楊 俊，崔 婷，張 玨，劉 亮，梁光平*

(1.遵義醫(yī)藥高等專科學(xué)校 藥學(xué)系，貴州 遵義 563006；2.貴州省野生藥用植物 資源持續(xù)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，貴州 遵義 563006)

惡性腫瘤已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類健康的主要問(wèn)題之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2015年我國(guó)惡性腫瘤患者約392.9萬(wàn)人，死亡約233.8萬(wàn)人，近年來(lái)惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率均呈持續(xù)上升態(tài)勢(shì)，每年惡性腫瘤帶來(lái)的醫(yī)療花費(fèi)超過(guò)2 200億元[1-2]。在全球185個(gè)國(guó)家或地區(qū)中，中國(guó)的惡性腫瘤發(fā)病、死亡率位居中等偏上水平，部分消化道腫瘤，如食管癌、胃癌、肝癌等約占全球惡性腫瘤的一半，整體防治形勢(shì)嚴(yán)峻[3]。蕨類植物是植物界的一大門(mén)類，長(zhǎng)期以來(lái)各族人民就有藥用和食用蕨類植物資源的習(xí)慣。本課題組前期報(bào)道披針新月蕨含有黃酮類、萜類、甾醇、糖及糖苷類、酚類、氨基酸、蛋白質(zhì)、揮發(fā)油等化學(xué)成分[4]；粉背蕨含有黃酮類、糖及糖苷類、酚類、氨基酸、蛋白質(zhì)、揮發(fā)油等化學(xué)成分[5]；莢囊蕨含有黃酮類、萜類、甾醇類、糖苷類、酚類、氨基酸、蛋白質(zhì)、揮發(fā)油、內(nèi)酯、香豆素等化學(xué)成分[6]。為深入挖掘野生蕨類植物在抗腫瘤方面的應(yīng)用價(jià)值，本文對(duì)莢囊蕨、披針新月蕨、粉背蕨的抗腫瘤活性提取物進(jìn)行了研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與儀器

1.1 藥材及細(xì)胞株

三種野生蕨類植物均由貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李繼新老師提供，原植物經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)趙俊華老師分別鑒定為烏毛蕨科莢囊蕨屬莢囊蕨(Struthiopteriseburnea(Christ) Ching)、金星蕨科新月蕨屬披針新月蕨(Pronephriumpenangianum(Hook.) Holtt)、中國(guó)蕨科粉背蕨屬粉背蕨(AleuritopterispseudofarinosaChing et S.K.Wu)的干燥全草，樣本均存放于遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系。

人肺腺癌細(xì)胞(A549)、人肝癌細(xì)胞(HepG2)、人胃腺癌細(xì)胞(BGC-823)、人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)四種細(xì)胞株由貴州省中科院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供并完成活性篩選工作。

1.2 儀器與試劑

NAPCO Series 5400 CO2培養(yǎng)箱，SuPerMax 3100型多功能酶標(biāo)儀，RV-3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，PTT-FA200型天平，96孔培養(yǎng)板(美國(guó)Costar)。

胎牛血清(杭州四季青生物工程有限責(zé)任公司)；甲基噻唑藍(lán)、二甲基亞砜(美國(guó)Sigma公司)；RPMI1640培養(yǎng)基；石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇均為市售分析純?cè)噭?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 提取物的制備[7-8]

以莢囊蕨為例：取莢囊蕨全草粗粉50 g，置于圓底燒瓶中，加入300 mL石油醚(60～90 ℃)回流提取2.0 h，過(guò)濾，藥渣繼續(xù)加入200 mL石油醚(60～90 ℃)提取1.5 h后過(guò)濾，合并濾液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮干燥得石油醚提取物(JNJ-SYM，2.8 g)。石油醚提取后的藥渣經(jīng)晾干處理，依次使用二氯甲烷(300 mL、200 mL)、乙酸乙酯(300 mL、200 mL)、正丁醇(300 mL、200 mL)作為溶劑，分別回流提取2.0 h、1.5 h，減壓濃縮分別獲得莢囊蕨的二氯甲烷提取物(JNJ-DCM，2.5 g)、乙酸乙酯提取物(JNJ-YZ，2.1 g)、正丁醇提取物(JNJ-ZDC，2.6 g)。剩下的藥渣加水(300 mL、200 mL)煎煮即得莢囊蕨水提取物(JNJ-S，9.3 g)。

披針新月蕨參照上述方法，分別獲得石油醚提取物(XYJ-SYM，1.9 g)、二氯甲烷提取物(XYJ-DCM，3.1 g)、乙酸乙酯提取物(XYJ-YZ，2.6 g)、正丁醇提取物(XYJ-ZDC，1.5 g)、水提取物(XYJ-S，7.1 g)。

粉背蕨參照上述方法，分別獲得石油醚提取物(FBJ-SYM，1.4 g)、二氯甲烷提取物(FBJ-DCM，2.3 g)、乙酸乙酯提取物(FBJ-YZ，3.2 g)、正丁醇提取物(FBJ-ZDC，2.2 g)、水提取物(FBJ-S，8.5 g)。

2.2 活性檢測(cè)方法

將各提取物分別配制成2、20、50 μg·mL-1三個(gè)濃度的溶液，參照文獻(xiàn)[7-10]的方法，分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(細(xì)胞密度長(zhǎng)到約80%～90%)的A549、MCF-7、HepG2、BGC-823細(xì)胞，采用胰酶消化后，用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基配成5×104個(gè)·mL-1細(xì)胞懸液，接種在96孔板，每孔接100 μL，加100 μL培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，吸出培養(yǎng)液，加入新培養(yǎng)液180 μL及藥液20 μL。培養(yǎng)72 h后，棄去上清液，每孔加入80 μL無(wú)血清培養(yǎng)基，20 μL的5 mg·mL-1MTT，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)4 h。取出96孔板，小心吸掉培養(yǎng)基上清。加入DMSO 150 μL，輕輕震蕩10 min，使DMSO完全溶解MTT反應(yīng)的產(chǎn)物，立即用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)下的OD值。并按下式計(jì)算相應(yīng)的抑制率(%)：

2.3 活性檢測(cè)結(jié)果

采用MTT法分別檢測(cè)莢囊蕨、披針新月蕨、粉背蕨的石油醚提取物、二氯甲烷提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物在2、20、50 μg·mL-1濃度時(shí)對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人肝癌細(xì)胞HepG2、人胃腺癌細(xì)胞BGC-823增殖的結(jié)果，詳見(jiàn)表1。

表1 三種野生蕨類植物提取物對(duì)A549、MCF-7、HepG2、BGC-823細(xì)胞的抑制作用

FBJ-YZ提取物在50 μg·mL-1濃度時(shí)，對(duì)A549細(xì)胞的抑制率為(15.64±2.21)%；JNJ-DCM提取物在各個(gè)質(zhì)量濃度范圍對(duì)A549細(xì)胞均具有一定的抑制作用，并且呈現(xiàn)出濃度依賴性；其余13個(gè)提取物對(duì)A549細(xì)胞幾乎沒(méi)有抑制作用。

對(duì)于MCF-7細(xì)胞，JNJ-DCM、JNJ-S、FBJ-DCM、FBJ-YZ提取物具有相對(duì)中等程度的抑制作用；XYJ-YZ、XYJ-DCM、XYJ-ZDC提取物在各個(gè)質(zhì)量濃度范圍對(duì)MCF-7細(xì)胞均表現(xiàn)出較佳的抑制作用，且呈現(xiàn)出濃度依賴性。楊嫻[11]報(bào)道披針新月蕨的乙醇提取物在400、600、800 μg·mL-1濃度時(shí)對(duì)MCF-7表現(xiàn)出一定的抑制作用，在如此高的濃度下沒(méi)有太大的應(yīng)用價(jià)值，還未報(bào)道其他提取物，而我們得到XYJ-YZ、XYJ-DCM、XYJ-ZDC提取物在50 μg·mL-1時(shí)對(duì)MCF-7的抑制率分別能達(dá)到(45.78±3.87)%、(35.04±2.42)%、(37.92±1.52)%，說(shuō)明抗腫瘤活性化合物主要存在于披針新月蕨的乙酸乙酯、二氯甲烷、正丁醇提取物中。

FBJ-ZDC、FBJ-S、JNJ-YZ提取物對(duì)HepG2細(xì)胞具有一定的抑制作用，其余12個(gè)提取物對(duì)HepG2細(xì)胞幾乎沒(méi)有抑制作用。

JNJ-YZ、FBJ-YZ在各個(gè)質(zhì)量濃度范圍對(duì)BGC-823細(xì)胞表現(xiàn)出較好的抑制作用，且呈現(xiàn)出濃度依賴性，在50 μg·mL-1時(shí)抑制率分別為(39.17±7.75)%、(34.92±4.49)%，抑制率優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥阿霉素在1×10-6mol·L-1濃度時(shí)的作用。XYJ-ZDC、XYJ-DCM、JNJ-ZDC、XYJ-YZ對(duì)BGC-823細(xì)胞具有中等程度的抑制作用，在50 μg·mL-1時(shí)抑制率分別為(20.77±1.34)%、(21.10±3.29)%、(23.93±4.86)%、(17.28±2.82)%。

3 討論

貴州獨(dú)特的氣候條件和地形地貌非常適宜蕨類植物的生長(zhǎng)繁殖，現(xiàn)有蕨類植物54科148屬900多種，貴州的苗族等少數(shù)民族用蕨類植物治療寄生蟲(chóng)、痢疾、風(fēng)濕等病癥，隨著現(xiàn)代藥學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展，蕨類植物的作用機(jī)制逐漸闡明，成為開(kāi)發(fā)新藥材資源和研發(fā)新藥的寶庫(kù)。

筆者采用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水五種溶劑對(duì)莢囊蕨、披針新月蕨、粉背蕨分別進(jìn)行提取，得到3個(gè)系列共15種提取物，然后使用MTT法分別檢測(cè)15種提取物在2、20、50 μg·mL-1濃度時(shí)對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人肝癌細(xì)胞HepG2、人胃腺癌細(xì)胞BGC-823增殖的影響。結(jié)果表明：XYJ-YZ、XYJ-DCM、XYJ-ZDC在50 μg·mL-1濃度時(shí)，對(duì)MCF-7的抑制率分別為(45.78±3.87)%、(35.04±2.42)%、(37.92±1.52)%；JNJ-YZ和FBJ-YZ在50 μg·mL-1濃度時(shí)對(duì)BGC-823細(xì)胞抑制率分別為(39.17±7.75)%、(34.92±4.49)%；其余提取物對(duì)上述4個(gè)細(xì)胞系的抑制作用較弱或無(wú)抑制作用，以上結(jié)果對(duì)于我們后期的進(jìn)一步分離、活性篩選等工作具有重要的指導(dǎo)意義。