劉媛媛 李義慧 王建功

肺癌是世界范圍內(nèi)患病人數(shù)及癌癥相關(guān)死亡人數(shù)最多的癌種[1]。2015年中國惡性腫瘤流行情況分析顯示2015年我國新發(fā)肺癌病例及肺癌死亡人數(shù)分別約為78.7萬例和63.1萬例，均居于首位[2]。而美國2019年流行病學調(diào)查研究結(jié)果預測2019年美國新發(fā)肺癌228,150例，占所有新發(fā)腫瘤的12.9%；新發(fā)腫瘤中肺癌死亡數(shù)為142,670例，占所有新發(fā)腫瘤死亡率的23.5%[3]。

AURA3[4,5]研究結(jié)果顯示奧希替尼二線治療獲得性T790M突變的非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者，其與傳統(tǒng)含鉑雙藥治療的無進展生存期（progression-free survival,PFS）分別為10.1個月vs4.4個月，總生存期（overall survival,OS）分別為26.8個月vs22.5個月。而FLURA III期[6,7]研究結(jié)果顯示，奧希替尼作為一線治療藥物時，對比標準表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs）治療局部晚期或轉(zhuǎn)移性表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）突變型NSCLC，其PFS顯著延長（18.9個月vs10.2個月），OS則為38.6個月vs31.8個月。雖然上述研究數(shù)據(jù)顯示出了奧希替尼的優(yōu)越性，但大多數(shù)患者在使用一段時間后仍出現(xiàn)耐藥問題，故本文對三代后的新一代EGFR-TKIs研究現(xiàn)狀進行綜述。

1 第三代EGFR-TKIs耐藥機制簡述

雖然EGFR-TKIs靶向藥的出現(xiàn)極大地提高了突變型NSCLC患者的生存期，但因其會產(chǎn)生耐藥性的特質(zhì)仍然為臨床工作者帶來挑戰(zhàn)。故對第三代TKIs耐藥機制進行簡述：EGFR再突變耐藥機制中，目前占比最高的耐藥機制為C797S突變[8]，此突變與T790M在等位基因上的位置決定后續(xù)治療的選擇。且研究表明奧希替尼一線治療晚期EGFR突變NSCLC時，C797S突變頻率為7%；而當奧希替尼二線治療晚期EGFR突變NSCLC時，C797S突變頻率則為14%。另外，L718Q、L844V、G796D/S/R、L792F/H/Y、G724S等罕見突變及后續(xù)治療目前也有研究指出，詳見表1[7-20]。另外，T790M減少或缺失、EGFR擴增[15]均可引起耐藥現(xiàn)象。

表1 EGFR再突變及相關(guān)治療的臨床研究Tab 1 Clinical researches of EGFR re-mutation and related treatment

EGFR非相關(guān)耐藥機制中，研究指出：間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化（mesenchymal-epithelial transition,MET）和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2,HER2）的擴增[8]、RAS突變[21]、BRAF突變、1-磷酸酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PIK3CA）突變、磷酸酶和張力蛋白類似物（phosphatase and tensin homolog,PTEN）缺失[9]、胰島素樣生長因子受體1（insulin-like growth factor 1 receptor,IGF1R）上調(diào)[22]、成纖維細胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor,FGFR）信號通路異常[8]、小細胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）轉(zhuǎn)化[23]、上皮間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化[24]（epithelial mesenchymal transition,EMT）、細胞周期基因改變[8,9]、致癌基因融合[8,9]、Bcl-2樣蛋白11缺失、極光激酶A的激活、Src通路激活、整合素-kras復合物的形成、AXL的激活、EPHA2過表達[25-31]等均導致耐藥。

2 三代后的新一代EGFR-TKIs研究進展

2.1 EAI045 Jia等[10]在用純化的EGFR L858R/T790M激酶篩選出的化合物文庫中，鑒定出了一種新的表皮生長因子受體變構(gòu)抑制劑-1（EAI001），其對EGFRL858R/T790M突變有活性。進一步的優(yōu)化得出EAI045化合物。對EAI045細胞活性的研究表明，在L858R/T790M突變的NSCLC細胞系H1975、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染L858R/T790M突變體的NIH-3T3細胞中，EAI045有效地降低了EGFR自磷酸化，但不能完全消除EGFR自磷酸化。在一組EGFR突變的Ba/F3細胞中顯示，EAI045抑制L858R/T790M和L858R突變細胞的增殖，但不抑制外顯子19del/T790M或親本Ba/F3細胞的增殖。進一步在EAI045與EGFR二聚體干擾抗體-西妥昔單抗的聯(lián)合使用中發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療可抑制L858R/T790M EGFR Ba/F3細胞的增殖以及L858R/T790M小鼠腫瘤的顯著消退，而在攜帶19del/T790M EGFR外顯子的小鼠中沒有治療反應(yīng)。且研究表明當西妥昔單抗?jié)舛葹?0 μg/mL時，EAI045抑制L858R/T790M EGFR Ba/F3細胞的半數(shù)抑制濃度（50% inhibitory concentration,IC50）約為10 nmol/L。同樣的，在L858R/T790M/C797S Ba/F3細胞、L858R/T790M/C797S突變的小鼠中，EAI045與西妥昔單抗聯(lián)合使用也觀察到類似結(jié)果。然而，這一聯(lián)合治療方式目前沒有在人體中進行過試驗，仍需要大量的研究工作。

2.2 JBJ-04-125-02 To等[32]使用迭代過程合成了EAI001的結(jié)構(gòu)類似物-化合物JBJ-02-112-05，其在異吲哚酮部分上加有5-吲哚取代基，進一步的優(yōu)化得到化合物JBJ-04-125-02，它將EAI045的2-羥基-5-氟苯基和異吲哚酮上的苯基哌嗪結(jié)合在一起。在一組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EGFRL858R、EGFRL858R/T790M或EGFRL858R/T790M/C797S突變的Ba/F3細胞株中測試表明，與EAI045聯(lián)合/不聯(lián)合西妥昔單抗相比，JBJ-04-125-02聯(lián)合/不聯(lián)合西妥昔單抗是最有效的，且其是唯一可以作為單一藥物抑制細胞增殖的化合物，且JBJ-04-125-02抑制上述三種突變的IC50分別為1.0 nmol/L、0.4 nmol/L-0.5 nmol/L和0.0 nmol/L-0.1 nmol/L。但是JBJ-04-125-02則對親本細胞Ba/F3、野生型EGFR Ba/F3細胞和EGFR19外顯子突變的Ba/F3細胞生長無抑制作用。在EGFRL858R/T790M/C797S基因工程小鼠體內(nèi)的研究表明，JBJ-04-125-02與JBJ-02-112-05均可抑制腫瘤的生長，但JBJ-04-125-02的效果較好。后續(xù)的研究表明，JBJ-04-125-02與奧希替尼聯(lián)合使用，增強了JBJ-04-125-02與突變型EGFR的結(jié)合，更加有效地抑制細胞生長，促進細胞凋亡。這一結(jié)果提示，對于EGFR突變型肺癌患者，聯(lián)合使用共價突變選擇性ATP競爭抑制劑和變構(gòu)EGFR抑制劑可能是一種有效的治療方法。

2.3 2,9-二取代8-苯硫基-9H-嘌呤化合物 Hei等[33]研究合成了31個2,9-二取代8-苯硫基/苯亞砜/芐硫基-9H-嘌呤衍生物，其中2,9-二取代8-苯硫基-9H-嘌呤類化合物-C類分為C1-C12，結(jié)果顯示化合物C1、C2和C3對HCC827細胞系中等活性，隨著取代基體積的增加，化合物C4、C5和C6的抗增殖作用明顯增強。而相比較A549細胞系，除了化合物C4和C6對A549細胞系具有中等的抑制增殖作用外，其余受試化合物對H1975和A549細胞的增殖抑制作用較弱。另外，R2位含有4-N,N-二甲氨基哌啶-1-基的化合物C9對EGFR L858R有較強的抑制作用，其對HCC827細胞的選擇性是A549細胞的340倍，且在5.0 mg/kg劑量下對已建立的裸鼠HCC827移植瘤模型有明顯的抑制作用。實驗表明2,9-二取代8-苯亞砜-9H-嘌呤類化合物D、2,9-二取代8-芐基硫代/芐基磺?；?9H-嘌呤類化合物E/F與化合物C對HCC827的抑制作用均較差。但含有8-（4-氟苯硫基）部分的化合物C12則表現(xiàn)出對EGFR L858R/T790M/C797S的中等抑制活性，IC50為114 nmol/L。這一結(jié)果提示化合物C12的后續(xù)優(yōu)化可能成為三代后的新一代EGFR-TKIs。

2.4 2,4,6-三取代吡啶并[3,4-d]嘧啶化合物 有研究[34]用6-苯氨基-吡啶[3,4-d]嘧啶取代EGFR-TKIs的藥物支架2-苯氨基嘧啶或2-苯氨基雜環(huán)-嘧啶骨架獲得新的EGFR-TKI，利用支架跳躍原理設(shè)計出化合物A。進一步對化合物A1、A2的測試表明，這兩個化合物對HCC827細胞沒有明顯的抑制增殖活性，猜測這一現(xiàn)象可能為吡啶并[3,4-d]嘧啶的6位氫原子與苯胺的2位氫原子之間的空間位阻使其不可能維持藥理構(gòu)象導致。為了克服這一問題，研究設(shè)計了化合物B-吡啶環(huán)取代苯環(huán)，吡啶-2-氨基-吡啶[3,4-d]嘧啶支架與鉸鏈區(qū)殘基Met793之間可以形成雙齒氫鍵，從而相互作用。與化合物A1和A2相比，優(yōu)化后的化合物B1、B2、B4對HCC827、H1975和A549細胞表現(xiàn)出明顯的抗增殖活性，而化合物B7（引入甲基）、B12和B13（引入三氟甲基）對HCC827細胞的殺傷活性顯著降低。化合物B29-B31因為其吡啶[3,4-d]嘧啶骨架的4位上連接了一個羥基取代物，而羥基可能與EGFR的磷酸結(jié)合位點（phosphate buffered saline,PBS）形成的額外氫鍵相互作用，所以具有提高抗增殖的作用，且化合物B30對三重突變體EGFRL858R/T790M/C797S具有顯著的抑制作用，IC50為7.2 nmol/L。一系列的實驗表明，吡啶并[3,4-d]嘧啶類支架的2位苯氨基、4位4-羥基基環(huán)己基和6位5-[4-（二甲基氨基）哌啶-1-基]-吡啶-2-基有利于化合物的抗增殖作用。故2,4,6-三取代吡啶并[3,4-d]嘧啶衍生物中化合物B30可以進一步優(yōu)化，以便成為新一代EGFR-TKIs。

2.5 2-芳基-4-氨基喹唑啉化合物 Park等[35]以2-芳基-4-氨基喹唑啉為分子核心設(shè)計發(fā)現(xiàn)了對del746-750/T790M/C797S突變體有效和特異的新一代EGFR抑制劑，其中化合物1對該突變體具有較強的酶抑制活性，且選擇性是野生型EGFR的163倍。模擬研究表明，化合物1的末端酚基分別與Met793的主鏈酰胺氮和Gln791的氨基羰基氧接收和給予氫鍵，且這兩個氫鍵受到化合物1的苯環(huán)和Met790側(cè)鏈之間相鄰的疏水作用支持。另外，化合物1中還存在Ser797的側(cè)鏈羥基和1的吡啶-3-甲胺基團之間形成的兩個氫鍵。正是由于這些氫鍵，才使得Ser797取代Cys797成為EGFR-TKIs的第三個耐藥突變。化合物1的末端酚類部分1的對位指向一個包括Val726、Met 790、Th854、Lys 745和Asp855的結(jié)合口袋，而這個結(jié)合口袋則是EGFR突變體的易受攻擊目標。在該位置上分別引入氰基、甲酯，合成化合物10、13、19，這三種化合物對del746-750/T790M/C797S突變體的選擇性是野生型的1,000多倍，IC50分別為23.7 nmol/L、46.7 nmol/L和17.9 nmol/L?？偠灾行У幕衔锱c突變殘基Met790和Ser797形成的強烈的相互作用可以用來解釋相關(guān)化合物對三重突變體的抑制活性。

2.6 4-氨基吡唑嘧啶類化合物 Engel等[36]在研究將Bruton酪氨酸激酶（Bruton's tyrosine kinase,BTK）抑制劑4-氨基吡唑并嘧啶支架作為一類新型EGFRT790M突變抑制劑時，合成了1a-1c三種化合物。這三種化合物均對攜帶EGFRL858R/T790M耐藥的非小細胞肺癌細胞株H1975有較好的抑制效果，而對野生型EGFR細胞株A431的抑制效果較差。進一步的研究表明，化合物1c對獲得性耐藥L858R/T790M/C797S顯示出中等抑制作用，IC50為88 nmol/L。其親和力約是對EGFRL858R/T790M/C797S沒有明顯作用的1a和1b的20倍。這一結(jié)果提示4-氨基吡唑并嘧啶支架可能是后續(xù)藥物研發(fā)的機制之一。

2.7 三取代咪唑類化合物 Günther等[37]在高效可逆p38抑制劑的基礎(chǔ)上設(shè)計出了三取代咪唑類化合物。這類化合物對EGFRL858R/T790M/C797S三重突變體有抑制作用。實驗表明，化合物11d/e/h對野生型EGFR、L858R突變型EGFR的IC50值均低于0.5 nmol/L，對L858R/T790M突變型EGFR的IC50值分別為12.5 nmol/L、8.4 nmol/L和6.6 nmol/L，而對L858R/T790M/C797S三重突變型EGFR的IC50值則分別為7.64 nmol/L、8.8 nmol/L和21.1 nmol/L。研究基于p38 mitogen-activated protein kinase（MAPK）抑制劑的靶外打擊以及后續(xù)操作，合成了一系列具有7-氮雜環(huán)己烷鉸鏈結(jié)合基序的三取代咪唑類化合物，且對化合物11的分子模擬表明，其可與ATP結(jié)合位點可逆性結(jié)合，在此基礎(chǔ)上設(shè)計出了對L858R/T790M/C797S三重突變體等效的低納米抑制劑11d和11e，這些化合物不需要形成共價鍵就可以獲得高效力。這些研究有力地支持了三取代咪唑類化合物作為三代后的新一代EGFR抑制劑克服三重突變的可能性。

2.8 吡咯嘧啶類化合物 Lategahn等[38]將吡咯嘧啶類支架作為新型、突變型選擇性共價抑制劑進行了一系列檢測，合成了第一組吡咯嘧啶類EGFR抑制劑（包括12種化合物，并對其溶解性和細胞活性進行了優(yōu)化）。且這類支架利用Mitsunobu反應(yīng)進一步衍生得到了容易分離的3-取代吡咯嘧啶-4-酮和4-取代吡咯嘧啶的混合物，并合成了第二組吡咯嘧啶類EGFR抑制劑。研究表明共價鍵的形成可有效抑制突變體的活性。依據(jù)這一現(xiàn)象，研究者設(shè)計了化合物17a（第一組吡咯嘧啶類EGFR抑制劑的一種），其對EGFR L858R、EGFR L858R/T790M的IC50分別為2.3 nmol/L和4.0 nmol/L，且對野生型EGFR有選擇性（IC50為15 nmol/L）。Western blot顯示17a可抑制EGFR及其下游級聯(lián)蛋白的磷酸化水平。第二組吡咯嘧啶類EGFR抑制劑包括N型烷基化吡咯嘧啶類化合物29a-l、O型烷基化吡咯嘧啶類化合物19a-h，這兩類化合物均與EGFR中的Cys797共價結(jié)合，具有可逆結(jié)合特性。前者對EGFRL858R/T790M/C797S突變的IC50值＞110 nmol/L，而后者的IC50值＜50 nmol/L。其中活性最強的是化合物19 g、化合物19 h（在4位上分別含有異丙基醚和異丁基醚），IC50值均約為9 nmol/L，且兩者可以與雙突變體EGFRT790M/C797S形成配合物。研究指出N型和O型烷基化吡咯嘧啶類化合物有較高的抗EGFR活性，與第一、二、三代EGFR-TKIs相比，上述化合物具有更好的生化效力。因此吡咯嘧啶類化合物可作為新一代EGFR抑制劑的研究方向。

3 展望

第三代EGFR-TKIs雖然有一定的治療效果，但因其不可避免出現(xiàn)的耐藥性，且存在異質(zhì)性，導致仍有一部分耐藥機制未知。以耐藥機制為切入點，并將其作為相應(yīng)靶點從而研制出新的治療藥物。雖然目前臨床前研究已出現(xiàn)幾種有效的可被稱之為三代后的新一代EGFR-TKIs，但是尚未在人體中進行相關(guān)試驗。此外，三代EGFR-TKIs耐藥機制不僅包括EGFR的再突變，還包括更復雜的耐藥機制如：MET、RAS等通路的活化、EMT及病理類型的轉(zhuǎn)化等。因此，除抑制EGFR信號通路內(nèi)的耐藥突變外，聯(lián)合治療可能也是克服EGFR通路外耐藥的選擇方法之一。