喻 華,徐雪松,李 敏,楊啟文,楊 青,張 嶸,褚云卓,單 斌,郭大文,胡志東0,簡(jiǎn) 翠,李 軼,廖 康,劉根焰,季 萍,金 炎,倪語(yǔ)星,沈 瀚,蘇丹虹,卓 超,王 輝0,魏蓮花,俞云松,張 泓,張利俠,周鐵麗,朱 鐳,王明貴,朱德妹,胡付品
當(dāng)前,細(xì)菌耐藥已成為全球公共健康領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn),其中尤以碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細(xì)菌(carbapenem-resistantEnterobacterales, CRE)引起的感染形勢(shì)最為嚴(yán)峻。碳青霉烯類抗菌藥物包括亞胺培南、美羅培南和厄他培南等,是治療多重耐藥革蘭陰性桿菌所致感染最有效的抗菌藥物之一。隨著該類藥物在臨床的廣泛應(yīng)用,腸桿菌目細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率呈逐年快速上升趨勢(shì)。CHINET中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)歷年監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示[1-2],我國(guó)臨床分離肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率從2005年的3%快速攀升至2019年的25%以上,上升幅度高達(dá)8倍。2018年全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)(CARSS)數(shù)據(jù)顯示,全國(guó)1 429所醫(yī)院臨床分離的肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的平均耐藥率為10.1%,部分省市甚至超過20%[3]。由于CRE菌株通常還攜帶有對(duì)其他抗菌藥物耐藥的基因,對(duì)抗菌藥物呈廣泛耐藥甚至全耐藥的特征,使臨床的抗感染治療面臨無藥可用的困境[4]。
美國(guó)疾病預(yù)防控制中心關(guān)于CRE的定義[5]為滿足以下任意一個(gè)條件:①對(duì)亞胺培南、美羅培南、厄他培南或多利培南任何一種碳青霉烯類耐藥者;對(duì)于天然對(duì)亞胺培南敏感性降低的細(xì)菌(如摩根菌屬、變形桿菌屬和普羅威登菌屬等),需參考除亞胺培南外的其他碳青霉烯類抗菌藥物的藥敏結(jié)果。②產(chǎn)生碳青霉烯酶。
產(chǎn)生碳青霉烯酶是腸桿菌目細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥最主要的機(jī)制[6]。按照Ambler分子分類方法,碳青霉烯酶可分為A、B和D三類。A類為絲氨酸碳青霉烯酶,以blaKPC(blaKPC-2-blaKPC-55)、blaSME(blaSME-1-blaSME-5)、blaIMI(blaIMI-1-blaIMI-18)、blaNMC和blaGES(blaGES-1-blaGES-43)型為主;B類為金屬β內(nèi)酰胺酶,以b l aNDM(blaNDM-1-blaNDM-29)、blaIMP(blaIMP-1-blaIMP-85)、blaVIM(blaVIM-1-blaVIM-69)、blaGIM(blaGIM-1-blaGIM-2)和blaSPM型為主;D類為OXA-48型絲氨酸碳青霉烯酶,以blaOXA-181和blaOXA-232為主。除產(chǎn)生碳青霉烯酶外,少數(shù)菌株對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥的機(jī)制是產(chǎn)生超廣譜β內(nèi)酰胺酶和/或AmpC酶合并外膜孔蛋白表達(dá)下調(diào)或缺失。
不同國(guó)家、不同地區(qū)、不同醫(yī)院、不同人群以及不同細(xì)菌所產(chǎn)的碳青霉烯酶種類均有差異[7-9]。我國(guó)臨床分離的CRE菌株產(chǎn)生的碳青霉烯酶以KPC和NDM型為主,少數(shù)菌株產(chǎn)生OXA-48、IMP和VIM型碳青霉烯酶[10-12]。KPC-2型酶為KPC型碳青霉烯酶最主要的亞型,NDM-1和NDM-5是NDM型金屬酶中最主要的亞型,而OXA-181和OXA-232型酶是OXA-48型碳青霉烯酶中最主要的亞型。CHINET中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)對(duì)2018年收集自全國(guó)39所醫(yī)院935株CRE菌株的研究結(jié)果顯示,產(chǎn)KPC、NDM和OXA-48型碳青霉烯酶菌株所占比例分別為51.6%(482/935)、35.7%(334/935)和7.3%(68/935),其中少數(shù)菌株產(chǎn)碳青霉烯酶復(fù)合酶。兒童和成人患者中分離的碳青霉烯類耐藥菌株產(chǎn)生的碳青霉烯酶型別有所差異,兒童患者分離的碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌主要產(chǎn)生KPC、NDM和OXA-48型碳青霉烯酶,而成人患者分離株主要產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶;但兒童和成人患者分離的碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌主要產(chǎn)生NDM型金屬β內(nèi)酰胺酶。
由于不同種類的抗菌藥物對(duì)產(chǎn)生不同碳青霉烯酶菌株的體外抗菌活性不同,準(zhǔn)確、快速地對(duì)CRE產(chǎn)生的碳青霉烯酶進(jìn)行檢測(cè)并分型,對(duì)于臨床抗感染治療的精準(zhǔn)用藥和醫(yī)院感染預(yù)防控制具有重要的價(jià)值[13-15]。如目前剛上市的抗菌新藥頭孢他啶-阿維巴坦[16-17],對(duì)產(chǎn)KPC和OXA-48型絲氨酸碳青霉烯酶菌株具有高度抗菌活性,但對(duì)產(chǎn)金屬β內(nèi)酰胺酶菌株無抗菌活性。目前處于臨床研究階段的美羅培南-韋博巴坦(meropenem-vaborbactam)[18-19]和亞胺培南-雷利巴坦(imipenem-relebactam)[20],對(duì)產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶菌株具有高度抗菌活性,但對(duì)產(chǎn)金屬β內(nèi)酰胺酶和D類OXA-48型碳青霉烯酶菌株無抗菌活性。同時(shí),尚有多種新型碳青霉烯酶抑制劑正處于臨床研究階段,包括enmetazobactam[21]、taniborbactam[22-24]和齊達(dá)巴坦(zidebactam)[25-27]等。同時(shí),實(shí)驗(yàn)室亦可根據(jù)不同碳青霉烯酶的特征,如金屬β內(nèi)酰胺酶不能水解氨曲南,KPC型碳青霉烯酶的活性可被阿維巴坦、韋博巴坦或雷利巴坦抑制,被克拉維酸弱抑制,通過開展聯(lián)合藥敏試驗(yàn)制定精準(zhǔn)的抗感染治療方案[28-29]。目前已上市及處于臨床研究階段的不同碳青霉烯酶抑制劑的抑酶活性見表1(表1內(nèi)容參考文獻(xiàn)[30- 31])。
表1 不同酶抑制劑抑酶活性
目前實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)碳青霉烯酶的方法分為表型檢測(cè)和基因型檢測(cè)。表型檢測(cè)方法包括Carba NP試驗(yàn)、改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)(包括mCIM和eCIM)、碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)和時(shí)間飛行質(zhì)譜技術(shù)等;基因型檢測(cè)方法包括酶免疫層析技術(shù)和基因檢測(cè)技術(shù)。執(zhí)行上述碳青霉烯酶檢測(cè)方法時(shí),均需按要求選擇相應(yīng)的陽(yáng)性質(zhì)控菌株和陰性質(zhì)控菌株進(jìn)行質(zhì)控,以確保檢測(cè)方法的可靠性。下文簡(jiǎn)單介紹目前臨床微生物實(shí)驗(yàn)室較為常用的碳青霉烯酶檢測(cè)方法的原理、結(jié)果判讀、檢測(cè)性能以及優(yōu)缺點(diǎn)等,以供不同層次的實(shí)驗(yàn)室根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的檢測(cè)方法。不同碳青霉烯酶實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法比較見表2。
美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)于2015年推薦Carba NP試驗(yàn)檢測(cè)腸桿菌目細(xì)菌和銅綠假單胞菌產(chǎn)生的碳青霉烯酶[32]。Carba NP試驗(yàn)具體操作步驟可參考最新版CLSI M100文件要求。該試驗(yàn)原理為細(xì)菌產(chǎn)生的碳青霉烯酶可以水解亞胺培南,導(dǎo)致溶液pH值改變而發(fā)生顏色變化。研究顯示,Carba NP試驗(yàn)檢測(cè)碳青霉烯酶(包括產(chǎn)KPC、NDM、VIM、IMP、SPM或和SME型碳青霉烯酶菌株)的靈敏度和特異度均超過90%[33]。Carba NP試驗(yàn)具有操作簡(jiǎn)單和快速的特點(diǎn)(4~6 h),適合所有臨床微生物實(shí)驗(yàn)室開展。缺點(diǎn)是需特殊試劑,其中一些需自制(有效期短);一些分離株會(huì)出現(xiàn)無效結(jié)果;可能無法檢測(cè)某些類型碳青霉烯酶(如染色體介導(dǎo)OXA型碳青霉烯酶)。
CLSI推薦改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)(mCIM)和EDTA改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)(eCIM)用于腸桿菌目細(xì)菌和銅綠假單胞菌中碳青霉烯酶的檢測(cè)[32]。mCIM和eCIM試驗(yàn)具體操作步驟可參考最新版CLSI M100文件要求。其原理是將美羅培南與受試菌懸液混合,若受試菌產(chǎn)生碳青霉烯酶,可破壞美羅培南的抗菌活性;若受試菌不產(chǎn)碳青霉烯酶,美羅培南仍可保持其對(duì)大腸埃希菌ATCC 25922的抗菌活性。根據(jù)金屬β內(nèi)酰胺酶的活性可被EDTA抑制的特點(diǎn),mCIM和eCIM聯(lián)合可區(qū)分細(xì)菌產(chǎn)生的絲氨酸碳青霉烯酶或金屬β內(nèi)酰胺酶。mCIM試驗(yàn)可用于檢測(cè)腸桿菌目細(xì)菌和銅綠假單胞菌中的碳青霉烯酶,而mCIM聯(lián)合eCIM僅適用于腸桿菌目細(xì)菌以區(qū)分其產(chǎn)生的碳青霉烯酶類型(絲氨酸碳青霉烯酶或金屬β內(nèi)酰胺酶)。研究顯示,mCIM試驗(yàn)檢測(cè)腸桿菌目細(xì)菌和銅綠假單胞菌中碳青霉烯酶的靈敏度和特異度均超過97%,特異度為100%[34-36]。mCIM試驗(yàn)檢測(cè)不動(dòng)桿菌屬實(shí)驗(yàn)室間的特異度和重復(fù)性均較差,方法未獲得CLSI認(rèn)可。eCIM試驗(yàn)區(qū)分腸桿菌目細(xì)菌中金屬β內(nèi)酰胺酶和絲氨酸碳青霉烯酶的靈敏度> 95%、特異度>92%。mCIM和eCIM試驗(yàn)具有操作簡(jiǎn)單、無需特殊試劑和成本低的特點(diǎn),適合所有臨床微生物實(shí)驗(yàn)室開展。缺點(diǎn)是需過夜孵育,耗時(shí)長(zhǎng)。
5.3.1 A類絲氨酸碳青霉烯酶和B類金屬β內(nèi)酰胺酶的檢測(cè) 根據(jù)A類絲氨酸碳青霉烯酶的活性可被
表2 不同碳青霉烯酶檢測(cè)方法原理、適用標(biāo)本、檢測(cè)時(shí)間、結(jié)果報(bào)告及其優(yōu)缺點(diǎn)
3-氨基苯硼酸(APB)抑制[37],而金屬β內(nèi)酰胺酶的活性可被EDTA抑制的特點(diǎn)[38-41],APB聯(lián)合EDTA可對(duì)單產(chǎn)A類絲氨酸碳青霉烯酶、單產(chǎn)B類金屬β內(nèi)酰胺酶以及同時(shí)產(chǎn)生A類絲氨酸碳青霉烯酶和B類金屬β內(nèi)酰胺酶的腸桿菌目細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)并區(qū)分[42],具體實(shí)驗(yàn)操作步驟見附件1。研究顯示,碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)檢測(cè)單產(chǎn)KPC或金屬酶菌株的靈敏度均為100%,檢測(cè)同時(shí)產(chǎn)KPC和金屬酶菌株的靈敏度為96.8%,特異度為98.8%[42]。本方法具有操作簡(jiǎn)單、結(jié)果容易閱讀以及可檢測(cè)單產(chǎn)或同時(shí)產(chǎn)不同類型碳青霉烯酶的特點(diǎn),適合所有臨床微生物實(shí)驗(yàn)室開展,但缺點(diǎn)是需特殊試劑、耗時(shí)長(zhǎng)以及不能檢測(cè)OXA-48型碳青霉烯酶。
5.3.2 D類OXA-48型碳青霉烯酶的檢測(cè) 相比于A類絲氨酸碳青霉烯酶和B類金屬β內(nèi)酰胺酶,目前可用于檢測(cè)并區(qū)分OXA-48型碳青霉烯酶的表型檢測(cè)方法極少。Tsakris等[43]利用APB和EDTA對(duì)不同種類碳青霉烯酶的抑制特點(diǎn),報(bào)道了一種可簡(jiǎn)單檢測(cè)并區(qū)分OXA-48型碳青霉烯酶的檢測(cè)方法,具體實(shí)驗(yàn)操作步驟見附件2。該方法檢測(cè)并區(qū)分OXA-48型碳青霉烯酶的靈敏度和特異度分別為96.3%和97.7%,具有操作簡(jiǎn)單且結(jié)果容易閱讀的特點(diǎn),適合所有臨床微生物實(shí)驗(yàn)室開展,但缺點(diǎn)是需特殊試劑、耗時(shí)長(zhǎng)。
基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS) 是近年來發(fā)展的簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的病原微生物鑒定方法。質(zhì)譜技術(shù)通過比較不同細(xì)菌間質(zhì)譜峰強(qiáng)度差異,可快速對(duì)碳青霉烯類耐藥細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè);或者基于碳青霉烯酶水解碳青霉烯類而使藥物的特異峰發(fā)生改變的特點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)[44-48]。質(zhì)譜技術(shù)雖然可快速檢測(cè)碳青霉烯酶的種類,但缺點(diǎn)是目前僅對(duì)某種碳青霉烯酶有為數(shù)不多的研究且無統(tǒng)一可行的方法,而酶水解法需要配制抗菌藥物溶液作為底物與待測(cè)菌進(jìn)行共孵育(孵育時(shí)間約1~2.5 h),操作較繁瑣,不適于在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開展。
利用抗原抗體免疫層析技術(shù)快速檢測(cè)腸桿菌目細(xì)菌中的碳青霉烯酶,是近年發(fā)展起來的目前為止以細(xì)菌菌落為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法中最快速的檢測(cè)技術(shù)[49-50]。該方法操作簡(jiǎn)單(不同產(chǎn)品實(shí)驗(yàn)操作步驟需參考產(chǎn)品說明書),加樣后測(cè)試條上相應(yīng)區(qū)域標(biāo)記線條出現(xiàn)紅色(除對(duì)照線條外),提示該菌產(chǎn)生所對(duì)應(yīng)的碳青霉烯酶。目前該測(cè)試條最多可同時(shí)快速檢測(cè)KPC、NDM、OXA-48、VIM和IMP五種碳青霉烯酶。與測(cè)序方法相比,酶免疫層析技術(shù)檢測(cè)碳青霉烯酶基因的靈敏度和特異度均在90%以上。酶免疫層析技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單,結(jié)果容易判讀的優(yōu)點(diǎn),但缺點(diǎn)是價(jià)格較高,各實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)自身?xiàng)l件選擇性地開展碳青霉烯酶的檢測(cè),譬如對(duì)于高?;颊撸庖咭种苹颊呋蚬撬枰浦不颊叩龋┓蛛xCRE菌株碳青霉烯酶基因的快速檢測(cè),以協(xié)助臨床盡早啟動(dòng)有針對(duì)性的抗感染治療方案。
分子檢測(cè)技術(shù)可直接快速檢測(cè)臨床標(biāo)本如直腸拭子中CRE菌株中的碳青霉烯酶基因。如GeneXpert[51-52]、Verigene[53]和Filmarray[54]等系統(tǒng)采用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)主要的碳青霉烯酶基因包括KPC、NDM、IMP、VIM和OXA-48等進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)時(shí)間一般在1 h左右,檢測(cè)靈敏度和特異度可達(dá)96%以上。分子檢測(cè)技術(shù)具有快速(可直接從標(biāo)本中檢測(cè))和結(jié)果容易判讀的優(yōu)點(diǎn),但缺點(diǎn)是價(jià)格昂貴,各實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)自身?xiàng)l件有選擇性地開展碳青霉烯酶的檢測(cè)。比如對(duì)于高?;颊撸庖咭种苹颊呋蚬撬枰浦不颊叩龋┓蛛xCRE菌株碳青霉烯酶基因的快速檢測(cè),可協(xié)助臨床盡早啟動(dòng)有針對(duì)性的抗感染治療方案。
實(shí)驗(yàn)室碳青霉烯酶檢測(cè)流程見圖1。
如以細(xì)菌為樣本進(jìn)行檢測(cè),建議與細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)結(jié)果同時(shí)報(bào)告。除按要求提供一般細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)報(bào)告規(guī)定的信息外,碳青霉烯酶檢測(cè)報(bào)告信息包括①檢測(cè)方法:表型或基因型檢測(cè)方法。②檢測(cè)結(jié)果報(bào)告及解釋:采用mCIM和eCIM方法需同時(shí)報(bào)告“陽(yáng)性”或“陰性”檢測(cè)結(jié)果并判斷該菌所產(chǎn)碳青霉烯酶種類或基因型;采用碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)可直接報(bào)告最終檢測(cè)結(jié)果,或同時(shí)報(bào)告紙片抑菌圈直徑并判斷該菌所產(chǎn)碳青霉烯酶種類;采用免疫層析或分子檢測(cè)技術(shù),直接報(bào)告檢測(cè)到的碳青霉烯酶基因型。③碳青霉烯酶表型或基因型檢測(cè)結(jié)果解釋等。參考表3。
圖1 實(shí)驗(yàn)室碳青霉烯酶檢測(cè)流程圖
表3 碳青霉烯酶檢測(cè)結(jié)果報(bào)告
如以臨床標(biāo)本或細(xì)菌(少數(shù)情況可能在藥敏試驗(yàn)前即以菌株直接檢測(cè)以早期指導(dǎo)臨床抗感染治療)直接檢測(cè)碳青霉烯酶基因,可以單獨(dú)報(bào)告檢測(cè)結(jié)果,報(bào)告信息包括①患者姓名、年齡、性別、科室、標(biāo)本類型;②臨床診斷;③檢測(cè)目的,評(píng)估治療效果、去定植或基于感染控制目的;④基因型檢測(cè)方法、結(jié)果解釋。參考表 3。
每天或每次試驗(yàn)時(shí)應(yīng)測(cè)試陽(yáng)性或陰性質(zhì)控菌 株。
按照不同檢測(cè)方法可檢測(cè)的碳青霉烯酶型別或靶基因種類,選擇相應(yīng)的陽(yáng)性和陰性質(zhì)控菌株。陽(yáng)性質(zhì)控菌株首選肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705(KPC型碳青霉烯酶陽(yáng)性株)、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-2146(NDM型金屬β內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性株)、肺炎克雷伯菌ATCC BAA 2524(OXA-48型碳青霉烯酶陽(yáng)性株);陰性質(zhì)控菌株首選肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706(非產(chǎn)碳青霉烯酶株)。如實(shí)驗(yàn)室無法獲得上述首選ATCC陽(yáng)性或陰性質(zhì)控菌株,亦可選擇經(jīng)DNA測(cè)序明確產(chǎn)相應(yīng)型別碳青霉烯酶基因的菌株作為陽(yáng)性質(zhì)控菌,以及選擇大腸埃希菌ATCC 25922作為陰性質(zhì)控菌株。
附件1
A類絲氨酸碳青霉烯酶和B類金屬β內(nèi)酰胺酶的檢 測(cè)
實(shí)驗(yàn)步驟按CLSI推薦的紙片擴(kuò)散法進(jìn)行:將待測(cè)菌調(diào)制成0.5麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙?,均勻涂布于MH瓊脂平板上,隨后貼4張?zhí)记嗝瓜╊惪咕幬锛埰ㄒ话銥閬啺放嗄匣蛎懒_培南)于瓊脂表面。一張紙片不加任何液體,一張紙片滴加APB溶液(終濃度300 μg/片,初始濃度為30 mg/L的溶液可滴加10 μL)、一張紙片EDTA溶液(終濃度292 μg/ 片,初始濃度0.1 mol/L的溶液可滴加10 μL)、最后一張同時(shí)滴加APB溶液(終濃度300 μg/片)和EDTA溶液(終濃度292 μg/片)。過夜孵育后量取紙片抑菌圈直徑。結(jié)果判讀如下:①添加APB溶液的亞胺培南紙片抑菌圈直徑與單藥紙片相差≥5 mm,即可判斷該受試菌株產(chǎn)A類碳青霉烯酶(圖1A);②添加EDTA溶液的亞胺培南紙片抑菌圈直徑與單藥紙片相差≥5 mm,即可判斷該受試菌株產(chǎn)生B類碳青霉烯酶(圖1B);③如僅同時(shí)添加APB和EDTA的亞胺培南紙片抑菌圈直徑與單藥紙片相差 ≥5 mm,可判斷該受試菌株同時(shí)產(chǎn)A類碳青霉烯酶和B類金屬β內(nèi)酰胺酶(圖1C);④如含酶抑制劑的亞胺培南紙片抑菌圈直徑與單藥相差均<5 mm,可判斷該菌不產(chǎn)A類或B類碳青霉烯酶,其耐藥機(jī)制可能為產(chǎn)生OXA-48型碳青霉烯酶,或產(chǎn)生ESBL和/或AmpC酶合并膜孔蛋白的下調(diào)或缺失。
圖1 碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)檢測(cè)A類和B類碳青霉烯酶
附件2
D類OXA-48型碳青霉烯酶的檢測(cè)
實(shí)驗(yàn)步驟按CLSI推薦的紙片擴(kuò)散法進(jìn)行:將大腸埃希菌ATCC 25922調(diào)制成0.5麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙?,均勻涂布于MH瓊脂平板上,將一張亞胺培南紙片于瓊脂表面。取兩張無菌空白紙片,每張紙片取待測(cè)菌純分菌落3~4個(gè),在亞胺培南紙片左右各貼上一張已取待測(cè)菌菌落的空白藥敏紙片。然后在亞胺培南紙片左側(cè)的空白紙片加上EDTA溶液(終濃度292 μg/片,初始濃度0.1 mol/ L的溶液可滴加10 μL),在亞胺培南紙片右側(cè)的空白紙片同時(shí)加上EDTA(終濃度292 μg/片,初始濃度0.1 mol/L的溶液可滴加10 μL)和APB溶液(終濃度600 μg/片,初始濃度為50 mg/L的溶液可滴加12 μL)。過夜孵育后判讀結(jié)果:①含EDTA或3-氨基苯硼酸空白紙片均出現(xiàn)細(xì)菌矢狀生長(zhǎng)者,提示該菌產(chǎn)OXA-48型碳青霉烯酶(圖2A);②含EDTA或APB空白紙片均未出現(xiàn)細(xì)菌矢狀生長(zhǎng)者,提示該菌產(chǎn)金屬β內(nèi)酰胺酶(圖2B);③僅含EDTA空白紙片出現(xiàn)細(xì)菌矢狀生長(zhǎng)者,提示該菌產(chǎn)A類絲氨酸碳青霉烯酶(圖2C)。
圖2 碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)檢測(cè)OXA-48型碳青霉烯酶