石義兵，郭小龍

1.鄂東醫(yī)療集團黃石市婦幼保健院兒科(黃石 435000)；2.陜西省延安市人民醫(yī)院(延安 716000)

哮喘(Bronchial asthma，BA) 是由中性粒細胞、嗜酸性粒細胞等多種細胞及細胞因子共同參與的一種氣道慢性炎癥，具有一定遺傳傾向，主要以呼吸道黏液分泌量增加、氣道重構(gòu)和氣道高反應(yīng)性為重要病理特征[1]。目前支氣管哮喘發(fā)病逐漸呈現(xiàn)年輕化和上升趨勢，據(jù)流行病調(diào)查結(jié)果顯示我國城市14歲以下兒童哮喘患病率已由1990年的1.09%上升為3.02%[2]。臨床上將哮喘分為急性發(fā)作期、持續(xù)期和緩解期3個階段，患者發(fā)作期常伴有咳嗽、發(fā)熱和咯痰等臨床病癥，大多數(shù)患者可自行緩解，若發(fā)生嚴重急性發(fā)作，救治不及時會威脅患者生命[3]。中醫(yī)認為哮喘主要由接觸異物以及外感風(fēng)邪導(dǎo)致機體痰飲留滯、脾肺腎功能虛虧，從而誘發(fā)哮喘，近年來中醫(yī)治療哮喘已取得較大成效[4]?；钛ù瓬怯甥湺?、沙參、白術(shù)、黃芪、杜仲等多味中藥材組成的一種方劑，具有止咳平喘、活血化瘀、補脾益氣之功效。1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine 1-phosphate，S1P)屬于鞘磷脂代謝產(chǎn)物之一，主要由巨噬細胞和肥大細胞產(chǎn)生。S1P是一種重要的炎性介質(zhì)，眾多研究報道了S1P在哮喘發(fā)作時對于氣道重構(gòu)的重要作用，一定程度上可反映哮喘氣道炎癥情況[5]。磷脂酞肌醇3激酶(Phospholipid inositol 3 kinase，PI3K)屬于生長因子超受體家族重要成員之一，具有促進支氣管平滑肌增生作用，眾多研究報道了PI3K/AKT信號通路在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎炎癥性疾病和哮喘等炎癥性疾病中的作用[6]。本研究采用自擬活血定喘湯治療兒童支氣管哮喘，觀察臨床效果，并探討其對外周血PI3K和血清S1P水平的影響。

資料與方法

1 一般資料 研究對象為2016年1月至2018年12月期間我院收治的98例患兒，均診斷為支氣管哮喘，年齡介于4～14歲間，將其隨機分為研究組和對照組各49例。對照組口服孟魯司特鈉片治療，研究組在對照組基礎(chǔ)上聯(lián)合加用活血定喘湯治療。診斷標準：《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)》[7]。病例納入標準：①所有患兒均為年齡 4～14歲的中國兒童；②均診斷為慢性緩解期支氣管哮喘，且所有患兒的哮喘病情嚴重程度屬于1級或2 級；③患兒能耐受研究中相應(yīng)的治療藥物。排除標準：①嚴重呼吸功能不全者或曾患有呼吸功能衰竭進行機械通氣者；②近13個月因呼吸系統(tǒng)疾病而接受治療者；③入組前1個月內(nèi)接受過全身性糖皮質(zhì)激素治療且超過1周者或入組前3 d內(nèi)接受全身性茶堿類制劑或糖皮質(zhì)激素治療；④有嚴重精神疾病者、同時患有嚴重呼吸道感染、自身免疫或造血系統(tǒng)疾病以及嚴重心腎功能不全者；⑤對治療藥物過敏者。

兩組患兒的基礎(chǔ)資料、性別、年齡和體重，以及病情等比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究通過我院倫理委員會審批，且所有納入患兒均經(jīng)父母或監(jiān)護人充分知情并簽署書面文件。

表1 兩組患兒基礎(chǔ)資料比較

2 治療方法

2.1 對照組：口服孟魯司特鈉片(國藥準字H200

64370，規(guī)格：5 mg/片)，5 mg/次，1次/d，治療時間為3個月。

2.2 研究組：在對照組基礎(chǔ)上，加用活血定喘湯，組方：麥冬20 g，沙參、黃芩、黃芪、山萸肉各15 g，白術(shù)、杜仲、陳皮、紅花、桃仁各12 g，法半夏10 g，麻黃、杏仁各8 g，甘草6 g，加水煎至300 ml，分早晚2次溫服，每日1劑，療程為3個月。

3 觀察指標

3.1 兩組患者治療后肺功能改善情況比較：于治療前和治療3個月后采用肺功能檢測儀(型號：BTL-08 SPIRO)檢測所有患兒肺功能因子，包括用力肺活量(FVC)和第1秒用力呼氣流量(FEV1)。

3.2 兩組患者血清炎癥因子以及S1P表達水平比較：分別于治療前和治療第3個月清晨，空腹采血3 ml于肝素抗凝管中，使用高速離心機(美國貝克曼庫爾特生產(chǎn))15000 r/min離心15 min分離血清后，嚴格按照操作說明，使用FX-6MG酶聯(lián)免疫光譜分析儀并采用ELISA法(酶聯(lián)免疫吸附)對患兒的血清IL-13和IL-4，IFN-γ和S1P表達水平進行檢測，并制作相應(yīng)標準曲線。ELISA試劑盒購自上海通蔚實業(yè)有限公司。

3.3 兩組患兒外周血單個核細胞中PI3K mRNA相對表達量比較：①分別于治療前和治療第3個月清晨，空腹采血5 ml于肝素抗凝管中，采用Ficoll密度梯度離心法提取并分離出外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。②在PBMC中加入TRlzol試劑液裂解細胞，使用定量RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)法測定PBMC中PBK mRNA的表達，將獲取的RNA溶解于20 μl無菌DEPC水中，并通過A260/280A和10 g/L瓊脂糖凝膠電泳確定RNA質(zhì)量，取比值1.8以上和出現(xiàn)兩條及以上帶的RNA進行引物設(shè)計。并采用相對定量法確定PI3K mRNA的定量，每組重復(fù)測定3次確定RT-PCR半定量結(jié)果，并取3次測定平均值作為統(tǒng)計用均數(shù)。

3.4 兩組患兒免疫細胞水平比較：使用全自動變應(yīng)原體外檢測儀測定所有患者ECP、IgE水平；采用嗜酸粒細胞稀釋液檢測EOS：將血液進行定量稀釋并破壞血液中白細胞和紅細胞，將嗜酸性粒細胞顆粒染色后滴入計數(shù)室，計算一定范圍內(nèi)的嗜酸性細胞數(shù)，然后換算成每升血液中的嗜酸性粒細胞數(shù)，嚴格按照試劑盒說明書和儀器操作規(guī)程進行操作和質(zhì)量控制；血清中T細胞亞群CD4+、CD8+含量：分別于治療前和治療第3個月的早晨，空腹條件下采集患兒3 ml血液，并以帶有肝素為抗凝劑的采集管中，經(jīng)處理獲取淋巴細胞，之后采用流式細胞儀測定CD4+、CD8+含量，并計算CD4+/CD8+值。

3.5 不良反應(yīng)：記錄所有患兒治療期間的不良反應(yīng)發(fā)生情況，計算并比較兩組患兒不良反應(yīng)發(fā)生率。

4 療效標準 比較兩組患者治療療效[8]。分別于治療3個月時比較兩組患者治療效果。顯效：基本無臨床癥狀，哮喘偶爾發(fā)作不服藥也可自行緩解，患兒非發(fā)作期FEV1增加量為25%～35%；有效：臨床癥狀部分緩解，哮喘發(fā)作次數(shù)明顯減少，患兒非發(fā)作期FEV1增加量為10%～24%；無效：不滿足有效標準甚至病情加重者，且患兒非發(fā)作期FEV1增量低于10%甚至出現(xiàn)負增長。治療有效率=(顯效+有效)例數(shù)/總例數(shù)×100%。另外分別于治療前后采用兒童哮喘控制測試問卷(C-ACT) 對所有患兒的C-ACT評分進行調(diào)查。

結(jié) 果

1 兩組患兒治療前后肺功能比較 見表2。治療前兩組患兒FEV1、FEV1/FVC、C-ACT評分無統(tǒng)計學(xué)差異，治療后同組患兒FEV1和FEV1/FVC、C-ACT評分均顯著高于治療前(P<0.05)，且研究組相對對照組具有更大的改善幅度。

表2 兩組患兒治療前后FEV1、FEV1/FVC 與C-ACT評分比較

2 兩組患兒臨床治療效果比較 見表3。兩組患兒治療的有效率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，研究組為89.80%，明顯高于對照組的65.31%。

表3 兩組患兒臨床治療效果比較[例(%)]

3 兩組患兒治療前后血清中炎癥相關(guān)因子、PI3K及S1P濃度比較 見表4。經(jīng)3個月治療，兩組患兒的IL-4、IL-13、LXA4水平以及PI3K的mRNA相對表達量相比治療前均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而INF-γ水平則顯著高于治療前，且跟對照組相比，研究組表現(xiàn)出更大幅度的改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表4 兩組患兒治療前后血清IL-4、IL-13、INF-γ及PI3K、S1P水平比較

4 兩組患兒治療前后免疫細胞水平比較 見表5。治療前兩組患兒的免疫細胞水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，治療后，同組患者血清ECP、EOS、IgE水平以及CD8+相比治療前均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，CD4+以及CD4+/ CD8+均顯著高于治療前，且研究組較對照組具有更好的改善效果，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表5 兩組患兒血清ECP、EOS、IgE及CD4+、CD8+水平比較

5 兩組患兒治療期間不良反應(yīng)發(fā)生情況比較 治療期間，研究組患兒較對照組并未出現(xiàn)不良反應(yīng)的增加(P>0.05)，見表6。

表6 兩組患兒治療期間不良反應(yīng)發(fā)生情況比較[例(%)]

討 論

支氣管哮喘是臨床常見的一種由氣道非特異性炎性反應(yīng)導(dǎo)致的呼吸系統(tǒng)疾病，哮喘發(fā)作時，患者常伴有胸悶、氣促、喘息和咳嗽等癥狀。支氣管哮喘的發(fā)生與空氣污染、遺傳以及環(huán)境等因素存在密切聯(lián)系，但臨床上尚未完全揭示急性支氣管哮喘發(fā)病的分子生物學(xué)機制。兒童支氣管哮喘常表現(xiàn)為呼吸緊促、咳喘且伴有明顯哮鳴音，嚴重者甚至口唇青紫、抬肩張口。近年來中醫(yī)藥在哮喘的治療上已取得重要進展，中醫(yī)認為該哮喘的病理變化是體內(nèi)積有“伏痰”，遇感引觸后導(dǎo)致痰隨氣升，但由于伏痰阻氣，二者相互搏結(jié)導(dǎo)致氣道壅塞狹窄，肺氣宣降發(fā)生失常，從而進一步導(dǎo)致氣喘咳痰以及哮鳴[9]。哮喘的根本病因在于肺部，但隨著反復(fù)發(fā)作和病程久遠，會累及脾腎。同時肺功能與機體血液運行及生成關(guān)系緊密，當存在肺功能障礙時會導(dǎo)致血液瘀滯，而血瘀氣阻在哮喘發(fā)作過程中具有關(guān)鍵作用[10]。另外大量研究已經(jīng)證實哮喘的發(fā)生發(fā)展過程中常伴隨著免疫及炎性狀態(tài)的失衡，因此目前臨床上治療哮喘的重要目標均是盡可能減輕患者氣道炎癥和改善患者臨床癥狀[11-12]。

PI3K是細胞內(nèi)信號蛋白總稱，廣泛表達于氣道平滑肌和氣道上皮，可以促進支氣管平滑肌增生。支氣管哮喘是一種氣道非特異性慢性炎性反應(yīng)，哮喘發(fā)作時，嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和巨噬細胞等多種細胞和細胞因子會在氣道大量聚集并釋放炎癥因子，誘發(fā)氣道炎癥反應(yīng)[6]。Panek等[13]研究報道PI3K/AKT信號通路可以加重氣道炎癥反應(yīng)、提高氣道高反應(yīng)性、上調(diào)Th2等細胞因子水平和增加黏液分泌量，且PI3K/AKT 信號通路除了對炎癥細胞產(chǎn)生影響外，還具有調(diào)節(jié)哮喘炎癥基因表達的作用。Jiang等[14]研究也證實 PI3K 抑制劑能明顯減輕過敏原誘導(dǎo)的小鼠氣道炎癥。另有研究表明哮喘患者肺部巨噬細胞和上皮細胞中骨橋蛋白表達水平明顯升高，其將激活PI3K/AKT及其下游信號通路，導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9和炎性因子IL-13的表達水平大大提高，從而導(dǎo)致氣道黏液分泌增多、反應(yīng)性加重。前人研究均說明了PI3K/AKT通路在哮喘發(fā)病過程發(fā)揮重要作用且其與哮喘發(fā)病程度存在密切聯(lián)系。在本研究中，研究組和對照組患者在接受治療后，同組患者PI3K的mRNA相對表達量、血清炎性因子IL-4、IL-13水平、免疫細胞因子ECP、EOS、IgE水平以及CD8+相比治療前均顯著降低，INF-γ水平、CD4+/ CD8+均顯著高于治療前，且研究組較對照組具有更大的改善幅度。磷酸鞘氨醇屬于鞘磷脂代謝產(chǎn)物之一，主要由巨噬細胞和肥大細胞產(chǎn)生，其不僅參與細胞生長、增殖、分化等重要生物學(xué)過程，也是一種重要的炎性介質(zhì)，在哮喘的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，一定程度上可反映哮喘氣道炎癥情況[5]。SIP主要通過誘導(dǎo)肥大細胞活化脫顆粒以及誘導(dǎo)形成應(yīng)力纖維，導(dǎo)致氣道炎癥反應(yīng)和促進氣道纖維細胞生長，最終引起氣道高反應(yīng)性和氣道重構(gòu)[15]。Feuerborn等[16]研究報道急性期哮喘患兒血清S1P水平顯著高于健康兒童，本文研究結(jié)果顯示非急性期哮喘患兒S1P水平顯著高于對照組，提示急性和非急性哮喘發(fā)作時，患者氣道均存在炎癥?；钛ù瓬怯啥辔吨兴幉慕M成的具有止咳平喘、益氣健脾、活血化瘀功效方劑。方中麻黃、杏仁具有止咳平喘、宣肺效果；沙參和麥冬具有補肺滋陰之功效；白術(shù)和黃芪可以健脾益氣；另外方中杜仲、山萸肉等具有納氣補腎作用；半夏和陳皮可以化痰、理氣；另外方中加有桃仁、紅花等活血化瘀，可以祛瘀散結(jié)通絡(luò)。另外現(xiàn)代許多藥理研究結(jié)果證實紅花具有增強超氧化物歧化酶(SOD)活性和清除炎性因子，作用，可以有效改善機體的炎性水腫狀態(tài)及氣道反應(yīng)性[17]。金香等[18]通過動物研究發(fā)現(xiàn)麻黃可以通過降低IL-13等炎性因子的表達水平改善支氣管哮喘模型小鼠的氣道炎癥反應(yīng)程度。本文結(jié)果顯示在常規(guī)西藥治療基礎(chǔ)上服用活血定喘湯藥，研究組患兒治療療效更佳，且相較對照組并未出現(xiàn)不良反應(yīng)率的增加，表明該中西結(jié)合療法不僅可以顯著提升哮喘患兒的臨床治療效果，且不會增加明顯不良反應(yīng)。另外本文研究結(jié)果顯示研究組患兒治療后其肺功能指標、血清炎癥因子及PI3K、S1P水平以及免疫指標相比對照組均得到明顯改善。我們認為活血定喘湯可以改善哮喘患兒機體炎癥反應(yīng)和免疫狀況，可能是通過抑制PI3K/AKT通路，降低外周血PI3K、S1P表達量，從而減輕了氣道炎癥反應(yīng)，降低了相關(guān)炎性因子的表達水平。另外黃芪除具有明顯抗氧化應(yīng)激、抗炎作用外，還可以通過改善機體Th1/Th2淋巴亞群的平衡，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。同時甘草也可以通過調(diào)節(jié)STAT-6信號通路，減少IL-17等炎性的合成和表達，從而改善機體免疫功能。活血定喘湯中諸藥協(xié)同奏效，共同發(fā)揮平喘、止咳、宣肺散瘀之效。

綜上，活血定喘湯治療兒童支氣管哮喘的臨床療效顯著，可改善患兒體內(nèi)血清炎癥因子、PI3K以及 S1P水平，增強患兒肺功能和免疫功能。