冉詠蘭,闞建全

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶， 400715)

蘿卜(Raphanussati usL.)為十字花科蘿卜屬作物，是我國重要的大眾化蔬菜，其肉質(zhì)根富含植物蛋白、維生素C、膳食纖維和多種微量元素，具有很高的食用和藥用價值。2017年我國蘿卜種植面積達(dá)130萬hm2，總產(chǎn)量達(dá)4501萬t[1]。地膜因其保溫保墑、抑制雜草等功能，在蘿卜種植中被廣泛使用，2015年我國地膜用量145.5萬t，覆蓋面積1831.8萬hm2[2]，鄰苯二甲酸酯類化合物(phthalic acid easters，PAEs)作為增塑劑被添加到塑料中，由于在環(huán)境中具有性質(zhì)穩(wěn)定，半衰期長，生物蓄積毒性較強(qiáng)等特性[3]，美國國家環(huán)保局已將鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(diethylhexyl phthalate,DEHP)、鄰苯二甲酸二丁酯(di-n-butyl ortho-phthalate ,DBP)、鄰苯二甲酸丁基芐基酯(benzyl-n-butyl ortho-phthalate ,BBP)、鄰苯二甲酸二甲酯(dimethyl ortho-phthalate ,DMP) 、鄰苯二甲酸正二辛酯(di-n-octyl ortho-phthalate ,DnOP)、鄰苯二甲酸二乙酯(dicthyl ortho-phthalate ,DEP) 6種 PAEs 列為優(yōu)先控制的有毒污染物[4-5]。DEHP作為一種常見的PAEs，在農(nóng)業(yè)土壤中的濃度高于其他種類的 PAEs，有研究表明廣州、深圳蔬菜基地土壤中6種PAEs的總含量為3.00～45.67 mg/kg，其中DEHP含量為1.86～25.12 mg/kg[6]；山東省青島市花生、棉花基地土壤DEHP含量最高達(dá)20.69 mg/kg[7]；山東省萊州市農(nóng)田土壤中6種PAEs的總含量為4.63～15.59 mg/kg，DEHP含量為12.46～35.77 mg/kg[8]，顯著高于美國密西西比三角洲、丹麥和荷蘭等歐美國家和地區(qū)[9]。DEHP通過土壤進(jìn)入農(nóng)作物中，楊延杰等[10]研究發(fā)現(xiàn),不同濃度的DEHP對蘿卜種子萌發(fā)和幼苗根系生長呈現(xiàn)低促進(jìn)高抑制的機(jī)制。CHANG等[11]研究發(fā)現(xiàn)DEHP濃度的增加會影響蠶豆植物的DNA多態(tài)性，并對蠶豆苗造成可誘導(dǎo)急性氧化損傷并產(chǎn)生遺傳毒性作用。近年來，PAEs在土壤中的含量和成分[12-14]、在土壤-蔬菜中的遷移[15]、分配[16]、富集[17]、對蔬菜生長的影響[18-19]等方面研究較多，而對于植物對PAEs的耐逆相關(guān)功能基因組學(xué)研究較少，二代高通量測序方法-轉(zhuǎn)錄組測序(RNA sequencing,RNA-Seq)技術(shù)因其精準(zhǔn)度高、成本低，成為探索植物體響應(yīng)不同脅迫的基因網(wǎng)絡(luò)分析的理想工具[20]，本研究利用RNA-Seq技術(shù)，對DEHP污染后的蘿卜塊根進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，分析蘿卜塊根的差異表達(dá)基因和代謝通路，探究蘿卜響應(yīng)DEHP脅迫的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試種子,青島蓉睦善良種有限公司“九斤王”;供試土壤,重慶市潼南區(qū)前進(jìn)村綠色蔬菜基地。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 盆栽試驗(yàn)

分別稱取DEHP 50、150和250 mg，溶于丙酮(分析純)，再加入5 kg原始土壤中拌勻，即制得3個污染濃度的土壤DEHP-l(10 mg/kg)、DEHP-m(30 mg/kg)和 DEHP-h(50 mg/kg)，在陰涼通風(fēng)處放置24 h，以去離子水調(diào)至最大田間持水量的70%，并將其置于溫室內(nèi)平衡15 d，于2019年4月3日播種，2019年6月8日收獲，全生育期為69 d。

1.2.2 透射電鏡觀察

將蘿卜根部組織樣品切成0.1 mm3的小塊，快速放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的戊二醛中固定，抽真空使樣品下沉，4 ℃下固定24 h，利用0.1 mol/L磷酸緩沖液沖洗3次，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鋨酸固定4 h，經(jīng)乙醇梯度脫水后用Epon812環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機(jī)切片,經(jīng)醋酸雙氧鈾-梓檬酸鉛雙重染色后在透射電鏡下觀察、拍照。

1.2.3 RNA 的提取和Read文庫制備

采用Omega Plant RNA kit 試劑盒法提取蘿卜塊根中的RNA，將經(jīng)不同DEHP濃度處理的蘿卜樣品的總 RNA送廣州基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行Illumina HiSeqTM測序工作。

1.2.4 測序數(shù)據(jù)處理

將原始下機(jī)數(shù)據(jù)過濾后獲得的reads比對到參考基因組上，利用Cufflinks組裝得到已知的轉(zhuǎn)錄本與新的轉(zhuǎn)錄本，并對得到的基因進(jìn)行表達(dá)量分析與統(tǒng)計(jì)，分析差異表達(dá)基因(differentially expressed genes, DEGs)和功能富集途徑。

1.2.5 樣本間差異表達(dá)基因篩選

使用edgeR軟件對其進(jìn)行DEGs分析，篩選出不同處理樣品之間的DEGs，并對其顯著性水平(P<0.05)進(jìn)行分析，將未受污染的蘿卜作為對照組(CK)，計(jì)算出不同濃度DEHP污染下的上調(diào)基因數(shù)(Log2ratio>2)和下調(diào)基因數(shù)(Log2ratio<2)。上調(diào)基因表明在DEHP脅迫下基因表達(dá)量大于對照組，或某些不表達(dá)的基因在DEHP脅迫下開始表達(dá)，說明這部分基因多與DEHP脅迫的耐性有關(guān)。下調(diào)基因表明在DEHP脅迫下基因表達(dá)量小于對照組，說明DEHP脅迫對植物的系統(tǒng)造成了傷害，使得活性下降，表達(dá)量降低，大多與生理功能相關(guān)。

1.2.6 基因本體(Gene Ontology，GO)功能注釋與分析

以P≤0.05 為閾值，將篩選到的DEGs利用GO seq軟件[21]進(jìn)行GO富集分析，滿足此條件的GO term 為顯著富集的GO term，并以此來確定差異表達(dá)基因所行使的主要生物學(xué)功能。本試驗(yàn)通過研究DEGs在 GO中的分布狀況，了解不同濃度DEHP污染處理下各蘿卜樣本在基因功能層面上的差異。

1.2.7 Pathway途徑分析

利用R語言軟件，篩選條件以Q值≤0.05 為閾值，滿足此條件為在DEGs中顯著富集的pathway，并在京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)中進(jìn)行注釋[22-23]，通過KEGG 代謝途徑顯著性富集分析來確定DEGs參與的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和生化代謝途徑。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計(jì)分析和繪圖，利用 t-檢驗(yàn)分析各污染濃度蘿卜的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 DEHP脅迫對蘿卜塊根超微結(jié)構(gòu)的影響

細(xì)胞壁作為植物的特有結(jié)構(gòu)，有維持細(xì)胞形狀、運(yùn)輸物質(zhì)和傳遞信息的作用，也是外界物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的第一屏障[24]，由圖1可知，對照組中的蘿卜細(xì)胞壁界限清晰，整齊平滑，厚薄均勻；在10 mg/kg DEHP處理下蘿卜細(xì)胞壁變厚；在30 mg/kg DEHP處理下蘿卜細(xì)胞壁繼續(xù)加厚，厚薄不均，并出現(xiàn)質(zhì)壁分離的現(xiàn)象，細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間有深色顆粒沉淀物；在50 mg/kg DEHP處理下蘿卜細(xì)胞壁變形嚴(yán)重，有斷裂的現(xiàn)象，質(zhì)壁分離現(xiàn)象加重，并在細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間有更多的深色顆粒沉積物。

圖1 DEHP對蘿卜根部細(xì)胞壁超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effect of DEHP on cell wall ultrastructure of radish

由圖2可知，對照組中的蘿卜線粒體結(jié)構(gòu)清晰，呈圓形或橢圓形，雙層被膜和內(nèi)部嵴結(jié)構(gòu)完整；在10 mg/kg DEHP處理下蘿卜線粒體數(shù)量減少，體膜結(jié)構(gòu)變化不大；在30 mg/kg DEHP處理下蘿卜線粒體數(shù)量進(jìn)一步減少，出現(xiàn)空泡化，內(nèi)部嵴的數(shù)量變少，嵴突變得模糊；在50 mg/kg DEHP處理下蘿卜線粒體損傷更加嚴(yán)重，內(nèi)部嵴斷裂，線粒體變模糊解體。線粒體結(jié)構(gòu)的損傷將會影響植物體三羧酸循環(huán),使細(xì)胞呼吸減弱，抑制信號傳遞，還會影響各種酶的活動。

圖2 DEHP對蘿卜根部細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effect of DEHP on mitochondria ultrastructure of radish

2.2 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果統(tǒng)計(jì)與分析

2.2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

信息分析前對下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控與過濾，由表1可知，通過對樣品的轉(zhuǎn)錄組測序，分別獲得50 071 200、52 707 576、47 261 670和48 651 920條Clean Reads，經(jīng)過整理和篩選分析，得到HQ Clean Reads，分別為49 143 966、51 612 986、46 319 318和47 567 124條，各樣本的HQ Clean Reads均有所下降，相對于Clean Reads，篩選后的HQ Clean Reads占98.15%、97.92%、98.01%和97.77%。4個樣品的Q20均大于98%，Q30均大于95%，測得序列的GC含量占47%以上，說明轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量較高，可以進(jìn)行下一步的數(shù)據(jù)整理和分析。

表1 數(shù)據(jù)信息統(tǒng)計(jì)表Table 1 Statistics of RNA-Seq

2.2.2 差異表達(dá)基因分析

以P<0.05為篩選條件篩選差異表達(dá)基因后作火山圖，由圖3可知：紅色點(diǎn)代表上調(diào)基因，綠色點(diǎn)代表下調(diào)基因，黑點(diǎn)代表非差異基因。在10 mg/kg處理下，與CK相比,產(chǎn)生9 885個差異表達(dá)基因，其中上調(diào)差異表達(dá)基因5 993個，下調(diào)差異表達(dá)基因3 892個；在30 mg/kg處理下，相比CK產(chǎn)生9 385個差異表達(dá)基因，其中上調(diào)差異表達(dá)基因6 346個，下調(diào)表達(dá)基因3 039個，上調(diào)基因數(shù)量大于下調(diào)基因數(shù)量；在50 mg/kg處理下，相比CK產(chǎn)生11 880個顯著差異表達(dá)基因，其中上調(diào)差異表達(dá)基因7 336個,下調(diào)差異基因4 544個。3個濃度污染下的上調(diào)基因數(shù)量均大于下調(diào)基因數(shù)量。

a-10 mg/kg處理;b-30 mg/kg處理;c-50 mg/kg處理圖3 差異表達(dá)基因火山圖Fig.3 Differential expressed gene olcano map

通過維恩圖(圖4)分析，在5 101個差異重疊基因中，有4 858個差異基因表達(dá)趨勢一致，243個差異基因表達(dá)趨勢不一致，不一致的基因中CK s DEHP-l上調(diào)基因86個， CK s DEHP-m上調(diào)基因129個， CK s DEHP-h上調(diào)基因153個。隨著污染濃度的加大，越來越多的下調(diào)基因變?yōu)樯险{(diào)，說明蘿卜為適應(yīng)或抵抗DEHP脅迫，讓更多基因參與到應(yīng)答反應(yīng)中。CK s DEHP-l中上調(diào)的86個基因主要是與蛋白激酶、脫氫酶、調(diào)節(jié)蛋白、轉(zhuǎn)錄蛋白、結(jié)合蛋白、過氧化物酶、谷胱甘肽等相關(guān)的基因[25-29]，這些基因的上調(diào)表達(dá)都與蘿卜塊根的抗性相關(guān)，說明其可以抵御一定的DEHP脅迫，但隨著污染濃度的增加，86個基因在CK s DEHP-m中有8個基因變?yōu)橄抡{(diào)，在CK s DEHP-h有83個基因變?yōu)橄抡{(diào)，說明隨著污染濃度的增加，DEHP脅迫會對蘿卜造成嚴(yán)重傷害，也說明了蘿卜對DEHP的抵御是有限度的。

圖4 差異表達(dá)基因維恩圖Fig.4 Differential expressed gene enn diagram

2.2.3 差異表達(dá)基因的GO富集分析

研究發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，3個DEHP污染濃度處理后分別有2 280、2 126和2 030個DEGs被GO注釋到生物過程(biological process，BP)、細(xì)胞組分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)3個大類別，由圖5可知，在富集最顯著的前40個GO term中，集中在生物進(jìn)程的GO term有17個，集中在細(xì)胞組分的GO term有12個，集中在分子功能的GO term有11個。其中細(xì)胞過程、代謝過程、單有機(jī)體過程和刺激響應(yīng)是生物過程大類中最主要富集的通路，細(xì)胞成分、細(xì)胞區(qū)域和細(xì)胞器是細(xì)胞組分大類中最主要富集的通路，催化活性和結(jié)合是分子功能大類中最主要富集的通路。

1-代謝過程；2-定位；3-生長；4-細(xì)胞成分組織或生物發(fā)生；5-生物調(diào)控；6-繁殖；7-免疫系統(tǒng)過程；8-生殖過程；9-節(jié)律過程；10-多細(xì)胞組織過程；11-生物粘附；12-多生物過程；13-細(xì)胞過程；14-信號系統(tǒng)15-發(fā)展過程；16-單有機(jī)體過程；17-刺激響應(yīng)；18-膜封閉腔；19-細(xì)胞連接；20-細(xì)胞外基質(zhì)；21-膜部件；22-細(xì)胞成分；23-細(xì)胞區(qū)域；24-高分子絡(luò)合物；25-膜；26-細(xì)胞器；27-細(xì)胞器部分；28-細(xì)胞外區(qū)；29-細(xì)胞外基質(zhì)成分；30-信號傳感器活動；31-抗氧化活性；32-核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性；33-轉(zhuǎn)錄因子活性，蛋白質(zhì)結(jié)合；34-催化活性；35-結(jié)構(gòu)分子活性；36-結(jié)合；37-電子載流子活性；38-轉(zhuǎn)運(yùn)活性；39-分子功能調(diào)節(jié)劑；40-分子換能器活性圖5 DEHP污染下蘿卜差異表達(dá)基因的GO功能分類Fig.5 Gene Ontology functional classification of differentially expressed genes after DEHP treatment

2.3 差異表達(dá)基因KEGG富集分析

由表2可知，將KEGG數(shù)據(jù)庫作為參考，與空白對照組相比，10 mg/kg污染濃度下有2 133個DEGs注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫中的129個分類代謝途徑，顯著富集的有20個通路(P<0.05)；30 mg/kg污染濃度下有1 991個DEGs注釋到KEGG 數(shù)據(jù)庫中的130個分類代謝途徑，顯著富集的有22個通路(P<0.05)；50 mg/kg污染濃度下有2 641個DEGs注釋到 KEGG 數(shù)據(jù)庫中的130個分類代謝途徑，顯著富集的有20個通路(P<0.05)。

其中ko00270、ko00591、ko00592、ko00400、ko00260等通路包含的差異基因較多，這些通路主要涉及半胱氨酸與蛋氨酸代謝、亞油酸、α-亞麻酸代謝、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成和甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝等過程。

2.4 蘿卜中半胱氨酸與蛋氨酸代謝的反應(yīng)

通過KEGG注釋，分別有61、61、78條unigenes被注釋到代謝所在的半胱氨酸與蛋氨酸代謝的KEGG通路，其中支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(2.6.1.42)、精胺合成酶(2.5.1.16)、1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶(4.4.1.14)和蛋氨酸γ裂解酶(4.4.1.11)在各污染處理組中均上調(diào)；丙氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶(2.6.1.44)在10和30 mg/kg處理下，表達(dá)基因有上調(diào)，在50 mg/kg處理下表達(dá)基因有上調(diào)/下調(diào)的趨勢；胞嘧啶-5-甲基轉(zhuǎn)移酶(2.1.1.37)和硫代硫酸鹽/3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶(2.8.1.2)在各污染處理組中均下調(diào)。其中精胺合成酶(spermine synthase,SPMS)、丙氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶與抵御外部環(huán)境脅迫相關(guān)[30-31]，胞嘧啶-5-甲基轉(zhuǎn)移酶與植物生長發(fā)育相關(guān)[32]。

光呼吸是光合作用的補(bǔ)充反應(yīng)，當(dāng)受到外界脅迫時，植物會通過光呼吸消耗體內(nèi)的乙醛酸，降低對細(xì)胞的傷害，提高植物抗病性和抗逆性[33-34]。光呼吸代謝時，轉(zhuǎn)氨酶作為氨基酸代謝中重要的催化劑促成乙醛酸的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)，有研究表明丙氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine-glyoxylate transaminase，GAT)定位于線粒體中，與乙醛酸代謝途徑相關(guān)并參與了光呼吸途徑，小麥在低溫、脫落酸、干旱和高鹽處理下GAT的表達(dá)量均隨脅迫的加大呈拋物線變化[35]。本試驗(yàn)中隨著DEHP污染濃度的增加，蘿卜塊根上調(diào)GAT來加大光呼吸作用，抵御DEHP脅迫，但當(dāng)濃度增加到50 mg/kg時，線粒體受到嚴(yán)重?fù)p傷甚至解體，導(dǎo)致GAT下降,影響蘿卜耐受性，這與透射電鏡中觀察到線粒體的變化一致。

多胺(polyamines，PAs)作為一種低分子量脂肪族的含氮堿廣泛存在于生物體中，有研究表明植物中的多胺作為可溶性物質(zhì)、核苷酸和細(xì)胞膜的保護(hù)物質(zhì)、活性氧清除劑等來參與細(xì)胞的抗逆過程，抵御外部環(huán)境脅迫[6,37]。SPMS在多胺合成后期將腐胺催化合成精胺，WI等[38]研究發(fā)現(xiàn)多胺含量的增加可以提高馬鈴薯耐非生物脅迫的能力，TANOU等[39]研究發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫下柑桔通過上調(diào)PAs表達(dá)量改變其氧化狀態(tài)。本試驗(yàn)中在DEHP脅迫下蘿卜中SPMS表達(dá)量增加，且中高濃度污染下參與基因多于低濃度污染，表明蘿卜可通過調(diào)節(jié)多胺含量提高逆境抗性。

DNA甲基化是生物基因組中普遍的共價修飾方式，參與了基因的表達(dá)調(diào)控、胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、基因組印跡、X染色體失活等，甲基化水平不足將會影響植物生長發(fā)育，胞嘧啶-5-甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA (cytosine-5)-methyltransferase，5-MeC METI)可以識別特異DNA堿基序列并催化其進(jìn)行甲基化修飾。大量研究表明,在溫度、化學(xué)試劑、金屬等脅迫下會引起植物DNA甲基化狀態(tài)和程度的變化[40-42]，F(xiàn)INNEGAN等[43]在煙草中轉(zhuǎn)入甲基轉(zhuǎn)移酶反義基因MET1，發(fā)現(xiàn)其DNA甲基化水平下降，進(jìn)而影響植株開花時間、生殖能力和花葉形態(tài)。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)各污染組DEHP脅迫下5-MeC METI表達(dá)量均下調(diào)，使得DNA甲基化水平下降，同時METI表達(dá)量的下調(diào)會間接影響纖維素合成酶的表達(dá)進(jìn)而導(dǎo)致纖維素合成下降[44]，在透射電鏡觀察中，蘿卜塊根細(xì)胞壁隨污染濃度的增加而變形甚至斷裂，降低了細(xì)胞抵御外界脅迫的能力。

表2 DEHP差異表達(dá)基因的 KEGG 富集分析Table 2 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes under DEHP pollution

續(xù)表2

2.5 蘿卜中α-亞麻酸代謝的反應(yīng)

通過KEGG注釋，各DEHP污染處理組分別有25、23、27條unigenes被注釋到代謝所在的α-亞麻酸代謝的KEGG通路，脂氫過氧化物裂解酶(HPL1)表達(dá)基因在各污染處理組中均下調(diào)；乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶(2.3.1.16)在10和30 mg/kg處理下，表達(dá)基因均有上調(diào)/下調(diào)的趨勢，在50 mg/kg處理下表達(dá)基因全部變?yōu)樯险{(diào)；12-氧-植物二烯酸還原酶(1.3.1.42)在10 mg/kg處理下表達(dá)基因上調(diào)，在30和50 mg/kg處理下，表達(dá)基因有上調(diào)/下調(diào)的趨勢。其中脂氫過氧化物裂解酶、乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶和12-氧-植物二烯酸還原酶均與蘿卜生長發(fā)育和品質(zhì)有關(guān)。

植物在脂氧化過程中通過脂氫過氧化物裂解酶(hydroperoxide lyase，HPL)催化脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)的反應(yīng)產(chǎn)物脂氫過氧化物(HPOD或HPOT)裂解生成短鏈醛和含氧酸[45]，HPL裂解產(chǎn)物不僅可以揮發(fā)出植物特殊的芬芳?xì)馕?，還參與植物抗病蟲、抗傷害和抗逆的防御響應(yīng)。有研究表明HPL的催化反應(yīng)與脂類代謝系統(tǒng)密切相關(guān)，其活性會被脂類物質(zhì)的抗氧化劑所抑制，同時HPL活性基團(tuán)中的Fe3+還能與脂氫過氧化物作用形成烷氧基和鐵羥絡(luò)合物，說明金屬螯合劑也能抑制其催化活性[46]。在DEHP的脅迫下，蘿卜中脂代謝活動加強(qiáng)，抑制了HPL活性，導(dǎo)致其基因表達(dá)下調(diào)，同時降低了特異氣味形成，影響蘿卜質(zhì)量。

乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶(acetyl-CoA C-acetyltransferase，AACT)是甲羥戊酸(me alonate，M A)合成的重要酶類，通過催化蛋白質(zhì)的?；腿ヵ；瘉硇揎椫参锏鞍踪|(zhì)，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)生物活性和基因表達(dá)，調(diào)控植物的生長發(fā)育及主要活性成分的合成[47]。本試驗(yàn)中AACT表達(dá)量的變化說明DEHP脅迫誘發(fā)了蘿卜的防御反應(yīng)，與低中濃度相比，高濃度處理后AACT表達(dá)量增加，加快了M A的合成，并通過M A來抵御DEHP脅迫。

茉莉酸類化合物是植物體內(nèi)產(chǎn)生的天然植物激素,包括茉莉酸、茉莉酸甲酯及茉莉酸衍生物[48]，在植物受到外界脅迫時作為信號分子調(diào)控下游相關(guān)基因的表達(dá)水平，宋云等[49]研究發(fā)現(xiàn)茉莉酸不僅可以調(diào)控植物生長發(fā)育，還在植物受到機(jī)械傷害、病蟲害等脅迫下作出防御響應(yīng)。12-氧-植物二烯酸還原酶(12-oxophytodienoic acid reductase，OPR)是茉莉酸生物合成(十八烷碳烯酸代謝途徑)的正調(diào)控因子，有研究表明植物中的OPR在各種生物和非生物脅迫下具有特異性表達(dá)模式，小麥在受鹽脅迫時OPR1基因(TaOPR1)上調(diào)表達(dá)以響應(yīng)各種刺激因子，而OPR2基因(TaOPR2)則因高鹽處理表達(dá)受到抑制[50]。香蕉中12-氧-植物二烯酸還原酶(MaOPR)在乙烯、枯萎病脅迫下表達(dá)上調(diào)以響應(yīng)脅迫，特別在莖和果實(shí)中表達(dá)量較高[51]。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)蘿卜的OPR在低濃度污染時表達(dá)基因上調(diào)，說明蘿卜通過激活茉莉酸信號抵御外來脅迫，但隨著污染濃度增加，OPR的部分表達(dá)基因變?yōu)橄抡{(diào)，也說明蘿卜抵御脅迫的能力是有限度的。

2.6 蘿卜中亞油酸的反應(yīng)

通過KEGG注釋，各DEHP污染處理組分別有11、10、15條unigenes被注釋到代謝所在的亞油酸的KEGG通路，各DEHP污染處理組中，LOX(1.13.11.12)在10 mg/kg處理下，表達(dá)基因下調(diào)，30和50 mg/kg處理下，表達(dá)基因有上調(diào)/下調(diào)的趨勢。在各處理組的分泌型磷脂酶A2(3.1.1.4)表達(dá)基因均上調(diào)，亞油酸9S脂氧合酶(1.13.11.58)表達(dá)基因均有上調(diào)/下調(diào)的趨勢。其中LOX、分泌型磷脂酶A2均與抵御外部環(huán)境脅迫相關(guān)。

LOX能催化植物體內(nèi)酚基甘油酯產(chǎn)生脂肪酸衍生物，是植物脂肪酸氧化的一條重要途徑，一般在逆境條件下啟動，與植物種子的萌發(fā)與老化、生長發(fā)育進(jìn)程、抗逆境脅迫和特有風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生密切相關(guān)[52]。植物發(fā)生超敏(hypersensiti e response，HR)反應(yīng)時，細(xì)胞膜崩裂、電解質(zhì)滲漏、細(xì)胞降解，細(xì)胞膜系統(tǒng)的破壞可能主要源于膜脂的過氧化反應(yīng)，LOX是植物體內(nèi)膜脂過氧化反應(yīng)中的重要酶類，其在催化不飽和脂肪酸生成氫過氧化物脂肪酸的同時，產(chǎn)生大量的活性氧，后者參與細(xì)胞膜脂的過氧化，破壞細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞壞死。有研究表明,用放線菌酮抑制LOX的誘導(dǎo)后，也抑制了HR反應(yīng)。同時，LOX還能催化植物防衛(wèi)反應(yīng)信號分子的合成，通過脂氧合酶途徑合成的茉莉酸甲酯、茉莉酸酮酸和7-異茉莉酸都可激活植物的防衛(wèi)基因[53]。在DEHP的污染下，各處理組的LOX均有下調(diào)，表明蘿卜通過降低LOX來應(yīng)對DEHP的脅迫，但中高污染濃度下LOX部分上調(diào)，產(chǎn)生活性氧，導(dǎo)致蘿卜防衛(wèi)基因下調(diào)和細(xì)胞膜破損，所以隨著污染濃度增加，蘿卜塊根細(xì)胞壁開始變形甚至斷裂，并出現(xiàn)質(zhì)壁分離。

磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)作為一類能水解磷脂甘油C-2酯鍵生成游離脂肪酸以及溶血磷脂的酶類廣泛存在于植物組織中，在細(xì)胞磷脂消化、新陳代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及宿主防御等生理過程中起重要作用。有研究表明PLA2表達(dá)調(diào)節(jié)與傷害[54]和病原侵染[55]時的信號傳導(dǎo)有關(guān)； CHAPMAN[56]研究發(fā)現(xiàn)，植物PLA2會在受傷或逆境時被激活，且表達(dá)量顯著增加；YOUNG等[57]發(fā)現(xiàn)在水稻黃單胞菌脅迫下，體內(nèi)磷脂代謝活動加強(qiáng)，PLA2活性的積累還可以迅速增加植物體內(nèi)茉莉酸含量，對DEHP脅迫作出防御響應(yīng)，但PLA2的活化也會導(dǎo)致質(zhì)膜的破壞，這與透射電鏡觀測結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本研究以蘿卜為研究對象，探究了不同濃度DEHP污染下蘿卜與空白組的亞顯微結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄組的差異。亞顯微結(jié)構(gòu)研究表明，DEHP脅迫會破壞蘿卜塊根細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞壁加厚變形、部分?jǐn)嗔?，線粒體嵴數(shù)減少，內(nèi)部嵴斷裂變模糊甚至解體，且污染濃度越大，破壞越嚴(yán)重。應(yīng)答轉(zhuǎn)錄組分析研究表明，通過過轉(zhuǎn)錄組測序，分別獲得9 885、9 385和11 880條顯著差異表達(dá)基因，且上調(diào)基因數(shù)量均大于下調(diào)基因數(shù)量。通過GO數(shù)據(jù)注釋發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因在GO中參與最多的生物過程是細(xì)胞過程、代謝過程、單有機(jī)體過程和刺激響應(yīng)，參與最多的細(xì)胞組分是細(xì)胞成分、細(xì)胞區(qū)域和細(xì)胞器，參與最多的分子功能是催化活性和結(jié)合。KEGG富集分析得出，3組不同污染濃度下共同富集最多的主要通路是苯丙氨酸代謝、亞油酸、α-亞麻酸代謝、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、苯丙酸生物合成、類胡蘿卜素生物合成、半胱氨酸與蛋氨酸代謝。通過比較空白組和DEHP脅迫組的差異基因發(fā)現(xiàn)半胱氨酸與蛋氨酸代謝、亞油酸、α-亞麻酸代謝的差異基因富集比例較高，說明蘿卜在DEHP脅迫下通過這些通路來表達(dá)應(yīng)激反應(yīng)，值得進(jìn)一步研究相關(guān)基因的應(yīng)激機(jī)制。半胱氨酸與蛋氨酸代謝途徑中的GAT、PAs和5-MeC METI，油酸代謝途徑中的LOX和PLA2，α-亞麻酸代謝途徑中的HPL、AACT和OPR均對DEHP脅迫表現(xiàn)出抗性，說明顯著差異基因?qū)μ}卜的非生物脅迫的響應(yīng)具有重要意義。