王磊磊，胡方梅，陳 華，孫金鵬，劉國(guó)華，崔友祥

河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院(滄州 061001)

腦梗死(Cerebral infarction，CI) 是中老年人常見的缺血性腦血管病，一般急性起病，并迅速表現(xiàn)為局限性或彌漫性的神經(jīng)功能缺損癥狀，是引起人類死亡和殘障的重要原因之一[1-3]。神經(jīng)系統(tǒng)本身具有可塑性，若能采用手段促進(jìn)腦梗死后神經(jīng)組織修復(fù)和功能重建[4]，對(duì)于減輕后遺癥狀有重要意義。

針刺在腦梗死的治療中應(yīng)用已久，尤其在后期康復(fù)治療中，取得了顯著療效[5]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察抽提透刺法對(duì)腦梗死模型大鼠神經(jīng)功能的影響，該療法能夠提高腦梗死大鼠缺血區(qū)微血管密度，可上調(diào)大腦皮質(zhì)CXCL12、CXCR4蛋白表達(dá)，為抽提透刺法治療腦梗死提供了理論支持。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠56只，清潔級(jí)，周齡6～7周，體重260～300 g，平均(282.74±8.74)g，由武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(鄂)2014-0004。所有大鼠每籠5只置于飼養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行為期1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)，室溫控制在22～25 ℃之間，相對(duì)濕度控制在50%～60%，避免噪音、強(qiáng)光刺激，明暗周期為12 h∶12 h，飼以標(biāo)準(zhǔn)飼料和純凈水，大鼠在籠內(nèi)自由活動(dòng)及進(jìn)食飲水，定期清掃鼠籠、更換墊料及消毒。

2 主要藥物、試劑與儀器 腦蛋白水解物注射液，規(guī)格：每支2 ml，批號(hào)：20170723。大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO) 線栓，購(gòu)自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。VECTASTAIN@ ABC免疫組化試劑盒，購(gòu)自上海桑戈生物科技有限公司；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒，購(gòu)自上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司；大鼠VEGF、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒，購(gòu)自上海信帆生物科技有限公司；二奎琳甲酸(BCA)法蛋白定量試劑盒，購(gòu)自北京紐樸生物技術(shù)有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒，購(gòu)自南京巨祿生物科技有限公司；兔血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)多克隆抗體、生物素標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)、CXC趨化因子配體12(CXCL12)、CXC趨化因子受體4(CXCR4)、肌動(dòng)蛋白(β-actin)單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG，購(gòu)自北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司。

G-L型離心機(jī)，德國(guó)IKA公司產(chǎn)品；Elisys Duo型全自動(dòng)酶免分析儀，胡曼診斷產(chǎn)品(北京)有限公司生產(chǎn)；DM4000M型光學(xué)顯微鏡，德國(guó)Leica公司產(chǎn)品； Agaro Power型電泳儀，柏業(yè)貿(mào)易(上海)有限公司產(chǎn)品；Gel Doc EZ型凝膠成像分析系統(tǒng)，美國(guó)BIO-RAD公司產(chǎn)品。

3 動(dòng)物分組及干預(yù)方法

3.1 模型建立：經(jīng)過適應(yīng)性飼養(yǎng)后，將所有大鼠編號(hào)，之后按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組14只及造模組42只。稱重后，采用10%水合氯醛35 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，頸前部常規(guī)進(jìn)行備皮、消毒，取頸正中2 cm切口，逐層切開并分離筋膜、腺體組織，暴露并分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈；造模組采用微動(dòng)脈夾夾閉右頸總動(dòng)脈，使頸外動(dòng)脈游離，用電凝筆電凝頸外動(dòng)脈分支，于右頸總動(dòng)脈分叉附近5 mm處將右頸總動(dòng)脈結(jié)扎、離斷；暴露頸內(nèi)動(dòng)脈，采用微動(dòng)脈夾夾閉其分支(翼腭動(dòng)脈)；于頸外動(dòng)脈殘端開口，插入線栓至頸內(nèi)動(dòng)脈顱內(nèi)大腦前動(dòng)脈，閉塞大腦中動(dòng)脈開口；剪去尾部多余線栓，除掉微動(dòng)脈夾，對(duì)傷口進(jìn)行消毒后逐層縫合；對(duì)照組手術(shù)操作與造模組相同，但只分離血管，不插線栓。術(shù)后常規(guī)采用青霉素防止感染。術(shù)畢1 d，大鼠右側(cè)肢體疼痛回縮反應(yīng)遲鈍、消失，右側(cè)上肢在提尾倒懸時(shí)無法前伸，爬行時(shí)偏向右側(cè)即為腦梗死模型建立成功；造模過程中出現(xiàn)死亡或者造模失敗情況，及時(shí)補(bǔ)齊大鼠[5]。

3.2 分組及給藥：將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組、針刺組及藥物注射組，各14只。模型建立24 h后，模型組及對(duì)照組分別給予生理鹽水10 ml/kg，腹腔注射，1次/d；針刺組根據(jù)實(shí)驗(yàn)大鼠針灸俞穴圖譜及針刺手法中的方法，取大鼠的百會(huì)透刺雙側(cè)曲鬢，使用抽提手法，幅度為0.1～0.2 cm，行針30 s，留針30 min，1次/d；藥物注射組給予腦蛋白水解物注射液10 ml/kg，腹腔注射，1次/d。各組大鼠均干預(yù)14 d。

4 觀察指標(biāo)及方法

4.1 神經(jīng)功能評(píng)價(jià)： 末次給藥第2天，參照改良Longa評(píng)分評(píng)估大鼠的神經(jīng)功能，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：未見神經(jīng)功能缺損記為0分；左側(cè)前肢無法伸展完全記為1分；左側(cè)前肢屈曲記為2分；大鼠運(yùn)動(dòng)時(shí)輕度偏向左側(cè)轉(zhuǎn)圈記為3分；大鼠運(yùn)動(dòng)時(shí)嚴(yán)重偏向左側(cè)轉(zhuǎn)圈記為4分；大鼠運(yùn)動(dòng)時(shí)向左側(cè)跌倒記為5分。得分越高，表明大鼠的神經(jīng)功能缺陷越嚴(yán)重。

4.2 標(biāo)本采集與處理：完成神經(jīng)功能評(píng)價(jià)結(jié)束后，采用10%水合氯醛35 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，打開腹腔，自腹主動(dòng)脈取血5 ml，以3000 r/min速度離心10 min，分離血清，保存于-2 ℃冰箱內(nèi)備檢；橫斷頸部處死大鼠，打開顱腔，小心取出腦組織，取1/2缺血側(cè)腦組織采用4%多聚甲醛固定，常規(guī)經(jīng)梯度濃度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片，制備厚度為5 μm的組織切片；剩余1/2缺血側(cè)腦組織經(jīng)液氮速凍，置于-70 ℃冰箱內(nèi)保存，以用于后續(xù)蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)檢測(cè)。

4.3 免疫組化法檢測(cè)腦組織微血管密度：取腦組織石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度濃度乙醇復(fù)水后，微波爐高火5 min、中10 min行抗原修復(fù)，3%過氧化氫30 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，之后用稀釋血清內(nèi)室溫封閉20 min；用VEGF多克隆抗體(1∶200稀釋)4 ℃孵育16 h，然后用生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG工作液室溫孵育30 min，依次采用免疫組化試劑盒染色30 min，DAB試劑盒顯色；經(jīng)復(fù)染、梯度濃度乙醇脫水后，中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下從熱點(diǎn)(棕黃色陽性細(xì)胞密集處)內(nèi)隨機(jī)選擇不重復(fù)的5個(gè)100倍視野，于400倍鏡下計(jì)數(shù)新生血管數(shù)目。新生血管判定標(biāo)準(zhǔn)：每個(gè)棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇記為一條微血管，形成管腔者直徑需≤8個(gè)紅細(xì)胞直徑。微血管密度(MVD)=熱點(diǎn)內(nèi)微血管數(shù)目/4。

4.4 ELISA法檢測(cè)血清VEGF、MMP-9水平：取凍存的血清，迅速融化恢復(fù)至室溫，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用Elisys Duo型全自動(dòng)酶免分析儀，測(cè)定血清VEGF、MMP-9水平。

4.5 Western blot法檢測(cè)大腦皮質(zhì)CXCL12、CXCR4蛋白表達(dá)水平：取凍存的大腦皮質(zhì)組織，加入預(yù)冷的RIPA制備勻漿，4 ℃下，12000 r/min離心30 min，采用BCA試劑盒確定上清液蛋白濃度；配制好的SDS-PAGE凝膠置于電泳槽內(nèi)；取蛋白樣本30 μg，與上樣緩沖液混合，100 ℃變性5 min后加樣；電泳至溴酚蘭跑至電泳槽底部時(shí)停止，將凝膠上目的蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上；PVDF膜浸入封閉液室溫封閉2 h，然后浸入CXCL12(1∶1000稀釋)、CXCR4(1∶1000稀釋)一抗工作液及內(nèi)參β-actin(1∶1000稀釋)內(nèi)，4 ℃搖床孵育16 h；取出、洗滌后浸入二抗工作液(1∶10000稀釋)，室溫孵育2 h；采用ECL試劑盒化學(xué)發(fā)光，于暗室內(nèi)X線膠片曝光、定影。采用Gel Doc EZ型凝膠成像分析系統(tǒng)采集圖像，Image pro plus 6.0軟件分析各蛋白條帶灰度值，計(jì)算CXCL12、CXCR4蛋白與內(nèi)參β-actin灰度值的比值。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較 見表1。與對(duì)照組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，針刺組及藥物注射組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分均較低，且針刺組低于藥物注射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較(分)

2 各組大鼠腦組織MVD比較 見表2。免疫組化染色結(jié)果顯示，VEGF標(biāo)記的血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)被染成棕黃色，在缺血區(qū)周圍集中分布(圖1)。定量分析顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠腦組織MVD明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，針刺組及藥物注射組大鼠腦組織MVD均較高，且針刺組高于藥物注射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠腦組織MVD比較(個(gè))

A:對(duì)照組；B:模型組；C:針刺組；D:藥物注射組 圖1 各組大鼠腦組織MVD觀察(免疫組化染色，×400)

3 各組大鼠血清VEGF、MMP-9水平比較 見表3。免疫組化染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清VEGF、MMP-9水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，針刺組及藥物注射組大鼠血清VEGF、MMP-9水平均較高，且針刺組高于藥物注射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組大鼠血清VEGF、MMP-9水平比較

4 各組大鼠大腦皮質(zhì)CXCL12、CXCR4蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 見表4(圖2)。免疫組化染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠大腦皮質(zhì)CXCL12、CXCR4蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，針刺組及藥物注射組大鼠大腦皮質(zhì)CXCL12、CXCR4蛋白相對(duì)表達(dá)水平均較高，且針刺組高于藥物注射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 各組大鼠大腦皮質(zhì)CXCL12、CXCR4 蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

圖2 Western blot法檢測(cè)各組大鼠大腦皮質(zhì) CXCL12、CXCR4蛋白相對(duì)表達(dá)結(jié)果

討 論

近年來，由于生活水平提高、飲食習(xí)慣改變，社會(huì)步入人口老齡化等原因，腦梗死的發(fā)病率呈現(xiàn)不斷上升趨勢(shì)，已經(jīng)成為重要的社會(huì)公共健康問題。腦梗死是由多種因素引起的一種十分復(fù)雜的級(jí)聯(lián)損傷反應(yīng)，發(fā)病初期由于血管阻塞，缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞絕大部分功能喪失而并未全部壞死，隨著缺血時(shí)間延長(zhǎng)，缺血中心部分神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)一步壞死形成不可逆的梗死灶；而梗死灶周圍缺血半暗帶區(qū)仍有少量血供殘留，該區(qū)內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞多受到可逆性損傷，若能盡早建立側(cè)支循環(huán)，恢復(fù)血供，對(duì)于挽救缺血半暗帶、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞損傷修復(fù)及改善預(yù)后有重要意義[6-8]。中醫(yī)認(rèn)為，該病屬于“中風(fēng)”范疇，針刺治療的歷史悠久且療效確切。針刺的種類繁多，其中以頭穴針刺最為常見。田亮等[9]總結(jié)認(rèn)為，頭穴針刺治療中風(fēng)的機(jī)制包括：擴(kuò)張血管，改善腦組織血液循環(huán)以及能量代謝；調(diào)節(jié)神經(jīng)生長(zhǎng)因子表達(dá)水平，加速神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化，提高神經(jīng)功能；抑制興奮性氨基酸水平和毒性，減少神經(jīng)損傷；抑制炎性免疫反應(yīng)；改善脂質(zhì)代謝，清除氧自由基；抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡等等。但是上述機(jī)制也并不完全，仍需進(jìn)一步研究探討。

在本次研究中，我們采用線栓法建立的腦梗死模型大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯高于對(duì)照組，提示成功建立腦梗死模型；之后采用抽提透刺法對(duì)模型大鼠進(jìn)行治療，取穴為百會(huì)透雙側(cè)曲鬢，于學(xué)平等[10]研究認(rèn)為，百會(huì)透刺曲鬢穴對(duì)于腦微血管纖維連接蛋白的表達(dá)有促進(jìn)作用，減輕腦缺血再灌注相關(guān)的組織損傷。本次治療后，針刺組及藥物注射組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分低于模型組，且針刺組小于藥物注射組，表明抽提透刺法確實(shí)有效改善了腦梗死模型大鼠的神經(jīng)功能，發(fā)揮腦保護(hù)作用。

微血管生成對(duì)于缺血區(qū)腦組織側(cè)支循環(huán)建立具有重要意義，有助于減輕梗死區(qū)周邊神經(jīng)細(xì)胞損傷，控制病情進(jìn)展，也有利于神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)[11-12]。本次研究發(fā)現(xiàn)針刺組及藥物注射組大鼠腦組織MVD均高于模型組，且針刺組高于藥物注射組，提示抽提透刺法能有效增加腦梗死模型大鼠腦組織微血管密度，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)建立，與相關(guān)報(bào)道一致[13-14]。而關(guān)于其具體的作用機(jī)制，可以從CXCL12-CXCR4信號(hào)通路及其相關(guān)因子方面進(jìn)行探討[15-17]。CXCL12屬于CXC趨化因子超家族成員，CXCR4則為受體，二者在多種細(xì)胞和組織中表達(dá)，結(jié)合后可通過耦聯(lián)的G蛋白等轉(zhuǎn)化為生物信號(hào)，參與細(xì)胞增殖、分化、血管及神經(jīng)生成等多種過程[18-20]。有研究認(rèn)為，CXCL12-CXCR4在血管修復(fù)和再生過程中起到重要的促進(jìn)作用[21]。CXCL12對(duì)于MMP-9的表達(dá)有上調(diào)作用，而MMP-9可以加速細(xì)胞外基質(zhì)降解和重組，促進(jìn)血管生成；此外，CXCL12- CXCR4具有血管刺激作用，能夠促進(jìn)VEGF表達(dá)，VEGF是已知最強(qiáng)的特異性促血管生成因子，其能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，啟動(dòng)腦梗死后血管新生。又有研究稱，補(bǔ)充VEGF有助于腦梗死大鼠梗死區(qū)周邊血管新生和神經(jīng)功能恢復(fù)[22]。本次研究結(jié)果顯示，與模型組比較，針刺組及藥物注射組大鼠血清VEGF、MMP-9水平較高，大腦皮質(zhì)CXCL12、CXCR4蛋白表達(dá)水平較高，且針刺組高于藥物注射組，表明抽提透刺法能促進(jìn)腦梗死模型大鼠腦組織CXCL12-CXCR4信號(hào)通路激活，上調(diào)血管生成相關(guān)因子VEGF、MMP-9水平，這可能是抽提透刺法促進(jìn)微血管形成，加速神經(jīng)損傷修復(fù)，保護(hù)腦組織的作用機(jī)制之一[23]。

綜上所述，抽提透刺法能有效改善腦梗死大鼠神經(jīng)功能，提高缺血區(qū)微血管密度，其腦保護(hù)作用可能與上調(diào)CXCL12-CXCR4信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。