何廷美 ，陳善瑜，施小剛，柴宜均，陳禮穎，許佳雪，程躍鴻，彭廣能*

（1.四川臥龍國家級自然保護(hù)區(qū)管理局，四川汶川 623006；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川成都 611130）

四川臥龍自然保護(hù)區(qū)是國家級第三大自然保護(hù)區(qū)，珍稀動植物繁多，享有“熊貓之鄉(xiāng)”“寶貴的生物基因庫”“天然動植物園”等美名。保護(hù)區(qū)內(nèi)國家一級重點(diǎn)保護(hù)野生動物有15種，二級重點(diǎn)保護(hù)野生動物有53 種［1］。越來越多的研究顯示寄生蟲病是危害野生動物的主要疾病之一［2］，某些人獸共患的寄生蟲病還會給人類健康帶來威脅。動物腸道內(nèi)常見的寄生蟲主要有絳蟲、吸蟲、線蟲和原蟲，以及一些蟲體微小的原蟲，如芽囊原蟲（Blastocystis sp.）。近期有研究發(fā)現(xiàn)，珍稀野生動物在感染芽囊原蟲過程中具有人畜共患的風(fēng)險［2］。本研究調(diào)查了四川臥龍自然保護(hù)區(qū)內(nèi)包括野生大熊貓、小熊貓、豹貓?jiān)趦?nèi)的12 種珍稀野生動物腸道寄生蟲的感染情況，旨在豐富保護(hù)區(qū)野生動物腸道寄生蟲感染的本底資料，同時做好潛在人獸共患病的風(fēng)險評估。

1 調(diào)查對象

大熊貓（Ailuropoda melanoleuca）、小熊貓（Ailurus fulgens）、豹貓（Prionailurus bengalensis）、羚牛（Budorcas taxicolor）、豬獾（Arctonyx collaris）、藏酋猴（Macaca thibetana）、林麝（Moschus berezovskii）、豪豬（Hystrix hodgsoni）、中華鬣羚（Capricornissumatraensis）、毛冠鹿（Elaphodus cephalophus）、中華斑羚（Naemorhedus griseus）、水鹿（Rusa unicolor）12種野生動物。

2 動物糞便樣本的采集

2020 年4 月～5 月，四川臥龍自然保護(hù)區(qū)巡山工作人員在保護(hù)區(qū)內(nèi)不同地理位置和海拔使用一次性自封袋采集動物糞便（糞便排出體外的時間控制在3 d以內(nèi)），體型較大的大動物采集50～100 g 糞便，小動物采集10～20 g 糞便，編號記錄動物種類、采集地區(qū)、采集時間，低溫保存送四川農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢查。

3 方法

3.1 主要溶液及配制方法

3.1.1 飽和食鹽水 用電子秤稱取500g NaCl置于320 mL蒸餾水中，然后緩慢加熱使其完全溶解，冷卻后裝于500mL容量瓶中，4℃冰箱儲存待用。

3.1.2 2.5%重鉻酸鉀溶液 先稱取2.5 g K2Cr2O7，然后將其溶解于100 mL ddH2O 中，常溫密閉保存。

3.1.3 1%瓊脂糖凝膠 天平稱取瓊脂糖粉1.2 g，溶解于120 mL 1倍TBE溶液中，微波爐高火加熱至沸騰后，小火加熱至澄清，取出冷卻至不燙手，滴加GoldView染液10 μL，用玻棒攪拌，并倒入制膠板中，冷卻凝固后置于電泳槽中備用。

3.2 蟲卵檢查方法

3.2.1 飽和鹽水漂浮法 取被檢糞便10 g 左右，放入100 mL燒杯內(nèi)，加飽和鹽水至40 mL，將糞便攪碎、充分混勻，經(jīng)分樣篩過濾，將濾液倒入2 mL離心管中，使液面凸出瓶口呈半球形，靜置30min，用載玻片剛好觸碰到液面（以蘸取漂浮在液面上的蟲卵），然后蓋上蓋玻片，置顯微鏡下檢查。

3.2.2 沉淀法 取備檢糞便10 g 左右，放入燒杯內(nèi)，加入清水至40 mL，將糞便攪碎、充分混勻，經(jīng)分樣篩過濾，將濾液倒入燒杯中，靜置30 min，倒去上清液，如此反復(fù)操作3～4 次，最后棄上層液體取沉淀物涂布于載玻片上，蓋上蓋玻片，置顯微鏡下檢查。

3.2.3 蟲卵鑒定 根據(jù)檢出蟲卵、卵囊的顏色、形態(tài)、大小等特征，參考相關(guān)專業(yè)書籍、文獻(xiàn)進(jìn)行分類、鑒定［3-5］。

3.3 糞便基因組DNA 的提取 每份糞便取200～300 mg置于2 mL離心管中，加入蒸餾水，混勻，12 000 r/min離心1 min，棄上清，重復(fù)上述步驟直至清洗干凈表面的重鉻酸鉀得到清亮透明的液體。隨后按照E.Z.N.A.?Stool DNA Kit糞便全基因組提取試劑盒（Omega Biotek Inc D4015-01，USA）說明書的操作步驟提取DNA，操作完成后將DNA放于-20 ℃冰箱中待檢。

3.4 PCR 擴(kuò)增及測序 基于芽囊原蟲SSU rRNA基因位點(diǎn)對所提取的DNA 樣品進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。根據(jù)文獻(xiàn)［6］給出的引物和NCBI中的基因序列來設(shè)置引物、反應(yīng)條件與反應(yīng)體系。

3.4.1 引物 所需合成的引物序列及產(chǎn)物DNA片段大小見表1。

表1 芽囊原蟲PCR引物

3.4.2 反應(yīng)體系 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL，見表2。

表2 PCR反應(yīng)體系

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；93 ℃變性1 min，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30 次；72 ℃再延伸3 min；10 ℃永久保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后由上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行單向測序。

3.5 SSU rRNA序列分析及種系發(fā)育分析 測序后的序列在NCBI 的Blast 上進(jìn)行相似性比對，將所獲得的序列與GenBank 上同源性最高的序列進(jìn)行比較，確定序列是否是芽囊原蟲的基因組，分析序列差異確定亞型。利用Mega7.0 軟件，選擇鄰接法（Neighbor-joining，NJ 法）中的Kimura-2-parameter模型，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。進(jìn)化樹的可靠性用Bootstrap分析進(jìn)行檢測，進(jìn)行1000個重復(fù)。

4 調(diào)查結(jié)果

4.1 野生動物腸道寄生蟲感染率 75 份糞便樣品經(jīng)飽和食鹽水漂浮法、沉淀法和分子生物學(xué)方法檢測，結(jié)果有36份糞便樣品的寄生蟲檢測呈陽性，總感染率為48.0%。感染的寄生蟲有線蟲、絳蟲、芽囊原蟲、吸蟲、螨蟲、球蟲、滴蟲。其中陽性率最高的是線蟲30.7%（23/75），其次是絳蟲13.3%（10/75）、芽囊原蟲12.0%（9/75）、吸蟲8.0%（6/75）、螨蟲4.0%（3/75）、球蟲1.3%（1/75）、滴蟲1.3%（1/75）。單純感染占總感染數(shù)的44.4%（16/36）。12 種野生動物中除了豪豬、豬獾外其余10種動物都不同程度地感染了寄生蟲，水鹿、毛冠鹿、豹貓感染較為嚴(yán)重。各種動物腸道寄生蟲感染率和寄生蟲種類見表3。

表3 臥龍自然保護(hù)區(qū)野生動物寄生蟲感染情況

4.2 糞便中芽囊原蟲SSU rRNA 基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果 75 份野生動物糞便樣品中，擴(kuò)增出9份約為600 bp 的陽性樣品，測序結(jié)果顯示這9 份樣品均是芽囊原蟲陽性樣品，總感染率為12.0%（9/75），陽性樣品分別來源于3 份水鹿、3 份中華斑羚、1份毛冠鹿、1份中華鬣羚和1份林麝，表明這些野生動物都感染了芽囊原蟲。

4.3 芽囊原蟲SSU rRNA 的序列分析及亞型分布 測序成功的序列在Blast上進(jìn)行相似性比對，結(jié)果顯示有9 個芽囊原蟲陽性樣品，9 個陽性樣品被歸為5 個不同的序列，上傳至NCBI 數(shù)據(jù)庫，獲得的登錄號為MT764942～MT764946。

基于SSU rRNA基因序列構(gòu)建的進(jìn)化樹（圖1）顯示，本次獲得的9 個芽囊原蟲陽性分離株處于5個不同的分支，這與上述歸類結(jié)果一致。3份水鹿芽囊原蟲樣品中，1 份屬于ST5 亞型，2 份為ST14。其他芽囊原蟲樣品中，中華斑羚3 份陽性樣品分別屬于ST1、ST5、ST13 亞型，毛冠鹿源為ST13亞型，中華鬣羚源為ST14亞型，林麝源是芽囊原蟲屬。

圖1 基于SSU rRNA基因片段的芽囊原蟲亞型NJ系統(tǒng)分析

5 討論

本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，四川臥龍自然保護(hù)區(qū)野生動物的腸道寄生蟲感染率為48.0%，感染率低于福建地區(qū)的圈養(yǎng)野生動物（60.0%，24/70）［2］，唐山市野生動物園（55.6%，40/72）［7］，貴州某動物園野生動物（52.0%，13/25）［1］，高于之前徐賢東報道的某動物園野生動物（43.2%，216/500）［8］。這可能是由于圈養(yǎng)野生動物比野外野生動物密度大、飼養(yǎng)環(huán)境差導(dǎo)致的，也可能是動物園長期使用同一種驅(qū)蟲藥使寄生蟲產(chǎn)生了耐藥性所致，不同的地理位置、海拔、氣候也是影響寄生蟲感染率的一個重要因素。寄生蟲病是危害野外野生動物的主要疾病之一，故應(yīng)定期監(jiān)測和評估野生動物寄生蟲感染情況，制定相關(guān)防控方案。

據(jù)筆者所知，本次是我國第一個關(guān)于水鹿和毛冠鹿感染芽囊原蟲的報道。這些亞型中，ST1、ST5 為人獸共患亞型，其中ST1 在非人類靈長類中感染最多，ST14為動物特異性亞型。芽囊原蟲是世界范圍內(nèi)感染人和動物最常見的腸道寄生蟲之一［9］。芽囊原蟲通常通過囊泡污染的水和食物經(jīng)糞口途徑傳播，這是傳播的主要方式［10］。先前的研究表明，芽囊原蟲與腸應(yīng)激綜合征（IBS）和炎癥性腸?。↖BD）有關(guān)［11］。然而，沒有研究能夠證實(shí)囊胚是IBS或IBD的唯一病因［12-13］。在本研究中，芽囊原蟲的患病率為12%，與最近對馴鹿（6.7%）、豬（8.8%）、牛（9.5%）、家雞（13.0%）、丹頂鶴（14.0%）的研究結(jié)果相似［14-15］，可見芽囊原蟲的感染與否與是否是野生動物不存在顯著的相關(guān)性。

6 調(diào)查結(jié)論

本調(diào)查結(jié)果顯示，保護(hù)區(qū)內(nèi)的野生動物感染腸道寄生蟲較為普遍，其中線蟲和絳蟲感染最常見，這可能是因?yàn)樵摷纳x生活史簡單、易反復(fù)感染導(dǎo)致的。保護(hù)區(qū)內(nèi)野生動物繁多，分布廣泛，全部進(jìn)行免疫驅(qū)蟲較難實(shí)現(xiàn)，但可以對野生動物進(jìn)行定期的寄生蟲抽查，將感染率控制在安全紅線以下，特別是人畜共患寄生蟲更應(yīng)該進(jìn)行密切監(jiān)測。對于保護(hù)區(qū)內(nèi)病死或老死的動物尸體，應(yīng)妥善處理、查清病因，以免發(fā)生疫病傳播。

致謝：感謝四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室給予的支持和幫助以及陳福浩、樊佳琦、羅靜怡在樣本處理及鏡檢過程中所做出的貢獻(xiàn)！