jù)。

發(fā)育天數(shù)D5與D6囊胚臨床妊娠結局的比較目前仍存在爭議，主要由于培養(yǎng)體系，囊胚培養(yǎng)及冷凍時間策略等不同造成研究結果存在差異[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)育天數(shù)D5組臨床妊娠率顯著高于D6組，但年齡顯著低于D6組(P<0.05)；多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)育天數(shù)與臨床妊娠率無相關性，而且分類決策樹指定項加入了發(fā)育天數(shù)為自變量，結果中也沒有發(fā)育天數(shù)這一節(jié)點。這可能是與本中心囊胚培養(yǎng)及冷凍標準等策略有關，囊胚冷凍的標準為D5和D6囊胚評級在3 CC以上，D6為囊胚培養(yǎng)終點，因此，D6可能有一部分6期囊胚和非優(yōu)質(zhì)囊胚，而且6期囊胚由于沒有透明帶保護，可能在冷凍復蘇過程受到影響。此外有研究表明優(yōu)質(zhì)囊胚發(fā)育天數(shù)為D5和D6整倍體率差異沒有統(tǒng)計學意義，但非優(yōu)質(zhì)囊胚發(fā)育天數(shù)為D5整倍率明顯高于D6[10]，非優(yōu)質(zhì)囊胚的發(fā)育速度與整倍體有相關性，從而影響臨床妊娠結局。這與何于夏等[11]的研究相似，在非優(yōu)質(zhì)單囊胚中D5比D6有較好的臨床妊娠率。因此，如果在本研究基礎上非優(yōu)質(zhì)囊胚進一步分枝，可考慮囊胚發(fā)育速度，進一步證實可通過隊列前瞻性研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，囊胚擴張程度與臨床妊娠率沒有相關性，這與既往一些報道一致[8，12-13]。但本研究結果顯示6期和3期囊胚臨床妊娠率有下降趨勢，且分類決策樹分兩區(qū)顯示6期和3期囊胚臨床妊娠率顯著低于5期和4期囊胚。分析可能由于在囊胚冷凍復蘇中受到影響，6期囊胚由于沒有透明帶保護，3期囊胚由于激光皺縮效果欠佳或是受損細胞相對比例高。因此提示我們在囊胚培養(yǎng)過程中，通過增加觀察次數(shù)，避免冷凍6期和3期囊胚，凍融移植時優(yōu)先選擇5期和4期囊胚。

關于內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層細胞級別對臨床結局的相對貢獻尚未確定，考慮到內(nèi)細胞團分級包含胎兒細胞的前體細胞，最初可能認為其對移植結果的影響最大，早期一些研究也表明內(nèi)細胞團等級比滋養(yǎng)層細胞等級更重要[13-14]。但近幾年國外一些報道，認為滋養(yǎng)層細胞是成功妊娠的最重要決定因素[1-2，15]。從生理學角度來看，滋養(yǎng)層細胞和內(nèi)細胞團不是孤立存在的，而是作為一個有機整體共存的。滋養(yǎng)層細胞通過囊胚腔液的合成為內(nèi)細胞團創(chuàng)造了一個獨特的環(huán)境[16]。早期在小鼠囊胚研究中發(fā)現(xiàn)內(nèi)細胞團本身可通過抑制巨細胞轉化和刺激細胞增殖調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細胞[17-18]。因此，對囊胚的內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層細胞進行分級，并在移植時挑選最具發(fā)育潛能的囊胚，從而得到更好的臨床結局具有重要的意義。本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)細胞團、滋養(yǎng)層細胞評分不同的各組臨床妊娠率不同，且差異有統(tǒng)計學意義。多因素logistic分析顯示，內(nèi)細胞團評分低是臨床妊娠率低的危險因素，且分類決策樹第一節(jié)點為內(nèi)細胞團級別，A、B級與C級比較臨床妊娠率有顯著性差異(χ2=13.7，P=0.001)，因此，我們認為在單囊胚移植策略中首先要考慮內(nèi)細胞團等級。這也與李為玉等[8]的報道相一致，內(nèi)細胞團評分低的相對風險值更高。何于夏等報道[11]，在非優(yōu)質(zhì)單囊胚移植周期中，優(yōu)先選擇D5囊胚，可獲得較好的臨床妊娠率與活產(chǎn)率，囊胚內(nèi)細胞團、滋養(yǎng)細胞層的評分不平行時，即相同囊胚發(fā)育速度下AC/BC組與CA/CB組相比，不影響妊娠結局。按照本研究中分類決策樹提供的的臨床參考，在選擇囊胚移植時，應首先根據(jù)內(nèi)細胞團排除C級，再根據(jù)擴張程度排除6期和3期，最后根據(jù)滋養(yǎng)層細胞排除C級。本研究包括了非優(yōu)質(zhì)和優(yōu)質(zhì)囊胚，因此對于非優(yōu)質(zhì)或優(yōu)質(zhì)囊胚單獨比較囊胚形態(tài)學參數(shù)權重還需進一步研究。王雪等[19]報道優(yōu)先選擇D5優(yōu)質(zhì)胚，該中心只冷凍4期以上囊胚且內(nèi)細胞團為A或B級，因此，不同中心根據(jù)自己中心常規(guī)操作，建立移植策略是必要的。

本研究中分類決策樹模型交叉驗證正確率低于60%，主要因為胚胎移植后臨床結局影響因素不僅有胚胎發(fā)育速度及質(zhì)量，還有女性的年齡、內(nèi)膜厚度、不孕年限、不孕原因等，此外患者子宮內(nèi)環(huán)境、機體免疫狀態(tài)、移植過程等均對妊娠的成功有影響。本模型建立的初衷是利用胚胎形態(tài)學主要參數(shù)提供有效移植策略，從而提高患者的移植效率，但還具有一定的局限性。

綜上所述，在凍融單囊胚移植周期中，囊胚評估參數(shù)內(nèi)細胞團評分低是臨床妊娠率低的主要危險因素；單囊胚的凍融周期移植時，建議優(yōu)先考慮內(nèi)細胞團級別，選擇A或B級的囊胚，再考慮擴張程度為5或4期的囊胚，最后考慮滋養(yǎng)層細胞級別為A或B級的囊胚，從而獲得較高臨床妊娠率。