李榮宇，林少玲，駱月姬

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405)

2019年底，爆發(fā)了一場(chǎng)由新型冠狀病毒(COVID-19)引起的全球性急性呼吸道傳染病。由于COVID-19傳染性強(qiáng)、傳播途徑廣、可感染不同人群[1]，且從未在人類史上出現(xiàn)過，因此對(duì)其缺乏認(rèn)知，給病患的治療帶來巨大困難。

自古以來，中醫(yī)治療疫病(如瘟疫等)具有悠久歷史，在疫病病因分析、辨治施藥等方面已有深入研究。國(guó)家中醫(yī)藥管理局在開展“中醫(yī)藥防治新冠肺炎有效方劑臨床篩選研究”工作中發(fā)現(xiàn)，清肺排毒湯對(duì)河北、山西、黑龍江、陜西四省 214例確診患者的臨床救治總有效率達(dá)90%以上[2]。因此，將清肺排毒湯收錄于《新型冠狀病毒肺炎診療方案》(試行第六、七版)中，并在全國(guó)大力推廣使用。

清肺排毒湯來源于《傷寒雜病論》，參考麻黃湯、橘枳姜湯、射干麻黃湯、小柴胡湯和五苓散等經(jīng)典名方，處方由麻黃、炙甘草、杏仁、生石膏、桂枝等21味中藥配伍組成[3]。作為全新藥方，其藥效、有效成分、作用機(jī)制等諸多方面尚無相關(guān)研究，因此，本研究從體外抗菌的角度進(jìn)行清肺排毒湯的藥效研究，以期為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)的理論依據(jù)，為清肺排毒湯的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥材組成

清肺排毒湯：麻黃9 g、炙甘草6 g、杏仁9 g、生石膏30 g、桂枝9 g、澤瀉9 g、豬苓9 g、白術(shù)9 g、茯苓15 g、柴胡16 g、黃芩6 g、姜半夏9 g、生姜9 g、紫苑9 g、冬花9 g、射干9 g、細(xì)辛6 g、山藥12 g、枳實(shí)6 g、陳皮6 g、藿香9 g，以上藥材(除生姜購(gòu)自于市場(chǎng)外)均購(gòu)于大參林醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司。

1.2 菌株

標(biāo)準(zhǔn)菌種：金黃色葡萄球菌(CMCC26003，S.aureus)、肺炎克雷伯氏菌(ATCC10031，K.pneumoniae)、普通變形桿菌(CMCC49027，P.vulgaris)、銅綠假單胞菌(ATCC27853，P.aeruginosa)，均由廣東省微生物菌種保藏中心提供。

1.3 培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)肉湯(廣東環(huán)凱生物科技有限公司，批號(hào)：1072861)，M-H瓊脂(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20191015)。

1.4 儀器

LX-B50L型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器，合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；DHP-9082恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司。

2 方法

2.1 清肺排毒湯的制備

2.1.1 提取 ①將生石膏先置于圓底燒瓶中，加入8倍藥材量水，加熱回流提取0.5 h，再加入處方中余下藥材，繼續(xù)提取1.0 h，藥液以200目篩過濾；②藥渣加入6倍藥材量水，加熱回流提取1.0 h，藥液以200目篩過濾，合并兩次濾液。

2.1.2 濃縮 采用真空減壓濃縮，在80 ℃下濃縮至藥液濃度為1.0 g生藥/mL。

2.1.3 藥液配制 以水為溶劑，將清肺排毒湯(1 g生藥/mL)按2倍遞減稀釋，配制成11個(gè)梯度濃度(1 000.0～0.98 mg生藥/mL)的藥液。

2.2 菌液制備

將金黃色葡萄球菌等菌種解凍后于M-H瓊脂板上劃線，放置恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)18～24 h；挑選單菌落，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，放置恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)18 h，以比濁管為參照，先用營(yíng)養(yǎng)肉湯稀釋至0.5麥?zhǔn)媳葷岫?約為1×108cfu /mL)，再稀釋成濃度為1×106cfu/mL的菌液。

2.3 最低抑菌濃度MIC的測(cè)定

采用微量稀釋法[4]，取無菌96孔平底微量培養(yǎng)板，于每排第1～12孔各加入菌液100 μL，接著按濃度高低往每排第1～11孔加入相應(yīng)濃度的清肺排毒湯藥液100 μL，每排第12孔只加水作為陰性對(duì)照，平行操作3份。將96孔培養(yǎng)板置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)18 h，取出，于黑色背景下肉眼觀察，陰性對(duì)照孔呈渾濁(表明細(xì)菌生長(zhǎng)良好)，其他孔中以溶液清晰透亮者為該藥物的MIC。若藥液與菌液剛混合則出現(xiàn)渾濁難以判斷，可在培養(yǎng)后進(jìn)行涂片，于顯微鏡下觀察無菌的孔便為MIC。

2.4 最低殺菌濃度MBC測(cè)定

取1～12孔的培養(yǎng)物，分別吸取1接種環(huán)，于M-H瓊脂平板上劃線，置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)18 ～24 h，以菌落數(shù)少于5個(gè)者為該藥的MBC。

3 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，清肺排毒湯對(duì)呼吸道致病菌具有一定的抑制作用，其中對(duì)金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌的作用較強(qiáng)，MIC、MBC值均為250.0 mg/mL；對(duì)肺炎克雷伯菌及普通變形桿菌則較弱，MIC、MBC值均>500.0 mg/mL。見表1。

表1 清肺排毒湯對(duì)呼吸道致病菌的MIC和MBC值

4 討論

本研究通過體外抑菌實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)清肺排毒湯對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的抗菌活性較強(qiáng)，但對(duì)于肺炎克雷伯菌、普通變形桿菌較弱，表明其具有一定的抗菌作用。

根據(jù)清肺排毒湯方解[3-5]可知：麻黃湯與五苓散相配，祛寒邪閉阻、健脾祛濕；配射干麻黃湯、橘枳姜湯以舒緩胸憋、氣短；配小柴胡湯以和解少陽；加藿香以化濕辟邪；用石膏防郁而化熱。同時(shí)，縱觀方中藥材，黃芩[6]、生姜[7]、冬花[8]、射干[9]、細(xì)辛[10]、枳實(shí)[11]、陳皮[12]、藿香[13]等具有一定的抗菌作用，占方中藥味數(shù)的38.10%、方中藥材重量的24.90%。因此，結(jié)合其體外抗菌效果，推測(cè)該方以對(duì)人體肺部的綜合調(diào)理為主、抗菌為輔。