閔倩雯， 張顯波， 周其椿*， 李建光， 曾 圣， 陳飛雄， 楊 興

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水產(chǎn)研究所， 貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.貴州省特種水產(chǎn)工程技術(shù)中心， 貴州 貴陽(yáng) 550025)

青海湖裸鯉(Gymnocyprisprzewalskii)屬鯉形目，鯉科，裂腹魚亞科，裸鯉屬，俗稱湟魚、花魚、狗魚、無(wú)鱗魚,為喜冷魚類，分布于青海湖及其支流、克魯克湖、扎陵湖及鄂陵湖，其肉質(zhì)鮮嫩可口，是青海湖中唯一的經(jīng)濟(jì)魚類。近年來(lái)由于自然和人為因素影響，青海湖裸鯉資源急劇下降，甚至面臨衰竭的危險(xiǎn)。貴州省冷水資源量巨大，水質(zhì)良好，水溫常年穩(wěn)定在11～25℃，適宜養(yǎng)殖高品質(zhì)冷水性魚類。與北方冬季嚴(yán)寒期長(zhǎng)，南方夏季水溫偏高相比，貴州養(yǎng)殖冷水魚普遍沒(méi)有“半年養(yǎng)半年閑”的現(xiàn)象，十分適宜養(yǎng)殖青海湖裸鯉。貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所前期從青海引進(jìn)該品種進(jìn)行養(yǎng)殖觀察，該品種已完全適應(yīng)貴州養(yǎng)殖環(huán)境。對(duì)青海湖裸鯉展開生殖生理學(xué)研究，對(duì)解析其性腺發(fā)育機(jī)制具有重要意義，為其接下來(lái)的人工擴(kuò)繁和分子遺傳育種研究奠定理論基礎(chǔ)。

魚類生殖生理受多個(gè)信號(hào)通路的共同調(diào)控，其中轉(zhuǎn)錄因子叉頭框(Fox)家族成員對(duì)脊椎動(dòng)物性腺發(fā)育過(guò)程必不可少。Fox家族的范圍從FoxA到FoxS，包含100多種蛋白質(zhì)[1]。所有的Fox蛋白都具有一個(gè)保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)具有帶翼的螺旋結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)由3個(gè)α螺旋和2個(gè)類似蝴蝶的翼組成[2]。Fox基因家族編碼多個(gè)叉頭蛋白，這些叉頭蛋白表現(xiàn)出顯著的功能多樣性，并參與多種生物學(xué)過(guò)程。在哺乳動(dòng)物中，叉頭基因?qū)τ谠S多生物過(guò)程至關(guān)重要，包括發(fā)育、代謝過(guò)程、性別分化、繁殖和細(xì)胞周期調(diào)控等[1,3-5]。foxk1是Fox家族的成員之一，含有叉頭關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域(forkhead-associated domain)，用于識(shí)別磷酸肽和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，起到轉(zhuǎn)錄調(diào)控下游基因的作用[6-7]。foxk1依賴于其轉(zhuǎn)錄活性，介導(dǎo)廣泛的生物過(guò)程。例如，foxk1通過(guò)與轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物Sin3/Sds3相互作用激活肌源性祖細(xì)胞[8-9]；通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)[10-11]；在重新編程細(xì)胞代謝以誘導(dǎo)有氧糖酵解中扮演重要的調(diào)節(jié)因子[12]；foxk1通過(guò)抑制53BP1定位于DNA損傷位點(diǎn)而負(fù)調(diào)控53BP1的功能，從而改變DSB誘導(dǎo)的以53BP1為中心的蛋白復(fù)合物，從而影響DNA修復(fù)的選擇[13]。然而，foxk1在脊椎動(dòng)物性腺發(fā)育過(guò)程中的功能和作用少見報(bào)道。因此，圍繞青海湖裸鯉卵巢中的foxk1基因克隆和功能開展相關(guān)研究，為青海湖裸鯉的卵巢發(fā)育機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，以期對(duì)脊椎動(dòng)物生殖生理學(xué)和繁殖生物學(xué)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

青海湖裸鯉從青海湖裸鯉救護(hù)中心引進(jìn)，貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所試驗(yàn)基地培育，于自然光周期下22℃恒溫循環(huán)水系統(tǒng)中飼養(yǎng)。投喂?jié)h業(yè)飼料，早中晚各1次。

1.2 青海湖裸鯉foxk1基因克隆

根據(jù)GenBank中報(bào)道的相關(guān)物種的foxk1基因序列，在基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)合成簡(jiǎn)并引物，用此簡(jiǎn)并引物進(jìn)行foxk1部分基因片段擴(kuò)增及測(cè)序，獲取青海湖裸鯉foxk1基因中間部分序列，并通過(guò)5′-RACE(Rapid-amplifiction of cDNA ends)和3′-RACE及與其它魚類基因組序列比對(duì)獲取foxk1基因全序列。

1.3 foxk1基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

進(jìn)化樹包括人(human，Homosapiens)(NP_001032242.1)、小鼠(mouse，Musmusculus)(NP_951031.2)、雞(chicken，Gallusgallus)(XP_015149844.1)、蜥蜴(lizard，Zootocavivipara)(XP_034986413.1)、金線鲃(golden-linebarbel，Sinocyclocheilus grahami)(XP_016122830.1)、金魚(goldfish，Carassiusauratus)(XP_026057237.1)、鯉魚(common carp，Cyprinuscarpio)(XP_018923732.1)、斑馬魚(zebrafish，Daniorerio)(NP_956196.1)、斑點(diǎn)雀鱔(spotted gar，Lepisosteusoculatus)(XP_006637172.1)和研究克隆的青海湖裸鯉foxk1氨基酸序列。進(jìn)化樹以NJ法采用MEGA 6.0構(gòu)建。斑馬魚foxk2(NP_001184186.1)氨基酸序列作為外類群。進(jìn)化樹中數(shù)值表示這一分支的可靠程度。

1.4 脊椎動(dòng)物foxk1基因共線性分析

脊椎動(dòng)物foxk1基因及其相鄰基因圖譜的構(gòu)建分析在Ensembl Genome Browser(http://www.ensembl.org)網(wǎng)頁(yè)上進(jìn)行。

1.5 青海湖裸鯉foxk1組織表達(dá)模式分析

通過(guò)RT-PCR技術(shù)分析青海湖裸鯉foxk1在成魚各個(gè)組織中的表達(dá)情況。解剖24月齡青海湖裸鯉，取其腦、垂體、鰓、心臟、肝臟、腸、脾臟、頭腎、性腺、肌肉和腎臟放于液氮速凍。按照RNAiso Plus操作說(shuō)明提取總RNA，DNase I處理，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用基因特異引物進(jìn)行擴(kuò)增，檢驗(yàn)foxk1在各個(gè)組織中的分布情況。以青海湖裸鯉β-actin作為內(nèi)參。以卵巢cDNA模板為陽(yáng)性對(duì)照，以雙蒸水模板為陰性對(duì)照。

1.6 青海湖裸鯉foxk1基因在各時(shí)期卵巢中的表達(dá)情況

取3、6、9、12、18、24月齡青海湖裸鯉卵巢液氮速凍，提取總RNA，合成cDNA。采用Real-time PCR檢測(cè)foxk1基因在各時(shí)期青海湖裸鯉卵巢中的表達(dá)情況。管家基因β-actin作為內(nèi)參，目標(biāo)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平采用公式R= 2-△△Ct方法計(jì)算[14]。結(jié)果表示為Ct值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用SPSS進(jìn)行顯著性分析，組間差異采用單因素方差(one-way ANOVA)分析Duncan's post-hoc檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)置為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 青海湖裸鯉foxk1 cDNA和氨基酸全序列

基于RT-PCR和RACE分析顯示，青海湖裸鯉foxk1全長(zhǎng)cDNA序列為2 251 bp，包括5′端79 bp的非編碼區(qū)，1 944 bp的蛋白質(zhì)編碼區(qū)和3′端228 bp非編碼區(qū)；開放閱讀框編碼647個(gè)氨基酸(圖1)。

2.2 脊椎動(dòng)物foxk1序列對(duì)比和系統(tǒng)聚類

通過(guò)氨基酸序列的比對(duì)，foxk1在脊椎動(dòng)物間有高度相似性，含有forkhead associated domain和Forkhead domain結(jié)構(gòu)域；克隆的青海湖裸鯉foxk1與人、小鼠、雞、蜥蜴、斑點(diǎn)雀鱔、金線鲃、金魚、鯉魚、斑馬魚foxk1間的氨基酸序列相似性分別為68.2%、69.3%、76.8%、69.6%、82.8%、94.4%、93.2%、94.1%、93.4%(圖2)。

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，人、小鼠、雞、蜥蜴的Foxk1氨基酸序列聚為一支，魚類斑點(diǎn)雀鱔、金魚、鯉魚、斑馬魚、金線鲃、青海湖裸鯉的Foxk1氨基酸序列聚為一支(圖3)。

2.3 脊椎動(dòng)物foxk1基因共線性

共線性分析顯示，foxk1與其鄰近基因gnal2、cardl1、sdk1、ap5z1、radil、mmd2在人、小鼠、雞和龜中的共線性高度保守，腔棘魚的gnal2、cardl1、sdk1、mmd2不共線；魚類中，除斑馬魚外，foxk1與其鄰近基因gnal2、sdk1、radil、mmd2高度保守；4足類和魚類只有g(shù)nal2、sdk1、mmd2和foxk1的共線性保守(圖4)。

2.4 青海湖裸鯉foxk1組織表達(dá)模式

從圖5可知，foxk1高表達(dá)于雌雄個(gè)體的垂體和性腺，中量表達(dá)于雌雄個(gè)體腦，微量表達(dá)于雌雄個(gè)體鰓和心臟。

2.5 青海湖裸鯉foxk1在卵巢不同發(fā)育階段的表達(dá)

從圖6看出，經(jīng)Real-time PCR分析，foxk1在3、6、9、12、18、24月齡卵巢中都存在表達(dá)，在3月齡和6月齡表達(dá)量最低，9月齡持續(xù)顯著升高，后期持續(xù)高表達(dá)。

3 結(jié)論與討論

成功克隆的青海湖裸鯉foxk1基因，含有forkhead associated domain和Forkhead domain結(jié)構(gòu)域；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，以斑馬魚Foxk2作為外類群，克隆的foxk1與其它脊椎動(dòng)物的foxk1聚為一支，且克隆的foxk1與其它脊椎動(dòng)物的foxk1序列同源性最低為68.2%，最高達(dá)94.4%；共線性分析顯示，4足類foxk1基因及相鄰基因相當(dāng)保守；魚類的foxk1基因及相鄰基因的共線性十分保守，斑馬魚的不保守型也可能是由于測(cè)序拼接不完整造成。

foxk1作為轉(zhuǎn)錄因子，在生物的多種信號(hào)通路和器官發(fā)育中起重要作用。研究結(jié)果顯示，foxk1在檢測(cè)的青海湖裸鯉的多個(gè)組織中有表達(dá)，說(shuō)明該基因的功能是多元化的。foxk1在3月和6月卵巢中低表達(dá)，在9月及后期卵巢中高表達(dá)，說(shuō)明foxk1主要在卵巢卵母細(xì)胞發(fā)育和成熟過(guò)程中起作用。在大鯢中的研究顯示，foxk1在卵巢中也存在高表達(dá)，且存在溫度依賴性，相對(duì)于20℃和28℃，在24℃飼養(yǎng)的大鯢卵巢中foxk1表達(dá)最高[15]。foxk1參與脊椎動(dòng)物卵巢發(fā)育，但其具體功能和作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。