趙 艷 吳新民

既往基礎(chǔ)研究提示，麻醉和(或)手術(shù)可能促發(fā)術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD)或阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)[1，2]，幾種麻醉劑可誘發(fā)細(xì)胞凋亡和β淀粉樣蛋白(amyloid-β protein，Aβ)水平升高，而Aβ是AD患者腦中老年斑的主要成分，在AD發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用[3]。同時(shí)，神經(jīng)炎癥被認(rèn)為是AD和POCD發(fā)病機(jī)制之一，手術(shù)和(或)麻醉可能與神經(jīng)炎癥有關(guān)[2，4]。氙是稀有惰性氣體，具有麻醉和神經(jīng)保護(hù)作用[5]，對(duì)AD神經(jīng)病理發(fā)病機(jī)制的影響尚不清楚。異氟烷曾廣泛用于臨床麻醉，有報(bào)道異氟烷的神經(jīng)毒性作用[1，3]。氧化亞氮[6]俗稱笑氣，是最古老的麻醉氣體，沿用至今。細(xì)胞是生物體基本單位，本研究旨在從微觀細(xì)胞和分子水平探討新型稀有麻醉劑氙對(duì)細(xì)胞凋亡和Aβ的影響，并與頗具爭(zhēng)議的異氟烷和最古老的麻醉劑氧化亞氮比較，為麻醉藥如何減輕神經(jīng)細(xì)胞創(chuàng)傷尋找可能的方法，并為預(yù)防POCD和AD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞系：由哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院麻省總醫(yī)院謝仲淙教授研究組實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。H4人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(H4)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了表達(dá)人全長(zhǎng)淀粉樣前蛋白的H4人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(H4 human neuroglioma cells stably transfected to express human full-length amyloid precursor protein，H4-APP)。培養(yǎng)液：含9%胎牛血清的高糖杜伯克改良的鷹牌介質(zhì)(dulbecco’s modified eagle’s medium，DMEM)細(xì)胞培養(yǎng)液，加入青霉素100 U/ml，鏈霉素100 μg/ml和L-谷氨酰胺2 mmol/L；H4-APP細(xì)胞培養(yǎng)液中另加G418硫酸氫鹽200 μg/ml(Sigma公司，英國(guó))。細(xì)胞處理：將H4和H4-APP細(xì)胞置于細(xì)頸瓶中，儲(chǔ)存于含5% CO2和95%空氣的37 ℃濕潤(rùn)恒溫箱里，隔天更換培養(yǎng)液，直至細(xì)胞長(zhǎng)滿細(xì)頸瓶底部。再將細(xì)胞以1×106密度種植于直徑60 mm有3 ml細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，其余細(xì)胞置于新的細(xì)頸瓶或儲(chǔ)存于液氮中。培養(yǎng)皿中的細(xì)胞適應(yīng)一晚，第2天將培養(yǎng)液更換為2 ml新的培養(yǎng)液后立即進(jìn)行麻醉氣體暴露實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組及方法參考文獻(xiàn)[3，7～15]。

1.2 麻醉氣體暴露實(shí)驗(yàn)

將上述細(xì)胞培養(yǎng)皿置于實(shí)驗(yàn)用封閉筒中，通過麻醉機(jī)將氙、異氟烷或氧化亞氮輸入封閉筒中，采用氣體監(jiān)護(hù)儀(Datex-Ohmeda, GE healthcare, Bradford, UK; 氙監(jiān)護(hù)儀a 439XE monitor, Air Products, London, UK)監(jiān)測(cè)氧、CO2和麻醉氣體濃度，細(xì)胞暴露于以下一種氣體中2 h：對(duì)照組[21%氧、5% CO2和平衡氮?dú)猓琀4 Naive細(xì)胞(H4對(duì)照組)和H4-APP 細(xì)胞(H4-APP對(duì)照組)]、2%異氟烷[21%氧和5% CO2，H4-APP 細(xì)胞(Iso組)]、74%氧化亞氮[21%氧和5% CO2，H4-APP 細(xì)胞(N2O組)]、70%氙[25%氧和5% CO2，H4-APP 細(xì)胞(Xe組)]。接觸氣體2 h后，細(xì)胞和培養(yǎng)液在恒溫箱中孵育24 h。

1.3 培養(yǎng)液中分泌的Aβ42含量測(cè)定

Aβ是由淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)水解而來，由細(xì)胞分泌，在細(xì)胞基質(zhì)沉淀聚積后有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性作用。人體內(nèi)Aβ最常見的亞型是Aβ40和Aβ42，其中Aβ42具有更強(qiáng)的神經(jīng)毒性，且更易聚集，形成Aβ 沉淀的核心，引發(fā)神經(jīng)毒性作用[16，17]。收集條件細(xì)胞培養(yǎng)液，4 ℃ 14 000×g離心10 min，取上清液，按照ELISA試劑盒(Invitrogen公司，美國(guó))說明步驟，檢測(cè)人Aβ42含量(n=4)[15]。

1.4 細(xì)胞中B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)的X蛋白(Bcl-2 associated x，Bax)、核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cleaved caspase-3)表達(dá)測(cè)定

冰上裂解細(xì)胞，收集勻漿，4 ℃ 14 000×g 離心30 min，上清液行蛋白定量測(cè)定，取50 μg蛋白上樣，4%～12% NuPAGE中電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉3 h。分別加入Bcl-2抗體(1∶1000，Abcam公司，英國(guó))、Bax抗體、裂解的caspase-3抗體或磷酸化NF-κB p65抗體(1∶1000, Cell Signaling公司，美國(guó))，4 ℃孵育過夜。TBST洗滌PVDF膜，加入羊抗兔二抗(1∶1000，Abcam公司，英國(guó))，室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，ECL化學(xué)法發(fā)光、顯影(Syngene公司，英國(guó))。以各目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參α-tubulin條帶灰度值的比值反映蛋白表達(dá)，并以相對(duì)于H4細(xì)胞對(duì)照組(相對(duì)數(shù)值設(shè)為1)的差異倍數(shù)表示(n=4)。計(jì)算Bcl-2/Bax。

1.5 H4細(xì)胞的活力分析

采用 3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide，MTT][18，19](Merck KGaA公司，德國(guó))法。使用最低限度基本培養(yǎng)基(minimum essential medium, MEM)(Gibco公司，英國(guó))將MTT稀釋為0.5 mg/ml，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，將600 μl MTT溶液加入含有細(xì)胞的24孔板每孔中，置于含5% CO2和 95% 空氣的37 ℃濕潤(rùn)恒溫箱中孵育2 h，吸除上清液，留下甲瓚晶體溶解于1 ml DMSO(Sigma公司，英國(guó))中。使用吸光分析儀(Dynex Technologies公司，英國(guó))的分光光度法，波長(zhǎng)595 nm，檢測(cè)甲瓚產(chǎn)物吸光度(n=6)，吸光度數(shù)值越大，說明細(xì)胞活力越強(qiáng)[18，19]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

與H4對(duì)照組相比，70%氙處理2 h使H4-APP細(xì)胞Bcl-2表達(dá)上調(diào)，2%異氟烷、74%氧化亞氮或70%氙處理2 h使H4-APP細(xì)胞Bax表達(dá)下調(diào)；70%氙或2%異氟烷處理2 h使H4-APP細(xì)胞Bcl-2/Bax增高(P<0.05)，見表1和圖1、2。

圖1 5組細(xì)胞接觸氣體后24 h時(shí)Bcl-2的表達(dá)(Western blot，相對(duì)于H4對(duì)照組的差異倍數(shù))，與H4對(duì)照組比較，*P<0.05 圖2 5組細(xì)胞接觸氣體后24 h時(shí)Bax的表達(dá)(Western blot，相對(duì)于H4對(duì)照組的差異倍數(shù))，與H4對(duì)照組比較，**P<0.01，***P=0.001 圖3 5組細(xì)胞接觸氣體后24 h時(shí)裂解的Caspase-3的表達(dá)(Western blot，相對(duì)于H4對(duì)照組的差異倍數(shù)),與H4對(duì)照組比較，**P<0.01 圖4 5組細(xì)胞接觸氣體后24 h時(shí)磷酸化NF-κB的表達(dá)(Western blot，相對(duì)于H4對(duì)照組的差異倍數(shù)),與H4-APP對(duì)照組比較，**P<0.01，***P<0.001

70%氙或2%異氟烷處理2 h使H4-APP細(xì)胞裂解的caspase-3表達(dá)下調(diào)并增強(qiáng)H4-APP細(xì)胞活力(P<0.05)，見表1、2和圖3。與H4-APP對(duì)照組比較，70%氙、2%異氟烷或74%氧化亞氮處理2 h使H4-APP細(xì)胞NF-κB表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，見表1和圖4。

表1 5組細(xì)胞接觸氣體后24 h Bcl-2、Bax、裂解的caspase-3、NF-κB的表達(dá)(Western blot，相對(duì)于H4對(duì)照組的差異倍數(shù))和Bcl-2/Bax的比較

與H4細(xì)胞相比，所有H4-APP細(xì)胞(無論是否接觸麻醉氣體)均產(chǎn)生較多的Aβ(P<0.05)；與H4-APP對(duì)照組比較，70%氙、2%異氟烷或74%氧化亞氮暴露2 h未使H4-APP細(xì)胞產(chǎn)生Aβ增加(P>0.05)，見表2。

表2 5組細(xì)胞接觸氣體后24 h時(shí)細(xì)胞活力(相對(duì)于H4對(duì)照組的差異倍數(shù)，n=6)和條件培養(yǎng)液中人Aβ42含量(n=4)的比較

3 討論

本實(shí)驗(yàn)選擇氙、異氟烷和氧化亞氮濃度的依據(jù)：馬大青研究組[7，8]前期工作表明70%氙(相當(dāng)于1個(gè)最低肺泡有效濃度)麻醉具有神經(jīng)保護(hù)作用，另一研究組也采用70%氙麻醉[9]，是氙臨床麻醉常用濃度。異氟烷臨床常用濃度為1%～2.5%，謝仲淙等[3，10～12]采用與本實(shí)驗(yàn)相同或不同細(xì)胞系所用異氟烷濃度為2%。氧化亞氮臨床相關(guān)濃度為50%～75%，謝仲淙和馬大青等采用70%氧化亞氮加低濃度異氟烷或75%氧化亞氮麻醉[8，13，14]，本實(shí)驗(yàn)密切監(jiān)測(cè)氣體濃度，氧化亞氮組實(shí)際濃度是：74%氧化亞氮，21%氧氣和5% CO2(總濃度100%，CO2濃度各組一致)。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)選擇3種吸入麻醉藥濃度。

麻醉氣體接觸時(shí)間的確定：謝仲淙研究組基于細(xì)胞的研究，麻醉藥接觸時(shí)間一般為6 h[3，11～13]，基于小鼠的研究接觸異氟烷2 h[10]。馬大青等研究氙的接觸時(shí)間為2 h[8]。采用與謝仲淙等研究相同的細(xì)胞系接觸2%異氟烷2 h結(jié)果如何尚無研究報(bào)道。異氟烷可表現(xiàn)為神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)毒性雙重作用，取決于異氟烷接觸濃度和持續(xù)時(shí)間[20]。岳云研究組報(bào)道隨著麻醉時(shí)程延長(zhǎng)(4 h與2 h比較)，老年大鼠認(rèn)知功能損害更為明顯[21]。因此，本實(shí)驗(yàn)確定麻醉藥接觸時(shí)間為2 h。

在不同實(shí)驗(yàn)條件下，麻醉藥可呈現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)[22～24]或神經(jīng)毒性雙重作用[25～27]。與既往報(bào)道[5，28]一致，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氙處理2 h上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，下調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá)，Bcl-2/Bax增高，并抑制caspase-3激活，從而發(fā)揮抗凋亡作用。但Brosnan等[29]研究顯示，1或2 MAC(而不是0.75 MAC)氙處理6 h導(dǎo)致大鼠海馬切片神經(jīng)元凋亡，1 MAC(而不是2 MAC)異氟烷和七氟烷處理6 h增加神經(jīng)元凋亡；而異氟烷0.75 MAC 2 h預(yù)處理海馬切片減少1 MAC氙、異氟烷和七氟烷接觸后的神經(jīng)元凋亡?？梢?，不同麻醉藥濃度、處理時(shí)間和是否預(yù)處理等效果不同[30]。

本研究結(jié)果表明，短時(shí)間接觸氙或異氟烷可能通過Bcl-2/Bax信號(hào)通路和抑制caspase-3激活防御細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)對(duì)象H4為腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的啟示是，如果在臨床上，對(duì)于此類手術(shù)患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)，可能存在潛在的風(fēng)險(xiǎn)；對(duì)于神經(jīng)膠質(zhì)瘤手術(shù)患者，如何更好地選擇麻醉藥物？本研究提供初步實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但是從體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)到臨床實(shí)際還有很遠(yuǎn)的距離，需要大量臨床研究來檢驗(yàn)。

本實(shí)驗(yàn)顯示短時(shí)間接觸氙、異氟烷或氧化亞氮可通過下調(diào)NF-κB表達(dá)抑制神經(jīng)炎癥。既往研究證實(shí)[31～33]神經(jīng)炎癥在AD和POCD中的作用，以及緩解炎癥的神經(jīng)保護(hù)效果[34]。對(duì)臨床麻醉的提示是，臨床濃度氙、異氟烷或氧化亞氮在一定條件下可能減輕或減少AD和POCD的發(fā)生和發(fā)展，但尚需深入的臨床研究驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)中，與H4細(xì)胞相比，H4-APP細(xì)胞無論是否接觸麻醉氣體均產(chǎn)生較多的Aβ，說明細(xì)胞內(nèi)在特性比麻醉藥對(duì)Aβ生成的影響更大，提示基因特征在AD發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵作用。

本研究中，與H4 Naive細(xì)胞相比，所有H4-APP細(xì)胞(無論是否接觸麻醉氣體)均產(chǎn)生較多的Aβ(P<0.05)，似應(yīng)促進(jìn)H4-APP細(xì)胞凋亡，但結(jié)果并非如此。可能的解釋是，雖然H4-APP細(xì)胞各組Aβ42水平較H4 Naive細(xì)胞對(duì)照組顯著升高，但是同時(shí)各組Aβ42水平絕對(duì)值均較低(平均15～18 pg/ml)。既往研究[35，36]顯示Aβ濃度足夠高而且作用時(shí)間足夠長(zhǎng)后，才會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和神經(jīng)毒性(例如認(rèn)知功能障礙)。本實(shí)驗(yàn)中，H4-APP細(xì)胞所產(chǎn)生的Aβ有限濃度和較短作用時(shí)間，還未達(dá)到促進(jìn)H4-APP細(xì)胞凋亡的程度，提示臨床患者AD和POCD的發(fā)生是一個(gè)逐漸積累和演變的過程。

本實(shí)驗(yàn)初步觀察在特定條件下(H4人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系接觸麻醉氣體2 h)氙、異氟烷和氧化亞氮對(duì)凋亡、神經(jīng)炎癥和Aβ的影響，在不同研究條件下，麻醉藥與AD和POCD相關(guān)神經(jīng)病理發(fā)病機(jī)制之間的關(guān)系是復(fù)雜多變的。今后應(yīng)進(jìn)一步探討氙不同濃度和接觸時(shí)間的影響，觀察其他吸入麻醉藥、靜脈麻醉藥的作用，特別是開展臨床研究以探究麻醉/手術(shù)與POCD和AD之間的聯(lián)系，尋找POCD和AD可能的防治措施，造福于人類。

綜上所述，短時(shí)間接觸氙或異氟烷可能與Bcl-2/Bax信號(hào)通路和抑制caspase-3激活防御細(xì)胞凋亡有關(guān)；臨床濃度氙、異氟烷或氧化亞氮通過下調(diào)NF-κB表達(dá)減輕炎癥，對(duì)Aβ生成無影響；H4-APP細(xì)胞比H4細(xì)胞產(chǎn)生Aβ多。提示在一定條件下麻醉藥的神經(jīng)保護(hù)作用以及基因特征在AD發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵作用。

致謝：本課題為趙艷在北京大學(xué)第三醫(yī)院麻醉科工作期間所獲中華醫(yī)學(xué)會(huì)麻醉學(xué)分會(huì)留學(xué)基金項(xiàng)目。本實(shí)驗(yàn)在英國(guó)倫敦帝國(guó)理工學(xué)院馬大青教授研究組實(shí)驗(yàn)室完成，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞由哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院麻省總醫(yī)院謝仲淙教授研究組實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送，特表感謝！