朱紅俊，陸 曙

(南京中醫(yī)藥大學無錫附屬醫(yī)院 心血管科，江蘇 無錫 214071)

新型冠狀病毒(COVID-19)是一種全新的病毒，目前我們對其認識還不足，但COVID-19具有傳染性強、傳播速度快等特點，屬于中醫(yī)瘟疫的范疇。幾千年來，中醫(yī)藥在防治瘟疫方面積累了豐富的經(jīng)驗，并形成了獨特的理論體系，五運六氣理論是其中最重要的理論之一。

在五運六氣理論中，世界由五種穩(wěn)定的勢態(tài)和六種變化的時態(tài)構成[1]。五種勢態(tài)包括木、火、土、金、水五運；六種時態(tài)包括太陽、少陽、陽明、厥陰、少陰、太陰六氣。

根據(jù)五運六氣理論，筆者認為COVID-19病毒感染屬于土運的勢態(tài)不足；時態(tài)變化則是從太陽和少陰開始，在這個階段得到扭轉疾病就會好轉，否則，疾病就會迅速進展到太陰時態(tài)，發(fā)展成COVID-19肺炎以及危重狀態(tài)。針對這種疾病特點，中醫(yī)經(jīng)典書籍《傷寒論》中的真武湯可以有效治療。

中國中醫(yī)科學院仝小林院士認為本病特點屬于“寒濕”，這也是真武湯的適應證。國家中醫(yī)藥管理局《關于推薦在中西醫(yī)結合救治新型冠狀病毒感染的肺炎中使用“清肺排毒湯”的通知》(國中醫(yī)藥辦醫(yī)政函[2020]22號)中推薦的清肺排毒湯臨床治療COVID-19感染效果很好，其處方也含有真武湯5種草藥中的3種：白術、茯苓、生姜。

本研究基于五運六氣理論，通過網(wǎng)絡藥理學分析，探討真武湯與COVID-19肺炎在有效成分、作用靶點及通路等方面的聯(lián)系，探索其潛在的作用機制，為中醫(yī)藥治療COVID-19提供一定的理論基礎與科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 真武湯相關靶點篩選

通過計算系統(tǒng)生物學實驗室[2](https：//tcmspw.com/)檢索真武湯中5味中草藥附子、白術、白芍、茯苓、生姜作用的蛋白質靶點，并在Uniprot蛋白質數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org)，對蛋白質靶點進行規(guī)范。

1.2 COVID-19肺炎相關靶點預測篩選

以“pneumonia”為疾病關鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org)中進行數(shù)據(jù)挖掘，得到與COVID-19肺炎相關的靶點。

1.3 真武湯成分-靶點PPI網(wǎng)絡構建

利用Venny2.1.0工具取藥物靶點與疾病靶點的交集，并將交集靶點提交至String11.0 數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org)構建蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡[3]。生物種類設定為“Homo sapiens”，參數(shù)設定為默認設置，并通過MCL聚類分析挖掘核心蛋白組團。

1.4 真武湯-COVID-19肺炎交集靶點功能與通路富集分析

采用David6.8對真武湯化學成分靶點與COVID-19肺炎靶點的交集的靶點進行GO 富集分析，分析生物學過程；利用KEGG 通路分析，分析代謝通路，并進行蛋白功能區(qū)域分析。保存數(shù)據(jù)結果，以P<0.01進行篩選。

1.5 真武湯藥物成分-靶點-通路網(wǎng)絡圖的構建

檢索真武湯中5味草藥的全部化學成分，挖掘所有化學成分的相關靶點，與47個交集靶點相比對，篩選出作用于47個交集靶點相關的化學分子。

運用Cytoscape3.7.2構建真武湯成分-靶點-通路網(wǎng)絡圖，利用Cytoscape3.7.2內(nèi)置工具分析有效成分及靶點的網(wǎng)絡連接度(Degree)，并根據(jù)Degree參數(shù)判斷核心靶點及發(fā)揮藥效的主要活性成分。

2 結果

2.1 真武湯中草藥靶點的數(shù)據(jù)挖掘

經(jīng)檢索得到附子作用靶點68個、白術作用靶點259個、白芍作用靶點646個、茯苓作用靶點69個，生姜作用靶點685個，合計1 727個，刪除重復值后真武湯中5種草藥的作用靶點總計778個。

2.2 COVID-19肺炎相關靶點的數(shù)據(jù)挖掘

COVID-19肺炎相關靶點合計檢索到4 473個。采用Venny 2.1工具取真武湯草藥靶點和COVID-19肺炎相關靶點的交集，得到交集靶點47個(見表1)。

2.3 交集靶點的PPI網(wǎng)絡構建

將篩選得到的47種藥物-疾病交集靶點上傳到String11.0平臺，構建得到PPI網(wǎng)絡(見圖1)。可以發(fā)現(xiàn)PNMT(苯乙醇胺N-甲基轉移酶)、HDAC8 (組蛋白脫乙酰酶8)游離于網(wǎng)絡之外，與其他蛋白沒有相互作用。通過MCL聚類分析，提取了以GAPDH、CAT和HMOX1、TNF和ICAM1為中心的3個核心蛋白質功能團。

2.4 靶點功能與通路的富集分析

采用David6.8進行47個交集靶點功能與通路的富集分析，并以P<0.01進行篩選。GO富集分析得出107個生物學過程，其中P<0.01的生物學過程有30個；KEGG通路富集分析得出62個靶點通路(P<0.01)。蛋白功能區(qū)域SMART分析顯示，交集靶點主要作用在ZnF_C4、HOLI、S_TKc、PAC、LH2五個蛋白功能區(qū)域。表2、表3、表4分別列舉出了前10個功能、通路和5個蛋白域。

表1 真武湯草藥和COVID-19肺炎相關靶點的交集靶點

2.5 真武湯成分-COVID-19肺炎相關靶點-通路網(wǎng)絡圖的構建

經(jīng)檢索并去除不同草藥中的重復成分，總計檢索出真武湯300種不同化學分子成分。檢索出300種分子的所有靶點，與真武湯-疾病交集靶點進行比對，篩選出與47個靶點相關聯(lián)的真武湯化學分子共計95種。采用Cytoscape3.7.2軟件構建真武湯-中藥-分子-靶點網(wǎng)絡構建(見圖2)，以軟件自帶的工具進行網(wǎng)絡分析，根據(jù)Degree值進行排序。

分析結果顯示，真武湯5種中草藥中，生姜、白芍在網(wǎng)絡中的重要性較高；47個靶點中，溶菌酶、孕激素受體、組織蛋白酶D、腫瘤壞死因子、鉀電壓門控通道亞科H-2在網(wǎng)絡中重要性較高；95種化學分子中，醋酸、山柰酚、水楊酸、棕櫚酸、甘氨酸的重要性較高。表5、表6、表7分別列出了5種中藥排序、前10位的化學分子和靶點的排序。

表2 Go分析前10位交集靶點相關生物學過程

表3 KEGG分析前10位交集靶點相關通路

表4 交集靶點的蛋白域

圖1 真武湯-COVID-19肺炎交集靶點PPI網(wǎng)絡

圖2 真武湯-中藥-分子-靶點網(wǎng)絡

表5 真武湯草藥Degree值排序

表6 交集靶點關聯(lián)的真武湯化學分子Degree值前10位

表7 真武湯和COVID-19肺炎交集靶點Degree值前10位

根據(jù)分析數(shù)據(jù)，采用真武湯5味草藥的排序前10個化學分子，以及排序前10位基因靶點、生物學過程及信號通路，重新構建真武湯-中藥-分子-靶點-通路網(wǎng)絡(見圖3)。

如圖3可見，排序靠前的10靶點只能涵蓋前6個生物學過程，但可以涵蓋前10個通路。其中，TNF最為關鍵。TNF細胞因子是由巨噬細胞分泌的一種小分子蛋白，可能和COVID-19感染的炎癥反應有關。通過KEEG BRITE查詢得到TNF信號通路機制(見圖4)。圖4中可見：TNF有TNFR1、TNFR2的2個信號通路環(huán)節(jié)。其中MAPK信號通路參與了TNFR1介導的信號傳遞過程。而真武湯-COVID-19肺炎47個交集靶點中包含了MAPK信號通路中的5個靶點：MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAPK10、MAPK14。這提示，真武湯是作用于TNFR1介導的TNF信號通路。

圖3 真武湯-中藥-分子-靶點-通路網(wǎng)絡

圖4 TNF信號通路

3 討論

3.1 真武湯治療COVID-19肺炎的五運六氣理論分析

新型冠狀病毒(COVID-19)可能起源于蝙蝠，發(fā)生跨界侵襲感染人類的具體時間尚不清楚，但出現(xiàn)臨床癥狀而被發(fā)現(xiàn)、報道的時間在2019年年底，也就是主氣的六之氣太陽寒水階段。

2019是己亥之年，土運不及，厥陰司天，相火在泉?！端貑枴ちo大論》云：“凡此厥陰司天之政，氣化運行后天……天氣擾，地氣正，風生高遠，炎熱從之，云趨雨府，濕化乃行?！苯?jīng)義符合新型冠狀病毒感染濕象明顯的特點。2019年六之氣時，主氣太陽寒水、客氣少陽相火。太陽寒水人體陽氣潛藏，但客氣少陽相火其性為陽，與人體的陽氣兩氣相感，導致浮陽游離，少陰腎氣有隙，邪氣中人及入，逆沖于太陰，與濕氣交渾，故濕、熱皆本為時之常氣，濕為太陰，熱為浮陽。因此，臨床見苔膩而熱不高，但邪蘊于其中而為患，故濕為象，邪為本。

因此，從運氣學來分析，新型冠狀病毒感染是太陽少陰兩感于邪，上逆于太陰肺經(jīng)。臨床根據(jù)不同時機與臨床疾病之病象選擇麻黃附子細辛湯、真武湯等是可行性的方案。

3.2 真武湯治療COVID-19肺炎的病理及運氣理論分析

COVID-19肺炎危重癥導致死亡的原因很多，但直接的原因是缺氧。病理研究結果顯示，患者肺泡被黏液所覆蓋，氣體交換功能喪失，類似溺水[4]。從中醫(yī)角度講，這是氣機的升降出入出現(xiàn)了嚴重問題，孤陽不生，缺氧一旦出現(xiàn)，全身臟器都會衰竭，心、腦、腎首當其沖。肺傷，大氣孤絕；腦傷，神游在外；心傷，寒飲上逆陽氣外絕，腎傷，關格窿閉三焦不通。無論哪一種，預后均極差，死亡迅速。

治療的首要是祛邪。邪為疫毒，其性難了，但邪不空見，必依附于正氣，隨氣升浮，氣出邪去。濕為標，邪為本，濕去邪出，治濕不利小便非其治也。不論國家診療方案中的五苓散，還是臨床廣泛運用的三仁湯、銀翹散、甘露消毒丹、藿樸夏苓湯等，臨床均有效驗。諸方中也均有淡滲利濕、甘淡去濕等藥物。目的在于利濕導邪，而非只為祛濕。

病理分析結果表明，本病危險在肺泡阻隔，技術上可能及時進行肺灌洗可提高成功率。但這對于醫(yī)務人員的風險較大。ECMO理論上可幫助搶奪搶救時間，但盡早獲得ECMO支持較難。因此，盡早進行中醫(yī)干預非常重要。

對30例醫(yī)務人員感染癥狀的分析顯示：感染COVID-19病毒后，咳嗽占83.33%、發(fā)燒占76.67%、疲勞占70%，其他癥狀還有頭痛、惡心、嘔吐或腹瀉、呼吸困難等[5]。在發(fā)熱、干咳、乏力這三大主癥中，核心在干咳，發(fā)熱反而不是最關鍵的癥狀。干咳不好，熱退也作用有限。當然，熱退提示炎癥反應降低，有一定意義。乏力是宗氣大衰的表現(xiàn)，是機體缺氧的結果，因此，不能到氧飽和度下降才干預，有乏力就應當及時氧療。

臨床見到干咳應積極干預阻斷，也許可以大大增加獲救的機會，這是疾病規(guī)律決定的。中藥處方中合用淡滲或甘淡之品，也許可以減輕肺泡水腫炎癥滲出的可能。

大疫當前，臨床有出現(xiàn)特效方劑的可能，但疾病的復雜性也決定了依靠一方一藥防治COVID-19肺炎是有難度的，目前臨床有效的經(jīng)驗也沒有局限在一個方藥上。但臨床處方應當有主線，有核心處方。

COVID-19肺炎疾病的發(fā)展過程清晰展示了太陽外感(感毒)、內(nèi)陷少陰(免疫反應)、上逆于太陰(肺炎)的過程。因此，以真武湯為核心，配伍三甲散分消主客、射干麻黃湯治療咳嗽、麻杏石甘湯治療發(fā)熱、五苓散導利濕邪等。當然，以銀翹散替換麻杏石甘湯、三仁湯、藿樸夏苓湯、澤漆湯等替換五苓散均可行。輕癥也可以不用三甲散，但難治干咳或有內(nèi)陷跡象的須用。主客交渾，不能分消主客則邪毒難去。

3.3 真武湯治療COVID-19肺炎的網(wǎng)絡藥理學分析

如前文所言，真武湯可以作為治療COVID-19肺炎的核心處方。但這除了理論和臨床分析外，還需有現(xiàn)代機制的支持。

本文經(jīng)過網(wǎng)絡藥理學分析顯示：盡管臨床普遍將真武湯歸入附子類方，但真武湯中起主要作用的草藥是生姜、白芍、白術，而不是附子。真武湯主要化學分子是醋酸、山柰酚、水楊酸、棕櫚酸、甘氨酸、谷甾醇等；主要作用靶點是溶菌酶、孕激素受體、組織蛋白酶D、腫瘤壞死因子、鉀電壓門控通道亞科H-2等。核心蛋白質功能團分別以GAPDH、CAT和HMOX1、TNF和ICAM1為中心，蛋白功能區(qū)域集中在ZnF_C4、HOLI、S_TKc、PAC、LH2等，主要生物學過程為序列特異性DNA結合轉錄因子活性的調控、MAPK活性的激活、過氧化氫分解代謝過程、環(huán)化酶活性的正調控、上皮細胞分化等。主要干預的通路包括2型糖尿病、NOD樣受體信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、弓形體病、Fc-εRI信號通路、甲型流感等。

這個研究結果顯示了真武湯干預COVID-19肺炎的機制，也提示了COVID-19肺炎這個新型疾病的部分臨床現(xiàn)象的機理。

2型糖尿病相關通路與COVID-19肺炎高度相關。這提示糖尿病患者是COVID-19病毒的易感人群，而真武湯可以調節(jié)胰島素受體，提高糖尿病人群的抗COVID-19感染能力。

目前認為，COVID-19病毒主要是通過血管緊張素轉化酶(ACE-2)建立對人體的攻擊路徑。具有ACE-2表達的肺細胞可能是COVID-19感染期間的主要靶細胞[6]。不能忽視的是，ACE-2在體內(nèi)分布以心、腎最多，其次是腸和肺，而COVID-19病毒感染卻以肺炎為最嚴重、最突出的表現(xiàn)。因此，ACE-2介導途徑之外可能存在其他機制，這是一個合理的推測。目前認為FURIN[7]、GRP78[8]和CD147[9]也與COVID-19病毒感染途徑有關，其中，F(xiàn)URIN在GeneCards數(shù)據(jù)庫可以檢索到，也在本文檢索結果中，但不在交集靶點中。

此外，ACE-2在心、腎分布較多，但COVID-19病毒感染后肺部損傷更為突出。考慮到肺部與心、腎不同的氣體接觸環(huán)境，這個差異是否與過氧化氫酶、髓過氧化氫酶、過氧化物酶體增殖體激活受體等過氧化反應有關，也是值得關注和研究的方向。

對于不同人群COVID-19病毒易感性的研究認為，相對于女性，男性更容易感染COVID-19病毒。對30例感染COVID-19病毒的醫(yī)務人員分析顯示，男女感染比例為2∶1[5]。目前認為，這可能與ACE-2受體男女分布差異有關。本文結果顯示，孕激素受體、雄性激素受體和COVID-19肺炎相關，也許提示了COVID-19病毒感染性別分布差異的其他機制。

上述分析結果與蛋白組團的解析結果也一致。GAPDH核心蛋白功能團包括了AR、INSR，這提示了糖尿病、性別是易感因素。CAT-HMOX1核心蛋白功能團與過氧化機制相關，這提示了肺組織易感性。TNF-ICAM1核心蛋白功能團則提示了炎癥反應的中心機制。

蛋白功能區(qū)域的分析顯示，真武湯治療COVID-19病毒感染的機制與ZnF_C4、HOLI、S_TKc、PAC、LH2五個蛋白功能區(qū)域有關。其中，ZnF_C4是核激素受體中的C4鋅指。鋅指(Znf)結構域是一種相對較小的蛋白基序，它包含多個指狀突起，與靶分子相互串聯(lián)。其中一些結構域與鋅結合，具有多種RNA識別模式[10]。目前臨床治療COVID-19病毒感染的治療方案中，韓國方案包含了鋅劑治療，臨床有效，推測其機制可能與ZnF_C4蛋白功能區(qū)域有關。真武湯具有相似的效果。

至于鉀電壓門控通道亞科H-2也許與重癥COVID-19肺炎猝死有關。

此外，本文分析結果也許可以提供一些預防COVID-19病毒感染的生活建議。本文結果顯示，真武湯有效藥物中生姜排序位列第一；有效分子中醋酸、水楊酸、甘氨酸排序靠前；鋅指是關鍵蛋白功能區(qū)域。因此，生姜、食醋以及含甘氨酸、含鋅的保健食品也許可以作為預防COVID-19病毒感染的食療方法。但這應該理性看待，過猶不及，適量就好。

綜上所述，在五運六氣理論指導下，選擇真武湯治療新型冠狀病毒感染及相關肺炎具有理論基礎與科學依據(jù)，對當前疫情防控具有一定價值。