翟 赟，劉建忠，易紅磊，周 衛(wèi)，陳 俊，黃 皓，秦曉蓉

(武漢科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，湖北 武漢 430081)

吡啶是一種重要的工業(yè)生產(chǎn)原料，也是一種危害性極大的環(huán)境污染物。吡啶及其衍生物的用途非常廣泛[1]，現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)每天都會(huì)產(chǎn)生數(shù)以百萬噸的含吡啶及其衍生物的工業(yè)污水。吡啶及其衍生物具有致畸性，也是潛在的致癌物[2]，若長期暴露在含吡啶環(huán)境中會(huì)出現(xiàn)身體不適甚至患上疾病[3]。目前，對(duì)含吡啶及其衍生物污水的處理方法有物理化學(xué)法[4-6]和微生物法，物理化學(xué)法存在運(yùn)作成本高、產(chǎn)生二次污染等缺點(diǎn)[7]；而微生物法具有環(huán)境友好、運(yùn)作成本較低、可有效避免二次污染等優(yōu)點(diǎn)。Stobdan等[8]報(bào)道了一株戈登氏菌屬菌株，該菌株能在192 h內(nèi)將初始濃度為5 537 mg·L-1的吡啶完全降解，這是至今報(bào)道的微生物可降解吡啶的最高濃度；Bai等[9]和Shen等[10]報(bào)道的可降解吡啶的初始濃度分別為2 614 mg·L-1和2 600 mg·L-1；更多的報(bào)道在1 000 mg·L-1以下[11-12]，且對(duì)pH值的適用范圍較窄，多為中性或略偏堿性。

為篩選能在極端pH值環(huán)境下有效降解吡啶的菌株，將其用于吡啶污染的原位生物修復(fù)，作者以吡啶為唯一碳源和氮源，從某焦化廠污水處理系統(tǒng)中篩選吡啶高效降解菌株，檢測其生理生化特征，鑒定其分類學(xué)地位，并研究其在堿性條件下對(duì)吡啶的降解效果。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

活性污泥，采自某焦化廠污水處理系統(tǒng)。

吡啶儲(chǔ)存液(1×105mg·L-1)，抽濾滅菌后儲(chǔ)存于已滅菌和干燥的棕色試劑瓶中，備用；其余試劑均為分析純，購自武漢市各藥品經(jīng)銷商。

富集培養(yǎng)基(LB)，pH值為7.0～7.2(以2 mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié))，121 ℃高壓滅菌15 min；無機(jī)鹽培養(yǎng)基(MSM)，參照文獻(xiàn)[13]方法配制，pH值為8.0～11.0(以NaOH儲(chǔ)存液調(diào)節(jié))，121 ℃高壓滅菌15 min。

1.2 菌株的篩選

取適量的活性污泥樣品，攪拌均勻，接入經(jīng)高壓滅菌處理的LB培養(yǎng)基中，于35 ℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h；采用逐步提高吡啶濃度的方法對(duì)富集培養(yǎng)液中的菌群馴化3輪；取1 mL馴化培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液梯度稀釋后涂布吡啶濃度為500 mg·L-1的MSM瓊脂平板，于35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選取色澤、形態(tài)存在差異的菌落進(jìn)行劃線純化。

1.3 菌落的形態(tài)、生理生化特征及分子生物學(xué)鑒定

菌落的形態(tài)特征采用裸眼觀察，用游標(biāo)卡尺測定一定數(shù)目菌落的直徑，統(tǒng)計(jì)菌落的大小范圍。

采用標(biāo)準(zhǔn)的操作程序完成革蘭氏和芽孢染色，于顯微鏡下放大100倍觀察染色結(jié)果；其它生理生化特征的測定參照文獻(xiàn)[13]方法進(jìn)行，包括V-P試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)和尿酶試驗(yàn)等。

使用BLAST軟件對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫中的16S rRNA核苷酸序列進(jìn)行搜索，應(yīng)用ClustalW算法進(jìn)行逐對(duì)和多重序列比對(duì)，以核苷酸序列同源性作為初步判斷菌株種屬的依據(jù)。

1.4 堿性條件下菌株降解吡啶實(shí)驗(yàn)

1.4.1 種子液的制備

將1 mL馴化培養(yǎng)液接入吡啶初始濃度為1 000 mg·L-1的MSM培養(yǎng)基中，直到對(duì)數(shù)生長晚期。將培養(yǎng)液移入50 mL離心管，離心回收菌體；以適量不含吡啶的MSM培養(yǎng)基重懸沉淀，離心回收菌體；再以適量不含吡啶的MSM培養(yǎng)基重懸沉淀，并將懸液的OD600值調(diào)至1.0，作為種子液。

1.4.2 吡啶降解實(shí)驗(yàn)

在MSM培養(yǎng)基初始pH值分別為8.0、10.0和11.0時(shí)，考察菌株對(duì)不同初始濃度(300 mg·L-1、500 mg·L-1、700 mg·L-1、1 000 mg·L-1、1 400 mg·L-1、1 600 mg·L-1、1 800 mg·L-1、2 500 mg·L-1)吡啶的降解效果。培養(yǎng)液總體積為100 mL，吡啶按設(shè)計(jì)要求由儲(chǔ)存液經(jīng)稀釋后加入，種子液的接入量為5 mL，培養(yǎng)溫度為35 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為150 r·min-1，每隔12 h取一次樣，采用比色法測定吡啶濃度(256 nm)及菌體生物量(600 nm)，計(jì)算吡啶降解率及菌體生物量。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。

2 結(jié)果與討論

2.1 吡啶降解菌株的篩選

經(jīng)過數(shù)周的富集、馴化和分離，得到13株能以吡啶為唯一碳源和氮源生長的菌株。經(jīng)過搖瓶初步降解實(shí)驗(yàn)，編號(hào)為Py-5的菌株表現(xiàn)出突出的吡啶降解能力，將其命名為WUST-py。

2.2 吡啶降解菌株的表征

菌株WUST-py于35 ℃培養(yǎng)3 d后的菌落呈球形，表面光滑，邊緣整齊，中間凸起，呈橘黃色，菌體不透明，直徑為0.5～2.0 mm。

菌株WUST-py革蘭氏染色、H2S以及尿酶試驗(yàn)的結(jié)果均呈陽性，能夠利用葡萄糖；而甲基紅、檸檬酸、V-P試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)以及淀粉水解試驗(yàn)的結(jié)果均呈陰性，不能利用蔗糖；能形成芽孢。

菌株WUST-py的16S rRNA基因部分核苷酸序列 (1 393 bp) 由武漢擎科創(chuàng)新生物技術(shù)有限公司測定，已成功提交到GenBank，接收號(hào)為KY658456。采用BLAST軟件將該序列與提交到GenBank中其它菌株該基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)。結(jié)果表明，菌株WUST-py與紅球菌屬(Rhodococcussp.)菌株D-50和WB1的同源性均高達(dá)99%，故將該菌株鑒定為紅球菌屬。

2.3 吡啶降解菌株在堿性條件下對(duì)吡啶的降解效果

2.3.1 初始pH值為8.0時(shí)的降解效果

在MSM培養(yǎng)基初始pH值為8.0時(shí)，菌株WUST-py對(duì)不同初始濃度吡啶的降解效果如圖1所示。

1～6，吡啶初始濃度(mg·L-1)：500、1 000、1 400、1 600、1 800、2 500

由圖1a可知，在MSM培養(yǎng)基初始pH值為8.0時(shí)，菌株WUST-py分別在60 h、72 h、96 h、96 h和108 h內(nèi)將初始濃度分別為500 mg·L-1、1 000 mg·L-1、1 400 mg·L-1、1 600 mg·L-1和1 800 mg·L-1的吡啶降解至檢測不出的水平，1 800 mg·L-1是菌株WUST-py能夠完全降解吡啶的最高濃度；當(dāng)吡啶初始濃度高達(dá)2 500 mg·L-1時(shí)，菌株WUST-py對(duì)吡啶基本沒有降解作用。培養(yǎng)液中吡啶的減少很大程度上是由于吡啶的揮發(fā)所致。

由圖1b可知，在MSM培養(yǎng)基初始pH值為8.0時(shí)，菌株WUST-py對(duì)不同初始濃度吡啶的降解均出現(xiàn)明顯的生長延滯期(24～48 h)，且隨吡啶初始濃度的增大，生長延滯期逐漸延長，這是由吡啶抑制性底物的化學(xué)本質(zhì)決定的。而且由于吡啶環(huán)上引入N原子，更提高了其穩(wěn)定性和抗降解性，所以微生物降解吡啶時(shí)的生長延滯期明顯長于微生物降解苯酚時(shí)的生長延滯期。

2.3.2 初始pH值為10.0時(shí)的降解效果

在MSM培養(yǎng)基初始pH值為10.0時(shí)，菌株WUST-py對(duì)不同初始濃度吡啶的降解效果如圖2所示。

1～6，吡啶初始濃度(mg·L-1)：500、1 000、1 400、1 600、1 800、2 500

由圖2a可知，與MSM培養(yǎng)基初始pH值為8.0時(shí)的降解曲線相比較，菌株WUST-py在初始pH值為10.0時(shí)完全降解初始濃度為500 mg·L-1和1 400 mg·L-1的吡啶所需時(shí)間完全相同，均分別為60 h和96 h，但完全降解初始濃度為1 000 mg·L-1、1 600 mg·L-1、1 800 mg·L-1的吡啶所需時(shí)間則均延長了12 h。

比較圖1b和圖2b，并不能得出MSM培養(yǎng)基初始pH值的增大會(huì)導(dǎo)致菌株WUST-py生長延滯期延長的結(jié)論，在很大程度上菌株WUST-py在MSM培養(yǎng)基初始pH值為8.0和10.0時(shí)表現(xiàn)出的生長延滯期是一致的。

Mathur等[3]報(bào)道，在初始pH值為10.0時(shí)，菌株S.putrefaciens和B.sphaericus在150 h內(nèi)對(duì)100 mg·L-1吡啶的降解率分別為40%和25%。菌株WUST-py在MSM培養(yǎng)基初始pH值為10.0時(shí)對(duì)吡啶的降解能力遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)報(bào)道的兩株菌株。

2.3.3 初始pH值為11.0時(shí)的降解效果

考慮到堿性增強(qiáng)對(duì)微生物活性的影響較大，在進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)時(shí)有意降低了吡啶的初始濃度，旨在驗(yàn)證菌株WUST-py在較強(qiáng)堿性條件下降解吡啶的潛力。在MSM培養(yǎng)基初始pH值為11.0時(shí)，菌株WUST-py對(duì)不同初始濃度吡啶的降解效果如圖3所示。

1～6，吡啶初始濃度(mg·L-1)：300、500、700、1 000、1 600、2 500

由圖3a可知，當(dāng)MSM培養(yǎng)基初始pH值為11.0時(shí)，菌株WUST-py分別在36 h、48 h、60 h、72 h、108 h內(nèi)將初始濃度分別為300 mg·L-1、500 mg·L-1、700 mg·L-1、1 000 mg·L-1、1 600 mg·L-1的吡啶完全降解。MSM培養(yǎng)基初始pH值為11.0時(shí)，菌株完全降解500 mg·L-1吡啶所需的時(shí)間短于MSM培養(yǎng)基初始pH值為8.0和10.0時(shí)的，菌株完全降解1 000 mg·L-1吡啶所需的時(shí)間短于MSM培養(yǎng)基初始pH值為10.0時(shí)的，與MSM培養(yǎng)基初始pH值為11.0時(shí)的時(shí)間完全相同，很大程度上是由于不同批次種子液之間菌體活力的差異所造成的。

由圖3b可知，MSM培養(yǎng)基初始pH值增大至11.0并沒有顯著延長菌株的生長延滯期。

Mathur等[3]報(bào)道，在初始 pH 值為 11.0 時(shí)，菌株S.putrefaciens和B.sphaericus在 150 h 內(nèi)對(duì) 100 mg·L-1吡啶的降解率小于20%。菌株WUST-py在堿性條件下降解吡啶的機(jī)理有待于深入研究，初步推斷菌株WUST-py是一株產(chǎn)酸菌，能在降解吡啶的過程中產(chǎn)生大量的有機(jī)酸，并以此中和培養(yǎng)液中的堿，從而緩解了堿性條件對(duì)菌株生長強(qiáng)烈的抑制作用，有利于菌株的生長和對(duì)吡啶的降解。

菌株WUST-py降解吡啶的理想pH值為8.0，與文獻(xiàn)[14-15]報(bào)道的中性或偏堿性(pH值7～8)是微生物降解吡啶的理想pH值一致，所不同的是菌株WUST-py對(duì)初始pH值不敏感，MSM培養(yǎng)基初始pH值的增大，只是讓降解時(shí)間稍微延長，或者降解吡啶的最高濃度稍微降低。

3 結(jié)論

從某焦化廠污水處理系統(tǒng)曝氣池中篩選得到一株吡啶高效降解菌株，將其命名為WUST-py。該菌株為革蘭氏陽性菌且有芽孢，經(jīng)16S rRNA基因核苷酸序列同源性比對(duì)，鑒定為紅球菌屬(Rhodococcussp.)。在35 ℃、150 r·min-1條件下，當(dāng)MSM培養(yǎng)基初始pH值為8.0時(shí)，該菌株能在108 h內(nèi)將初始濃度為1 800 mg·L-1的吡啶完全降解；當(dāng)MSM培養(yǎng)基初始pH值為10.0時(shí)，該菌株能在120 h內(nèi)將初始濃度為1 800 mg·L-1的吡啶完全降解；當(dāng)MSM培養(yǎng)基初始pH值為11.0時(shí)，該菌株依然能夠在108 h內(nèi)將初始濃度為1 600 mg·L-1的吡啶完全降解。該菌株在用于堿性條件下吡啶污染區(qū)域的原位生物修復(fù)中具有明顯的優(yōu)勢和較大的應(yīng)用潛力。