李麗 單奔 潘修成 傅涓涓

近年來在慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B，CHB)治療領(lǐng)域中雖然取得了一系列重大進(jìn)展，然而因為其自身諸多特殊因素，CHB的臨床治愈仍存在著諸多的難點[1]。因為與免疫功能息息相關(guān)，近數(shù)十年來，維生素D逐漸得到了國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。有關(guān)其與CHB關(guān)系的研究成果已有較多的報道[8-13]，但是有關(guān)其與CHB的研究目前而言尚顯不足。

資料與方法

一、病例資料

隨機(jī)選取2012年2月至2015年7月在徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院門診及病房就診的CHB患者201例(CHB組)。同時按照性別、年齡配對，篩選2015年8月至2015年10月在本院體檢中心健康體檢人群100例設(shè)立健康對照組，收集他們的外周靜脈血清并常規(guī)凍存于-80 ℃超低溫冰箱。CHB患者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)參照2010年版《慢性乙型肝炎防治指南》[2]確診為CHB患者；(2)至少在近一年內(nèi)未接受過干擾素α或核苷類似物抗HBV治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)混合感染HCV、丁型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒；(2)合并其他肝臟疾病，包括脂肪肝、酒精性肝病、自身免疫性肝病、肝豆?fàn)詈俗冃?、血色素沉積等；(3)臨床確診合并肝硬化；(4)合并任何惡性腫瘤或其他嚴(yán)重慢性疾病。該臨床研究滿足赫爾辛基宣言要求，得到本院倫理委員會的批準(zhǔn)，所有入組患者及健康對照組志愿者均遵從自愿原則，并簽署知情同意書。

二、方法

(一) 血清學(xué)檢測 采用全自動生化分析儀檢測肝功能指標(biāo)(美國Beckman Coulter公司)，納入研究的相關(guān)指標(biāo)參考范圍如下：AST (15～40) U/L，ALT (9～50) U/L，GGT (10～60) U/L，TP (65.0～85.0) g/L，Alb (40.0～55.0) g/L，TBil (0～20.0) μmol/L，DBil (0～6.0) μmol/L。采用熒光定量PCR(Fluorescent quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)方法檢測血清HBV DNA載量(上?？迫A生物公司)，其檢測下限為500 IU/ml。采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法(Chemiluminescent microparticle immuno assay，CMIA)定量測定HBsAg及HBeAg(美國Abbott公司)。采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法(Electro-chemiluminescence immuno assay，ECLI)測定血清25-羥基維生素D[25-(OH)D]水平(瑞士Roche公司)。

(二) 統(tǒng)計學(xué)方法 定量資料采用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，樣本率采用百分?jǐn)?shù)(%)表示。HBsAg、HBV DNA載量進(jìn)行l(wèi)og10對數(shù)轉(zhuǎn)換以改善其正態(tài)性。符合正態(tài)分布的定量資料，兩組間差異的比較采用獨立樣本t檢驗。組間構(gòu)成比的比較采用卡方檢驗。兩個變量間線性關(guān)系采用線性相關(guān)分析。多元線性回歸分析選擇“進(jìn)入”的方法。所有數(shù)據(jù)分析及繪圖均采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包處理，所有統(tǒng)計分析基于雙側(cè)假設(shè)檢驗，檢驗水準(zhǔn)取α = 0.05，P≤ 0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、 入組樣本基本特征

兩組年齡、性別、維生素D水平的比較以及CHB組肝功能、HBV DNA載量、HBsAg及HBeAg滴度的諸項指標(biāo)特征均符合納入與排除標(biāo)準(zhǔn)。其中CHB組和對照組患者的年齡、性別等社會學(xué)資料無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

二、兩組間血清維生素D水平比較

總體比較，兩組間性別及年齡構(gòu)成無顯著差異(P>0.05，表1)。201例CHB患者血清25-(OH)D平均水平為(24.48±10.51) ng/mL，而100例健康人群血清25-(OH)D平均濃度為(21.69±7.45) ng/mL。CHB組維生素D水平明顯高于對照組(t=-2.68，P=0.008)。

100例健康對照組血清樣本均采集于8月—10月，考慮到光照對人體血清維生素D水平可能的影響，特將8月—10月采集的CHB樣本單獨與對照組相比較。按采樣日期分層后的CHB患者共有51例，平均年齡為(27.35±6.91)歲，男性35例(68.63%)，女性16例(31.37%)，血清25-(OH)D平均濃度為(28.66±11.65) ng/mL。相比于對照組，兩組間年齡、性別構(gòu)成依然無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，而血清25-(OH)D平均濃度的差距進(jìn)一步擴(kuò)大(t=-3.90，P<0.001)。

三、兩組間維生素D狀態(tài)分布比較

根據(jù)美國醫(yī)學(xué)研究所(Institute of medicine，IOM)及WHO的提議，將人體血清25-(OH)D濃度 < 10 ng/mL定義為維生素D極度缺乏，10 ng/mL ≤ 25-(OH)D < 20 ng/mL表示維生素D缺乏，定義20 ≤ 25-(OH)D<30 ng/mL為維生素D不足，而≥ 30 ng/mL表示人體維生素D充足，能夠滿足健康成人每日所需。

CHB患者與健康人群之間維生素D狀態(tài)總體分布不同(U=8635.00，P=0.04)。并且在CHB患者中維生素D充足狀態(tài)的比例顯著高于健康人群，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2= 11.16，P=0.001)。其余各狀態(tài)發(fā)生率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。(表2)

表1 兩組間維生素D狀態(tài)分布比較

四、慢性乙型肝炎患者血清維生素D與其他指標(biāo)的關(guān)系

采用線性相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，CHB患者血清維生素D水平與ALT(r=0.18，P=0.04)、GGT(r=0.27，P<0.01)呈顯著線性正相關(guān)，與HBeAg滴度呈顯著線性負(fù)相關(guān)(r=-0.20，P=0.02)。未發(fā)現(xiàn)維生素D水平與其他血清學(xué)指標(biāo)有線性相關(guān)關(guān)系。

而當(dāng)限定Log10 HBV DNA的值在(4.2～8) IU/mL時，維生素D水平與其存在顯著線性負(fù)相關(guān)(n=119，r=-0.20，P=0.03)；此時維生素D水平與ALT、GGT、HBeAg的上述線性相關(guān)關(guān)系仍然成立。

CHB患者血清維生素D水平與ALT、GGT、HBeAg、Log10 HBV DNA的線性關(guān)系散點圖見圖1。

另外，當(dāng)采用多元線性回歸分析時發(fā)現(xiàn)，性別、ALT、GGT、HBeAg、Log10 HBV DNA與血清25-(OH)D相關(guān)(P<0.001)，其中性別和Log10 HBV DNA是血清25-(OH)D水平的最強影響因素。

討 論

一、 慢性乙型肝炎患者血清維生素D水平的相關(guān)研究

明顯有別于國內(nèi)外部分研究得出的過高或者過低的血清學(xué)水平[3-4]，本研究CHB患者血清維生素D的平均水平以及維生素D缺乏狀態(tài)的發(fā)生率均接近于國際主流的研究成果[5-6]，可信度更高。已有學(xué)者報道，人體血清維生素D水平的影響因素可能包括季節(jié)(采樣時間)、25-(OH)D的檢測方法、人種、地理緯度、著裝習(xí)慣、膚色、相關(guān)基因差異等等[7-8]。并且，對于未攝入維生素D補充劑的人群而言，維生素D的主要來源為日光(紫外線)照射下人體皮膚合成而來。正因如此，有國外學(xué)者建議對某一特定研究而言有必要納入季節(jié)(采樣時間)因素的考慮，但是目前而言，大部分涉及維生素D水平對比的研究均沒有考慮到這一點。本研究發(fā)現(xiàn)，對于徐州地區(qū)人群而言，無論納入或未納入采樣時間因素考慮，CHB患者血清維生素D水平均高于健康人群，結(jié)果更加穩(wěn)定可靠。盡管這一現(xiàn)象有別于國內(nèi)外的一些研究[9]，國內(nèi)仍然有研究得出了同本研究一樣的結(jié)論[10]，對于這種矛盾形成的原因尚需要進(jìn)一步研究探討，其可能與本研究納入的CHB患者均處于肝炎活動狀態(tài)有關(guān)。

圖1 CHB患者血清維生素D水平與相關(guān)指標(biāo)線性相關(guān)

此外，正因為與美國相比本研究納入人群所擁有的人種、地理緯度、著裝習(xí)慣、膚色、相關(guān)基因等因素均有差異，因此國際通用的人體維生素D狀態(tài)評估標(biāo)準(zhǔn)可能并不能貼切的表達(dá)相關(guān)人群的血清維生素D狀態(tài)。換言之，相較于健康人群，本研究的CHB患者所擁有的可能不是更加“充足”的血清維生素D水平，而是應(yīng)該理解為一種相對異常的狀態(tài)。

二、CHB患者血清維生素D水平與其他指標(biāo)的關(guān)系

德國的Farnik等[11]通過多元回歸分析發(fā)現(xiàn)血清25-(OH)D水平與HBV DNA載量獨立相關(guān)，低載量的HBV DNA對應(yīng)相對高的血清25-(OH)D濃度。但是隨后香港的Wong等[12]均報道血清25-(OH)D水平與HBV DNA載量無明顯相關(guān)性；只是前者得出血清VitD水平與肝纖維化程度相關(guān)，后者得出基線水平的VitD缺乏(< 32 ng/mL)與臨床的不良事件(包括肝細(xì)胞癌、肝硬化以及死亡)的發(fā)生密切相關(guān)。伊朗的研究者[13]同樣通過回歸分析總結(jié)出了維生素D水平與HBV DNA載量的相關(guān)性。

與以往研究不同，本研究發(fā)現(xiàn)血清25-(OH)D水平與中高度水平的HBV DNA載量(4.2 IU/mL< Log10HBV DNA < 8 IU/mL)呈線性負(fù)相關(guān)(r=-0.20，P=0.03)，這可能反映出在一定范圍內(nèi)的HBV DNA載量受到維生素D水平的調(diào)控，而不同維生素D水平調(diào)控的免疫狀態(tài)之間存有差異。這一結(jié)論表面上似乎與CHB組血清25-(OH)D水平更高這一結(jié)果有矛盾之處，但是必須認(rèn)識到在維生素D代謝通路中，其真正發(fā)揮生物學(xué)功能的活性形式是1，25-二羥基維生素D[1,25-(OH)2D]，且后者與25-(OH)D之間在負(fù)反饋以及其他一系列因素參與下保持著動態(tài)平衡。這些復(fù)雜的機(jī)制使得本研究結(jié)論尚需要大量基礎(chǔ)研究的支持來加以解釋。

本研究還發(fā)現(xiàn)維生素D水平與ALT(r=0.18，P=0.04)、GGT(r=0.27，P<0.01)呈線性正相關(guān)，與HBeAg呈線性負(fù)相關(guān)(r=-0.20，P=0.02)，同樣提示在慢性乙型肝炎狀態(tài)下，維生素D可能在肝臟炎癥以及機(jī)體抗HBV免疫反應(yīng)中起到重要的作用。