李 博，李宛蓉

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)(天津 300193)；2.同濟(jì)大學(xué)(上海 200092)

世界衛(wèi)生組織將急性創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury，TBI)定義為外部物理力量對(duì)頭部的機(jī)械能量所造成的傷害。在全球范圍內(nèi)，TBI是造成殘疾和傷害相關(guān)死亡的主要原因[1-4]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年都有超過(guò)5000萬(wàn)的新發(fā)TBI患者，中國(guó)的TBI患者數(shù)量超過(guò)了絕大多數(shù)國(guó)家且逐年遞增[5-6]。顱腦創(chuàng)傷是一系列復(fù)雜的病理過(guò)程，在TBI的幾分鐘到數(shù)日之內(nèi)，受損區(qū)域周圍的健康組織經(jīng)歷相互交叉影響病理改變，包括炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)激、微循環(huán)障礙、凝血障礙、血腦屏障功能破壞以及血管活性物質(zhì)失位等[7-10]。

根據(jù)Lancet最新公布的TBI臨床管理指南，TBI的臨床管理目前主要包括維持患者生命體征、顱內(nèi)出血控制和緊急手術(shù)治療[11]。然而上述這些治療方法也存在一定風(fēng)險(xiǎn)，并且可能與更不良的臨床結(jié)果相關(guān)，該指南也表示“優(yōu)先考慮更保守的醫(yī)學(xué)方法是更合理的”。多項(xiàng)臨床研究證實(shí)，手十二井穴刺絡(luò)放血對(duì)于TBI患者昏迷促醒以及傷后的功能恢復(fù)具有積極作用[12-13]，早期應(yīng)用手十二井穴刺絡(luò)放血療法可顯著降低TBI和腦缺血后的水腫狀態(tài)，具有確切的腦保護(hù)作用[14-16]。然而目前關(guān)于手十二井穴刺絡(luò)放血抑制顱腦創(chuàng)傷炎癥反應(yīng)的機(jī)制研究較少。壞死性凋亡是近期發(fā)現(xiàn)的一種新的炎癥誘導(dǎo)通路，參與顱腦創(chuàng)傷的多個(gè)進(jìn)程，是顱腦創(chuàng)傷后一系列繼發(fā)性損傷的重要靶點(diǎn)。故本研究以 TBI 模型小鼠作為研究對(duì)象，采用手十二井穴刺絡(luò)放血干預(yù)，通過(guò)病理?yè)p傷評(píng)估和壞死性凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè)，探討該干預(yù)方法對(duì)TBI后的炎癥反應(yīng)以及神經(jīng)功能損害的影響。

材料與方法

1 動(dòng)物與分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用C57BL/6雄性小鼠，10～12周齡，體重(20±5) g，購(gòu)買自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK-[京]2019-0005，飼養(yǎng)于武警特色醫(yī)學(xué)中心腦創(chuàng)傷與神經(jīng)疾病研究所，正式實(shí)驗(yàn)前將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自然照明，環(huán)境溫度控制在(26±1)℃，相對(duì)濕度(55±5) %，自由飲水進(jìn)食，保持通風(fēng)及清潔衛(wèi)生。實(shí)驗(yàn)遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》。

2 主要試劑與儀器 液壓沖擊腦損傷儀(Custom Design & Fabrication，美國(guó))，小鼠腦立體定位儀(深圳瑞沃德，中國(guó))，倒置熒光顯微鏡(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))，Ultrafreeze 3410超低溫冰箱(日本三洋電機(jī)株式會(huì)社)，低溫高速離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))，Anti-RIP-1/Anti-RIP-3/Anti-MLKL(Abcam，美國(guó))，TNF-α/IL-6/IL-1β ELISA試劑盒(Bio-world，美國(guó))。

3 實(shí)驗(yàn)流程 將小鼠編號(hào)后，依照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、井穴放血組，每組20只。井穴放血組僅在造模完成后即刻進(jìn)行1次放血，每次放血10 μl；模型組僅清潔消毒創(chuàng)口，不做任何治療；假手術(shù)組僅開骨窗，不進(jìn)行eCCI撞擊。

4 模型制備與鑒定 采用電子控制性腦皮質(zhì)撞擊法制備重型皮質(zhì)下顱腦創(chuàng)傷小鼠模型(eCCI模型)[17]。將小鼠開顱窗后固定于eCCI撞擊內(nèi)支架固定平臺(tái)，設(shè)置eCCI撞擊參數(shù)：撞擊速度(Velocity)=5 m/s，撞擊深度(Deeph)=1.5 mm，撞擊最低點(diǎn)持續(xù)時(shí)間(Time)=120 ms，使用直徑3 mm撞擊錘，撞擊臂與垂直方向成15°角，手術(shù)后觀察小鼠呼吸情況并清洗創(chuàng)口血液，待小鼠生命體征平穩(wěn)后縫合頭皮。

5 實(shí)驗(yàn)方法 手十二井穴定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》中的動(dòng)物腧穴定位[18]，并參考比較解剖學(xué)方法以及人體相應(yīng)穴位解剖標(biāo)志，選取小鼠前肢各趾相應(yīng)部位選取相應(yīng)位置，井穴放血工具選用1 ml注射器針頭，于雙側(cè)前肢趾端的十二井穴點(diǎn)刺放血，進(jìn)針角度與水平面45°夾角，放血出血量為每個(gè)穴位5～8 μl。

6 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

6.1 改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分：分別采用改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分(Modified Neurological Severity Scores，mNSS)對(duì)顱腦創(chuàng)傷后12、24、48、72 h的實(shí)驗(yàn)小鼠的神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)分項(xiàng)目由運(yùn)動(dòng)功能、平衡功能、感覺功能、反射功能及異常體征(癲癇、肌痙攣、肌張力障礙)組成評(píng)分系統(tǒng)[19]。得分越高則表示神經(jīng)功能缺損情況越嚴(yán)重，總得分最低為 0分，提示小鼠完全正常，沒(méi)有神經(jīng)功能缺陷，最高為18分，提示小鼠意識(shí)喪失或死亡。

6.2 腦組織病理：eCCI造模后72 h，各組隨機(jī)選取5只小鼠，使用5%水合氯醛(0.07 ml/10 g)麻醉處死并快速斷頭取腦，將完整腦組織放入多聚甲醛溶液中固定1周。固定完成后進(jìn)行石蠟包埋，設(shè)置震蕩切片機(jī)切片厚度為25 μm，對(duì)小鼠腦組織損傷區(qū)域進(jìn)行連續(xù)切片，間隔1 mm 切片10張。將腦組織切片平攤在玻璃載玻片上，放至55 ℃干燥箱中烘烤5 h直至脫蠟，取出冷卻至室溫后進(jìn)行水化與染色，脫水封片后于光鏡下觀察。

6.3 RIP-1、RIP-3、MLKL蛋白相對(duì)表達(dá)量：使用Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)量。治療結(jié)束后，斷頭取腦，冰上快速鉗取腦組織損傷區(qū)域，用電子天平稱取約50 mg，提取腦組織蛋白并定量；依照待測(cè)蛋白分子量的大小，需要使用不同濃度的SDS-PAGE分離膠，蛋白變性后進(jìn)行電泳及轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將抗體殘余洗凈，使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍攝，Image J軟件對(duì)條帶圖像進(jìn)行灰度值分析，目的蛋白/內(nèi)參蛋白灰度值比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 手十二井穴刺絡(luò)放血對(duì)神經(jīng)功能的影響 見表1。各組小鼠創(chuàng)傷前 mNSS 評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性；各組小鼠在創(chuàng)傷后12 h進(jìn)行 mNSS 評(píng)分，模型組與干預(yù)組小鼠 mNSS 評(píng)分均大于8分，說(shuō)明模型建立成功，并且井穴放血組的mNSS 評(píng)分顯著低于模型組；與假手術(shù)組相比，模型組的mNSS評(píng)分在創(chuàng)傷后12、24、48、72 h均顯著升高(P<0.01)，雖然隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，mNSS 評(píng)分呈下降趨勢(shì)，但在72 h內(nèi)均大于8分，表示在損傷后的72 h內(nèi)小鼠一直處于重型顱腦創(chuàng)傷的狀態(tài)，神經(jīng)功能未能有效恢復(fù)；井穴放血組的mNSS 評(píng)分在創(chuàng)傷后12、24、48、72 h均顯著低于模型組(P<0.01)，并且在創(chuàng)傷后48 h，井穴放血組小鼠的mNSS已降低至9分以下，表示在損傷48 h后顱腦創(chuàng)傷的損傷評(píng)級(jí)已下降至中度顱腦創(chuàng)傷，神經(jīng)功能有較大程度的恢復(fù)。

表1 各組小鼠創(chuàng)傷前后神經(jīng)功能缺陷評(píng)分比較(分)

2 手十二井穴刺絡(luò)放血對(duì)腦組織病理學(xué)的影響 鏡下觀察各組小鼠腦組織HE染色結(jié)果，可見假手術(shù)組小鼠腦組織皮層及海馬區(qū)結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞層形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞膜染色均一；模型組小鼠受撞擊處腦組織結(jié)構(gòu)缺如，腦組織缺損邊緣有紅色透明滴狀物與膠質(zhì)細(xì)胞增生，海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)松散且數(shù)量明顯減少，皮層下近海馬區(qū)位置有明顯的局灶性出血并伴有散在的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；井穴放血組小鼠腦組織皮層可見明顯缺如，但與模型組對(duì)比，缺如面積明顯減小，海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞核膜固縮及空泡程度減輕且完整形態(tài)的細(xì)胞數(shù)量較多，皮層下近海馬區(qū)未見明顯紅細(xì)胞滲出(圖1)。

3 手十二井穴刺絡(luò)放血對(duì)TBI后小鼠壞死性凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響 見表2(圖2)。對(duì)壞死性凋亡通路關(guān)鍵蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組RIP-1蛋白表達(dá)在顱腦創(chuàng)傷后6、48、72 h均顯著升高(P<0.01)，在顱腦創(chuàng)傷后48 h差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與模型組相比，井穴放血組RIP-1蛋白表達(dá)在顱腦創(chuàng)傷后6、24、48、72 h均顯著降低(P<0.01)。與假手術(shù)組相比，模型組RIP-3蛋白表達(dá)在顱腦創(chuàng)傷后6、24、48、72 h均顯著升高(P<0.01)，與模型組相比，井穴放血組RIP 3蛋白表達(dá)在顱腦創(chuàng)傷后6、24、48、72 h均顯著降低(P<0.01)。與假手術(shù)組相比，模型組MLKL蛋白表達(dá)在顱腦創(chuàng)傷后24、48、72 h均顯著升高(P<0.01)，在顱腦創(chuàng)傷后6 h差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與模型組相比，井穴放血組MLKL蛋白表達(dá)在顱腦創(chuàng)傷后6、24、48、72 h均顯著降低(P<0.01)。

表2 各組小鼠TBI后RIP-1、RIP-3、MLKL 蛋白相對(duì)表達(dá)量

圖2 各組小鼠TBI后RIP-1、RIP-3、MLKL蛋白相對(duì)表達(dá)量

討 論

對(duì)于顱腦創(chuàng)傷的病因病機(jī)，古代醫(yī)家大多從“血瘀”論述。關(guān)于顱腦創(chuàng)傷的病因病機(jī)最早可見于《靈樞·賊風(fēng)》，其中記載：“若有所墜墮，惡血留內(nèi)而不去”。隨著中醫(yī)學(xué)的發(fā)展，醫(yī)家普遍認(rèn)同“血瘀”是顱腦創(chuàng)傷最重要的病機(jī)，明代陳實(shí)功所著《外科正宗·卷之四》曾記載“如從高墜墮而未經(jīng)損破皮肉者,必有瘀血流注臟腑，人必昏沉不省”。

手十二井穴刺絡(luò)放血活血化瘀的作用源于經(jīng)典，在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中已得到充分的體現(xiàn)與重視。在《靈樞·九針十二原》中開宗明義的提出了針灸的治法原則“凡用針者，虛則實(shí)之，滿則泄之，菀陳則除之”，《素問(wèn)·針解》中可見“菀陳則除之者，去惡血也”的記載，在《素問(wèn)·調(diào)經(jīng)論》也提到：“病在血，調(diào)之絡(luò)，視其血絡(luò)，刺出其血，無(wú)令惡血得入于經(jīng)，以成其疾”的觀點(diǎn)，在《素問(wèn)·陰陽(yáng)應(yīng)象大論》中明確指出“血實(shí)宜決之”的觀點(diǎn)，張景岳注云“決為泄去其血也”，可見所謂“決之”的方法獨(dú)指刺絡(luò)放血，而非其他針刺方法，而在《素問(wèn)·繆刺論》中更是詳細(xì)描述了刺絡(luò)放血的方法和部位“視其病，繆刺之于手足爪甲上，視其脈，出其血，間日一刺，一刺不已，五刺已。”

手十二井穴刺絡(luò)放血活血化瘀的作用與手十二井穴的物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)有關(guān)。從解剖結(jié)構(gòu)的角度看，手十二井穴的位置分布于手指末端的橈側(cè)緣或尺側(cè)緣，該位置分布有茂密的毛細(xì)血管動(dòng)、靜脈網(wǎng)和豐富的末梢神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)以及血管壁上的植物神經(jīng)，尤其是感覺傳入神經(jīng)纖維的分布更是軀干部位的數(shù)倍之多[20]，這也就決定了同樣強(qiáng)度的刺激，在手十二井穴處接受到的感覺刺激也會(huì)呈現(xiàn)數(shù)倍之強(qiáng)；從微觀的生物力學(xué)和分子生物學(xué)的角度看，手十二井穴刺絡(luò)放血可能通過(guò)影響血流剪切力并通過(guò)井穴的特殊結(jié)構(gòu)將該刺激放大從而作用于血管內(nèi)皮，血管內(nèi)皮細(xì)胞表面分布有豐富的交感神經(jīng)與神經(jīng)遞質(zhì)類分子，例如前列腺素、一氧化氮等，這些物質(zhì)既具有刺激循環(huán)系統(tǒng)的作用,又能發(fā)揮其對(duì)局部血管壁上的植物神經(jīng)的刺激效應(yīng)，從整體和局部方面調(diào)節(jié)血壓、血管壁張力和體液滲透壓等作用，繼而產(chǎn)生活血化瘀作用[21]。

壞死性凋亡是近期發(fā)現(xiàn)的一種新的細(xì)胞死亡形式，它是一種受調(diào)節(jié)的壞死形式，瀕死的細(xì)胞破裂并釋放細(xì)胞內(nèi)的成分，可以觸發(fā)先天免疫反應(yīng)，參與多種疾病的炎癥反應(yīng)過(guò)程，例如顱腦損傷、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、細(xì)菌感染、腸炎、胰腺炎等。受體相互作用蛋白 3(Receptor-interacting protein3，RIP3)是誘導(dǎo)壞死性凋亡的關(guān)鍵啟動(dòng)子，對(duì)激活/抑制壞死性凋亡通路具有重要影響。有研究表明RIP1的相似結(jié)構(gòu)域分子RIP3也參與了壞死性凋亡通路的啟動(dòng)，并可誘導(dǎo)混合連接激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白(Mixed lineage kinase domain-likeprotein，MLKL)基因表觀發(fā)生改變，最終促使細(xì)胞凋亡并釋放炎癥因子[22-24]。本研究中的結(jié)果顯示，TBI后的6～72 h，模型組的RIP-1、RIP-3、MLKL蛋白明顯升高，而井穴放血組則明顯逆轉(zhuǎn)了這一趨勢(shì)，這可能與刺激井穴從而激活了大腦中某些特定的功能核團(tuán)分泌具有免疫功能的神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)，一項(xiàng)研究通過(guò)刺激位于正中神經(jīng)的內(nèi)關(guān)穴來(lái)激活中腦導(dǎo)水管分泌增食欲素，另有一項(xiàng)研究通過(guò)刺激位于腕屈肌腱尺神經(jīng)分布部位的神門穴激活下丘腦弓狀核的內(nèi)啡肽受體[25-26]，而神門穴和內(nèi)關(guān)穴的解剖結(jié)構(gòu)與井穴存在高度的相似特性，均分布有大量神經(jīng)和血管，由此可見手十二井穴刺絡(luò)放血抑制壞死性凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的功能，與神經(jīng)-血管-免疫相互作用關(guān)系密切。

手十二井穴刺絡(luò)放血在臨床中用于治療TBI效果顯著，本研究基于壞死性凋亡通路觀察手十二井穴刺絡(luò)放血對(duì)TBI小鼠的治療作用，發(fā)現(xiàn)手十二井穴刺絡(luò)放血可通過(guò)抑制RIP-1、RIP-3、MLKL蛋白表達(dá)，緩解炎癥反應(yīng)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，改善神經(jīng)功能缺損等相關(guān)癥狀，為臨床治療TBI提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。