王志堯， 韓紅園， 王 韜， 陳 欣， 張海艷， 常 霞

（1.河南省科學(xué)院天然產(chǎn)物重點實驗室，鄭州 450002； 2.河南省生物技術(shù)開發(fā)中心，鄭州 450002）

黃荊屬于被子植物，是馬鞭草科的牡荊屬植物，分布在中國的許多省市. 其果實、葉、枝、根均可入藥，性溫，味辛、苦，具有清熱解表、利濕排毒、通經(jīng)活絡(luò)的功效. 據(jù)《本草綱目》、《唐本草》、瑤醫(yī)“老班藥”下的“七十二風(fēng)”藥印度醫(yī)學(xué)阿育吠陀中記載，黃荊可用來治療風(fēng)濕病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［1-2］. 具有廣泛的抗癌活性［3-6］，對人乳腺癌（MCF-7、MDA-MB-4355、T47D）［7-10］，卵巢癌（COCI）［11-13］，結(jié)腸癌（HT-29）［14］，人肝癌（SMMC-7721、HepG2）［15-16］，人宮頸癌（HeLa）［17-19］，人絨毛膜癌（JEG-3）［20-22］等細(xì)胞株有顯著的抑制增殖作用. 木脂素類化合物因為具有抗炎、解熱鎮(zhèn)痛、免疫增強、抗氧化作用，是黃荊發(fā)揮抗風(fēng)濕類濕及抗癌作用的重要化學(xué)成分［23-25］. 為了更深一步研究黃荊子中抗風(fēng)濕類風(fēng)濕和癌癥的活性成分組及其作用機制，我們研究了從黃荊子分離純化vitecannasides B 的工藝，并最終通過DEPT、HSQC、HMBC、1H-1H COSY、NOESY等1D和2D NMR波譜技術(shù)對vitcannasides B的13C、1H NMR圖譜進行詳細(xì)NMR解析，特別是化合物上葡萄糖基團的準(zhǔn)確解析未見報道，為下一步開發(fā)抗風(fēng)濕、抗癌復(fù)方新藥奠定基礎(chǔ)，詳細(xì)報道如圖1所示.

圖1 Vitecannasides B的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of vitecannasides B

1 實驗

1.1 黃荊子樣品前處理

取未粉碎黃荊種子5 kg，粉碎，用3倍量75%的乙醇70 ℃加熱回流提取3次，合并三次提取液65 ℃減壓回收溶劑得浸膏460 g.

1.2 黃荊子浸膏聚酰胺柱層析分析

1.2.1 樣品預(yù)處理 將第一步所得浸膏用30～60目的聚酰胺拌樣（拌樣量為m（浸膏）∶m（聚酰胺）=0.5∶1），置50 ℃水浴鍋上干燥至粉末狀.

1.2.2 聚酰胺填料的預(yù)處理 稱取2.25 kg的聚酰胺粉末（30～60目）取95%的工業(yè)級乙醇10 L，煮沸1 h，冷卻.

1.2.3 裝柱 取高58 cm，內(nèi)直徑15 cm的分離柱一根，濕法裝柱. 用蒸餾水沖到無醇味，然后加入處理好的樣品，經(jīng)測量，樣品層厚度6 cm.

1.2.4 柱層析過程 流動相為水→95%乙醇，具體流動次序如下：

水（50 L）→35%乙醇（60 L）→50%乙醇（60 L）→75%乙醇（60 L）→95%乙醇（60 L），分別收集以上各流出液，通過多功能提取濃縮罐→大旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（60 ℃）→小旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（54 ℃）三級濃縮得到5個樣品，分別標(biāo)記為A-1（水），A-2（35%乙醇），A-3（50%乙醇），A-4（75%乙醇），A-5（95%乙醇）.

1.3 聚酰胺柱分離5個樣品高效液相分析

使用高效液相儀器對浸膏和聚酰胺柱分離出的5 個樣品進行分析（分析參數(shù)：儀器名稱Aglient1260；檢測器DAD；流動相為乙腈和水，流動次序為10%乙腈～100%乙腈，沖柱30 min→10%乙腈沖柱5 min；流速1 mL/min）. 由以上6個圖譜分析所得水部位多為極性大的成分，其他波份段的成分有重疊；A-2、A-3部位紫外吸收較強且綠色熒光較明顯，可能含有木脂素、黃銅類成分較多. 因此，著重對A-2、A-3 部位進行分析. 樣品A-3減壓濃縮后得浸膏35 g，硅膠（100～200目）30 g拌樣并干燥后，上樣于硅膠（200～300目）300 g柱，以石油醚-丙酮溶劑系統(tǒng)（8∶1→4∶1→2∶1→1∶1→1∶2→1∶4→0∶1），進行中壓制備柱層析，150 mL收集一個流分，所得各流份進行TLC 分析，合并相同流份，得到13個流份（Fr.1～Fr.13），流份Fr.3、Fr.5放置析晶，分別進行重結(jié)晶后，得到化合物1（100 mg）.

2 儀器

所有NMR 實驗均在Bruker DPX 400 型核磁共振儀上進行，1H NMR 的工作頻率為400 Hz，13C NMR 的工作頻率為100.577 MHz，以DMSO-d6為測試溶劑，使用5 mm NMR探頭. 分析用Agilent 1260系列高效液相色譜儀；中壓制備色譜儀為天津博納艾杰爾中壓快速純化制備系統(tǒng)，型號FS-82000s. 聚酰胺（浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠出品）、柱層析用硅膠（100～200 目和200～300 目）為青島海洋化工廠產(chǎn)品；色譜柱為Zorbax Eclipse XDB-C18（Agilent，4.6 cm×150 cm，1 mL/min；9.4 mm×250 mm，2 mL/min）；薄層層析（TLC）：薄層層析硅膠GF254薄層預(yù)制板為青島海洋化工廠產(chǎn)品，顯色劑為5%的H2SO4乙醇溶液，噴灑后加熱顯色.

3 試藥

黃荊種子購自安徽省亳州藥材市場，標(biāo)本保存于河南省科學(xué)院天然產(chǎn)物重點實驗室.

4 結(jié)果與討論

化合物1為黃色透明油狀物（甲醇），其13C NMR數(shù)據(jù)顯示26條碳峰信號，DEPT顯示，2個伯碳：δC55.26、54.99；2 個仲碳：δC69.42、61.38；14 個叔碳：δC193.14、148.54、119.67、117.25、114.51、112.42、111.02、104.16、76.58、76.52、73.86、70.20、42.60、39.98；8 個季碳：δC150.51、147.27、147.15、144.45、135.78、134.06、133.47、123.21.

根據(jù)碳化學(xué)位移規(guī)律，其中的2個伯碳均為甲氧基（δC55.26、54.99）；2個仲碳為連氧碳（δC69.42、61.38），應(yīng)歸屬C-3α、C-6″；14 個叔碳中，有2 個一般脂肪碳（δC42.60、39.98），1 個糖的端基碳（δC104.16）歸屬于C-1″，6 個雙鍵碳（δC148.54、119.67、117.25、114.51、112.42、111.02），1 個醛基碳（δC193.14）歸屬于C-2α，4 個環(huán)狀單糖上叔碳（δC76.58、76.52、73.86、70.20）；8個季碳信號全部為雙鍵碳（δC150.51、147.27、147.15、144.45、135.78、134.06、133.47、123.21）. 綜合分析，化合物1為一個單糖氧苷類化合物.

HSQC 指出，δC69.42（C-3α）與δH3.72（1H，dd，J=10.0，4.0 Hz）、3.20（2H，m）相關(guān)，表明δH3.72、3.20（其中1 個氫）分別歸屬于H-3α（a）、3α（b）.1H-1H COSY 指出，δH3.72［H-3α（a）］、3.20［H-3α（b）］均與δH3.35（1H，m）相關(guān)，加之δC39.98（叔碳）與δH3.35 HSQC 相關(guān)，表明δH3.35歸屬于H-3，δC39.98歸屬于C-3；δH3.35（H-3）與δH4.42（1H，brs）相關(guān)，加之δC42.60（叔碳）與δH4.42 HSQC 相關(guān)，表明δC42.60、δH4.42 分別歸屬于C-4、H-4. δC193.14（C-2α）與δH9.39（1H，s）HSQC相關(guān)，表明δH9.39歸屬H-2α.

HMBC指出，δC193.14（C-2α）、39.98（C-3）與δH7.46（1H，brs）相關(guān)，加之δC148.54（叔碳）與δH7.46 HSQC相關(guān)，表明δH7.46歸屬H-1，δC148.54歸屬于C-1；δC134.06（季碳）與δH9.39（H-2α）、4.42（H-4）、3.35（H-3）相關(guān)，表明δC134.06 歸屬C-2；δC112.42（叔碳）與δH7.46（H-1）相關(guān)，δC148.54（C-1）與δH7.04（1H，s）相關(guān)，加之δC112.42（叔碳）與δH7.04 HSQC 相關(guān)，表明δH7.04 歸屬于H-8，δC112.42 歸屬于C-8；δC133.47（季碳）與δH7.46（H-1）、7.04（H-8）、4.42（H-4）、3.35（H-3）相關(guān)，表明δC133.47 歸屬于C-10；δC123.21（季碳）與δH7.46（H-1）、6.70（1H，brs）、4.42（H-4）相關(guān)，表明δC123.21歸屬C-9，δH6.70歸屬H-5；δC117.25（叔碳）與δH4.42（H-4）相關(guān)，同時δC117.25與δH6.70（H-5）HSQC相關(guān)，表明δC117.25歸屬于C-5；δC147.27（季碳）與δH7.04（H-8）、6.70（H-5）相關(guān)，δC150.51（季碳）與δH6.70（H-5）、3.68（3H，s）相關(guān)，加之δC55.67（甲氧基）與δH3.68（3H，s）HSQC 相關(guān)，表明δC147.27、150.51 歸屬于C-6、C-7，且δC150.51 的碳上還有甲氧基（δH3.68）取代，但C-6、C-7的歸屬區(qū)分需進一步確定. NOESY指出，δH7.04（H-8）與3.68相關(guān)，表明δH3.68應(yīng)連接在C-7上，故δC150.51歸屬于C-7，147.27歸屬于C-6.

根據(jù)氫化學(xué)位移規(guī)律和偶合分裂情況，δH6.54（1H，d，J=8.0 Hz）、6.32（1H，dd，J=8.0，2.0 Hz）、6.59（1H，d，J=2.0 Hz）分別歸屬于H-5′、H-6′、H-2′，加之δC114.51（叔碳）/δH6.54、119.67（叔碳）/6.32、111.02（叔碳）/6.59 HSQC相關(guān)，表明δC114.51、119.67、111.02分別歸屬于C-5′、C-6′、C-2′. HMBC指出，δC135.78（季碳）與δH6.54（H-5′）、4.42（H-4）、3.35（H-3）相關(guān)，表明δC135.78 歸屬于C-1′；δC144.45（季碳）與δH6.59（H-2′）、6.54（H-5′）、6.32（H-6′）相關(guān)，表明δC144.45 歸屬于C-4′；δC147.15（季碳）與δH6.59（H-2′）、6.54（H-5′）、3.86（3H，s）相關(guān)，同時δC55.26（伯碳）與δH3.86（3H，s）HSQC相關(guān)，表明δC147.15歸屬于C-3′，δH3.86、δC55.26分別為連接在3′位上的甲氧基氫、碳信號.

糖部分的歸屬主要是依靠1H-1H COSY、HSQC、HMBC 等2D NMR 技術(shù)解析的.1H-1H COSY 指出，δH4.19（1H，d，J=7.7 Hz）與δH3.24（1H，m）相關(guān)，同時δH4.19與δC104.16（C-1″）HSQC相關(guān)，δH3.24與δC73.86（叔碳）HSQC 相關(guān)，表明δH4.19、3.24 分別歸屬于H-1″、H-2″，δC73.86 歸屬C-2″. 同時δC61.38（C-6″）與δH3.80（1H，dd，J=12.0 Hz）、3.63（1H，dd，J=12.0，7.0 Hz）HSQC 相關(guān)，表明δH3.80、3.63 分別歸屬于H-6″a、H-6″b.1H-1H COSY 指出，δH3.80（H-6″a）與3.63（H-6″b）、3.20（2H，m）相關(guān)，加之δC76.52（叔碳）與δH3.20 HSQC 相關(guān)，表明δC76.52 歸屬于C-5″，δH3.20（其中1 個氫）歸屬于H-5″. 另外，δC76.52（C-5″）與δH3.29（1H，m）HMBC 相關(guān)，加之δC70.20（叔碳）與3.29 HSQC 相關(guān)，表明δH3.29、δC70.20 分別歸屬于H-4″、C-4″. 剩下的δH3.35（2H，m）其中1 個氫應(yīng)歸屬于H-3″. HSQC 指出，δC76.58（叔碳）與δH3.35（H-3″）相關(guān)，故δC76.58歸屬于C-3″. 根據(jù)H-1″在1H NMR譜中的偶合常數(shù)為7.7 Hz，提示該端基質(zhì)子和C-2″位質(zhì)子均為豎鍵，二面夾角約為180°，表明該六碳吡喃單糖基團為β-D 構(gòu)型［26］. 該β-D 六碳吡喃單糖基團的1H及13C NMR圖譜數(shù)據(jù)與文獻［27］報道的vitecannasides B 的β-D葡萄糖基團的數(shù)據(jù)一致，故糖基為β-D葡萄糖基團.

NOESY指出，δH4.42（H-4）與δH3.72［H-3α（a）］、3.20［H-3α（b）］相關(guān)，表明H-3α與H-4處于環(huán)的同一側(cè).1H NMR 圖譜顯示H-4 的信號為寬單峰，推斷其與H-3 偶合較小，說明這兩個氫的雙面夾角接近90°，也進一步說明H-4 與H-3 在環(huán)的兩側(cè). 由此，化合物1 為6-Hydroxy-4-（4-hydroxy-3-methoxyphenyl）-3-hydroxymethyl-7-methoxy-3，4-dihydro-2-naphthal-dehyde-3α-β-D-glucopyranoside（見圖1），其1D 及2D NMR 詳細(xì)解析數(shù)據(jù)見表1. 以上光譜數(shù)據(jù)與文獻［27］報道的vitecannasides B 一致，故鑒定化合物1為vitecannasides B.

表1 Vitecannasides B的NMR數(shù)據(jù)（CD3OD，400 MHz/H）Tab.1 NMR data of vitecannasides B（CD3OD，400 MHz/H）

續(xù)表

致謝：鄭州大學(xué)分析測試中心的朱衛(wèi)國及康建勛兩位老師幫助進行核磁共振儀樣品測試，河南省科學(xué)院天然產(chǎn)物重點實驗室的趙天增研究員對樣品核磁共振圖譜數(shù)據(jù)解析方面給予指導(dǎo)，在此特致謝意！