熊海均，甘青霞，彭誠藝，黃勤挽，王 瑾，湯婷婷，耿福能*

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都 611137；2.好醫(yī)生藥業(yè)集團(tuán)有限公司，四川 成都 610031)

小兒解表顆粒是治療小兒外感風(fēng)熱所致感冒的常用中成藥[1]，收載于2010版、2015版《中國藥典》(一部)，由金銀花、連翹、炒牛蒡子、蒲公英、黃芩、防風(fēng)、紫蘇葉、荊芥穗、葛根、人工牛黃 10味中藥組成[2]，其藥效較為溫和[3]，有助于改善患兒的臨床發(fā)熱癥狀，且不會增加不良反應(yīng)，具有進(jìn)一步應(yīng)用和推廣的臨床價值[4]。本實驗通過利用大鼠復(fù)制LPS、2，4-二硝基酚和干酵母3種不同的發(fā)熱模型，明確小兒解表顆粒的解熱作用，并對2，4-二硝基酚發(fā)熱模型進(jìn)行解熱機(jī)制研究，從而為進(jìn)一步推廣小兒解表顆粒的臨床應(yīng)用提供科學(xué)的實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物

小兒解表顆粒(國藥準(zhǔn)字Z51021319，批號：180232，四川好醫(yī)生藥業(yè)集團(tuán)有限公司)；柴黃顆粒(國藥準(zhǔn)字Z19993380，批號：180402，四川百利天恒藥業(yè)股份有限公司)；小兒柴桂退熱顆粒(國藥準(zhǔn)字Z20050716，批號：180339，葵花藥業(yè)集團(tuán)襄陽隆中有限公司)。

1.2 試劑

2，4二硝基酚(批號：2015110101，成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn))；LPS(脂多糖)，來源于大腸桿菌O111：B4，貨號：L2630，Sigma公司；高活性干酵母粉，安琪酵母股份有限公司；大鼠NO ELISA試劑盒(96T)(批號：YCFTYZ7A44)，大鼠PGE2ELISA試劑盒(96T)(批號：6F3FY33UXJ)，大鼠GHRL ELISA試劑盒(96T)(批號：4V74BN51TP)，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；大鼠IL-1β ELISA試劑盒(96T)(批號：A301B80834)，大鼠IL-6ELISA試劑盒(96T)(批號：A30680851)，大鼠TNF-αELISA試劑盒(96T)(批號：A38280733)，大鼠IFN-γ ELISA試劑盒(96T)(批號：A38080214)，杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司。

1.3 動物

SPF級SD大鼠，雄性，體重180～220 g，由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，動物合格證號：SCXK(川)2015-30。

1.4 儀器

YP30002型電子秤，感量：0.01 g，最大稱量：3 000 g(上海越平科學(xué)儀器有限公司)；醫(yī)用體溫計，型號：MMC-W201，測量范圍：32.0～42.0 ℃(北京小米科技有限責(zé)任公司)；UPH-Ⅰ-10T超純水器(成都超純科技有限公司)；AUW220D型十萬分之一電子天平(日本島津制作所)；L550型臺式低速離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；SHHW21-600型三用電熱恒溫水箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；超低溫保存箱，型號：DW-86L338(J)，海爾集團(tuán)；10～1 000 μL移液槍，熱電(中國)集團(tuán)；XK96-3型微量振蕩器(江蘇新康醫(yī)療器械有限公司)；XW-80A型旋渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；Emax Plus酶標(biāo)儀，Molecular Devices，LLC.；S10手持式高速勻漿機(jī)(寧波新藝超聲設(shè)備有限公司)。

2 方法

2.1 小兒解表顆粒對3種不同發(fā)熱模型的解熱作用

2.1.1 分組及給藥 取100只大鼠每天早晚各測量肛溫1次，連續(xù)3 d，篩選得到70只體溫恒定大鼠進(jìn)入實驗。將合格大鼠分為7個組，每組動物10只，采用預(yù)防給藥方式，分別按照以下劑量分別灌胃給藥3 d。①空白對照組；②LPS模型對照組；③干酵母模型對照組；④2，4-二硝基酚模型對照組：給予5 mL/kg劑量的生理鹽水；⑤LPS模型+給藥組；⑥干酵母模型+給藥組；⑦2，4-二硝基酚模型+給藥組：5 mL/kg劑量的小兒解表顆粒藥液(0.5 g/mL)。

2.1.2 監(jiān)測體溫變化 末次給藥1 h后進(jìn)行造模，連續(xù)監(jiān)測造模后幾小時的肛溫(因為3種致熱劑的發(fā)熱強(qiáng)度、持續(xù)發(fā)熱周期不同，所以檢測肛溫的時間間隔有所不同)。分別按照以下方式進(jìn)行造模：2，4-二硝基酚組：在④和⑦組的各鼠背部按5 mL/kg的劑量皮下注射2，4-二硝基酚(30 mg/kg)，每隔20 min測量體溫，連續(xù)監(jiān)測160 min；LPS組：在②和⑤組按5 mL/kg的劑量進(jìn)行腹腔注射LPS(100 μg/kg)，剛開始每隔1 h測1次體溫，后面再隔0.5 h測1次體溫，連續(xù)監(jiān)測7.5 h；干酵母組：在③和⑥組的各鼠背部按5 mL/kg的皮下注射干酵母混懸液(20%)，剛開始每隔1 h測1次體溫，后面再每隔0.5 h測體溫1次，連續(xù)監(jiān)測7.5 h；空白對照組：在①組的各鼠背部按5 mL/kg的劑量皮下注射生理鹽水，其中，編號1～3的大鼠監(jiān)測時間與2，4-二硝基酚組進(jìn)行同步；編號4～7的大鼠監(jiān)測時間與LPS(脂多糖)組同步；編號8～10的大鼠監(jiān)測時間與干酵母組同步。

2.2 不同濃度的小兒解表顆粒對2，4-二硝基酚模型的解熱機(jī)制研究

2.2.1 分組及給藥 將體溫恒定的合格大鼠隨機(jī)分為7個組，每組10只，分別為：①空白對照；②2，4-二硝基酚模型對照組；③2，4-二硝基酚模型+小兒解表顆粒高劑量(0.5 g/mL)組；④2，4-二硝基酚模型+小兒解表顆粒中劑量(0.25 g/mL)組；⑤2，4-二硝基酚模型+小兒解表顆粒低劑量(0.125 g/mL)組；⑥2，4-二硝基酚模型+柴黃顆粒(0.25 g/mL)(陽性對照1組)；⑦2，4-二硝基酚模型+小兒柴桂退熱顆粒(0.75 g/mL)(陽性對照2組)。采用預(yù)防給藥方式，①～⑦組均連續(xù)灌胃給藥3 d(其中①～②組灌胃等體積純水，③～⑦組灌胃相應(yīng)的藥液)。

2.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)技術(shù)檢測 末次給藥1 h后，②～⑦組進(jìn)行發(fā)熱造模，各鼠背部按5 mL/kg的劑量皮下注射2，4-二硝基酚藥液(30 mg/kg)，在大鼠體溫達(dá)到最高點(diǎn)時，按1.5 mL/200 g體重腹腔注射20%烏拉坦溶液麻醉，腹主動脈采血，自然凝固2 h，將凝固的腹主動脈血，以3 500 r/min，離心5 min，取上清液得到血清，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)技術(shù)檢測IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ、GHRL和β-EP。處死動物后，解剖取出下丘腦，用生理鹽水清洗，用濾紙吸干水分，稱重，再用10倍量的生理鹽水進(jìn)行勻漿，得到勻漿液，以16 000 r/min，離心1 min，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)技術(shù)檢測cAMP、NO和PGE2。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用多組間單因素方差分析方法，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小兒解表顆粒對3種不同發(fā)熱模型的解熱作用

3.1.1 小兒解表顆粒對LPS模型的解熱作用 LPS組與空白對照組比較，從造模后2 h，溫度有一定的升高，但沒有統(tǒng)計學(xué)差異，持續(xù)到4 h，溫度又在降低；較大程度的溫度升高從5 h開始，一直持續(xù)到7 h，在5.5、6.0、6.5 h的時間點(diǎn)，均能顯著地升高大鼠體溫(肛溫)，P均<0.05，其中升溫的峰值在6.5 h，說明LPS發(fā)熱大鼠模型復(fù)制成功。

LPS+給藥組與LPS組比較，在發(fā)熱有顯著性增高的時間點(diǎn)上(5.5、6.0、6.5 h)，給藥組有降低大鼠體溫(肛溫)的作用，其中在升溫峰值的6.5 h時間點(diǎn)，能夠顯著性降低(P<0.05)。結(jié)果表明，小兒解表顆粒對LPS導(dǎo)致的發(fā)熱大鼠具有一定的解熱作用。但數(shù)據(jù)的整體波動較大(體現(xiàn)在標(biāo)準(zhǔn)差偏大)，詳見表1。

表1 對LPS發(fā)熱大鼠的體溫(肛溫)影響

3.1.2 小兒解表顆粒對2，4-二硝基酚模型的解熱作用 2，4-二硝基酚組與空白對照組比較，從造模后20 min，一直到140 min，均能顯著地升高大鼠體溫(肛溫)(P<0.05)，其中升溫的峰值在80～100 min，說明2，4-二硝基酚發(fā)熱大鼠模型復(fù)制成功。2，4-二硝基酚+給藥組與2，4-二硝基酚組比較，在造模后20 min，給藥組能顯著地降低大鼠體溫(肛溫)(P<0.01)；而在后續(xù)的時間點(diǎn)中，同樣有一定程度的降低大鼠體溫(肛溫)(P>0.05)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明，小兒解表顆粒對2，4-二硝基酚導(dǎo)致的發(fā)熱大鼠具有一定的解熱作用，主要體現(xiàn)在模型復(fù)制后的20 min，詳見表2。

表2 對2，4-二硝基酚發(fā)熱大鼠的體溫(肛溫)影響

3.1.3 小兒解表顆粒對干酵母模型的解熱作用 干酵母組與空白對照組比較，從造模后4 h開始，一直持續(xù)到本次實驗觀察的7.5 h，均能顯著地升高大鼠體溫(肛溫)(P<0.05)，其中升溫的峰值有“雙峰”現(xiàn)象，分別在5.5 h和7.0 h，說明干酵母發(fā)熱大鼠模型復(fù)制成功。干酵母+給藥組與干酵母組比較，在發(fā)熱升溫最高的“雙峰”兩個時間點(diǎn)上(5.5、7.0 h)，給藥組均有一定降低大鼠體溫(肛溫)的作用(P>0.05)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明，小兒解表顆粒對干酵母導(dǎo)致的發(fā)熱大鼠具有一定的解熱作用，但作用不顯著，見表3。

表3 對干酵母發(fā)熱大鼠的體溫(肛溫)影響

3.2 不同濃度小兒解表顆粒對2，4-二硝基酚模型的解熱機(jī)制

3.2.1 對下丘腦中cAMP、NO、PGE2的影響 與空白組大鼠比較，模型組大鼠下丘腦中cAMP、NO、PGE2均高于空白組(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明造模成功。與模型組比較，兩個陽性組中，柴桂組對NO的降低不明顯(P>0.05)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；不同濃度的小兒解表顆粒均能一定程度降低下丘腦中cAMP、NO、PGE2的含量，但解表中組對cAMP和解表低組對cAMP、NO的降低不明顯(P>0.05)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，cAMP、NO、PGE2解表高組顯著降低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。說明高劑量的小兒解表顆粒能有效抑制2，4-二硝基酚致大鼠發(fā)熱引起下丘腦中的cAMP、NO和PGE2值升高，見表4。

表4 各組大鼠下丘腦cAMP、NO、PGE2含量比較

3.2.2 對血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ、GHRL、β-EP的影響 與空白組大鼠比較，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ、GHRL和β-EP含量均顯著高于空白組(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明造模成功。與模型組比較，兩個陽性對照組中，柴黃組對TNF-α的降低不明顯(P>0.05)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，柴桂組對IL-6的降低不明顯(P>0.05)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；不同濃度的小兒解表顆粒均不同程度地降低大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ、GHRL和β-EP含量(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。說明不同濃度的小兒解表顆粒均能有效抑制2，4-二硝基酚致大鼠發(fā)熱引起血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ、GHRL和β-EP值的升高，且較兩個陽性藥效果更好，見表5。

表5 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ、GHRL、β-EP含量比較

4 討論

發(fā)熱是機(jī)體抵抗入侵病原體的非特異性系統(tǒng)反應(yīng)。脂多糖(LPS)作用于機(jī)體免疫細(xì)胞釋放致熱型細(xì)胞因子，其通過體溫調(diào)節(jié)中樞，打破機(jī)體的產(chǎn)熱和散熱平衡而發(fā)熱[5]；2，4-二硝基酚為化學(xué)性質(zhì)熱源，其致熱機(jī)制為通過刺激細(xì)胞氧化過程，發(fā)熱為機(jī)體的一種保護(hù)機(jī)制，在發(fā)熱情況下能做出有益的反應(yīng)，機(jī)體的免疫功能產(chǎn)生變化[6]，其升溫后持續(xù)時間較短[7]；干酵母所致的發(fā)熱是由于注射部位的局部潰爛引發(fā)的劇烈炎癥反應(yīng)[8]。實驗結(jié)果表明，小兒解表顆粒對3種發(fā)熱模型均能發(fā)揮一定程度的解熱效果，與其發(fā)熱機(jī)制密切相關(guān)。而對2，4-二硝基酚熱源的解熱效果最佳，說明小兒解表顆粒具有發(fā)揮解熱作用迅速的特點(diǎn)。

發(fā)熱是由發(fā)熱激活物刺激機(jī)體的產(chǎn)內(nèi)生致熱源細(xì)胞釋放內(nèi)生致熱原(EP)，TNF-α是重要的EP之一[9]，IL-1β、IL-6也是常見的內(nèi)源性熱原細(xì)胞因子，可以直接或間接作用于體溫調(diào)節(jié)中樞的神經(jīng)細(xì)胞，引起體溫變化[10-12]。目前比較公認(rèn)的體溫調(diào)節(jié)中樞介質(zhì)有PGE2和cAMP[13]。實驗結(jié)果表明，小兒解表顆粒能有效降低大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6及下丘腦cAMP、PGE2。IL-1β、TNF-α、IL-6是最常見的致熱炎性因子[14-15]，由于IL-6為最終的內(nèi)生致熱原[16]，因此TNF-α的產(chǎn)生或釋放，繼而引起了IL-6的改變，使PGE2和cAMP合成減少，從而發(fā)揮解熱作用。

NO參與機(jī)體免疫防御、細(xì)菌殺傷、吸收等功能的調(diào)節(jié)，機(jī)體發(fā)熱時，與體內(nèi)自由基代謝紊亂有關(guān)。因此，當(dāng)有內(nèi)外源性損害時機(jī)體就會產(chǎn)生發(fā)熱，機(jī)體內(nèi)NO的含量明顯增加[17]。IFN是動物細(xì)胞在受到誘生刺激后產(chǎn)生的一組具有抗病毒、參與免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性的細(xì)胞因子[18]，IFN-γ是一種免疫調(diào)節(jié)的多效性因子[19]。GHRL具有抑制炎癥反應(yīng)發(fā)生、參與神經(jīng)調(diào)節(jié)的作用[20]。β-EP是一種具有免疫性作用的內(nèi)源性阿片肽，當(dāng)機(jī)體內(nèi)外環(huán)境發(fā)生巨大改變時，可參與機(jī)體各系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)過程[21]。大鼠在受到2，4-二硝基酚的刺激后，下丘腦中NO和血清中IFN-γ、GHRL、β-EP含量均顯著升高，參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，給藥后均有效降低其含量，表明小兒解表顆粒能有效降低大鼠受到的刺激，發(fā)揮解熱作用。

小兒解表顆粒具有宣肺解表、清熱解毒的功效，臨床上主要用于小兒外感風(fēng)熱所致的感冒，對不同發(fā)熱模型均有一定程度的解熱作用。各濃度小兒解表顆粒參與免疫調(diào)節(jié)，抑制2，4-二硝基酚誘導(dǎo)大鼠發(fā)熱外周細(xì)胞因子的釋放和中樞升溫介質(zhì)的釋放及相關(guān)炎癥因子含量的升高而發(fā)揮解熱作用，且通過機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，小兒解表顆粒解熱效果的優(yōu)勢明顯。小兒解表顆粒主治發(fā)熱惡風(fēng)、頭痛咳嗽、鼻塞流涕、咽喉痛癢，解熱機(jī)制的研究只是其中一部分，為了更好推廣小兒解表顆粒的臨床應(yīng)用，還需要更多更進(jìn)一步的研究。