李 清，羅永堅,2，吳柔賢，賈俊婷，張文虎，宋松泉，劉 軍

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心/廣東省農(nóng)作物種質(zhì)資源保存與利用重點實驗室，廣東 廣州 510640；2. 湖北民族大學(xué)林學(xué)園藝學(xué)院，湖北 恩施 445000）

【研究意義】大豆起源于中國，栽種歷史悠久，地理分布廣泛，兼具糧食作物和經(jīng)濟作物的雙重價值，是我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)重要的農(nóng)業(yè)產(chǎn)品［1-2］。因此，大豆種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析和種質(zhì)資源創(chuàng)新利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，在大豆種質(zhì)資源遺傳多樣性研究中，SSR分子標記技術(shù)應(yīng)用較廣泛［3-4］。DNA分子身份證技術(shù)以SSR分子標記技術(shù)為基礎(chǔ)，通過對SSR擴增多態(tài)性結(jié)果分析并進行數(shù)字化編碼賦值，得到獨一無二的數(shù)字編碼作為DNA分子身份證，具有準確性高、快速簡便的優(yōu)點，對種質(zhì)資源的知識產(chǎn)權(quán)保護具有重要作用［5］。目前，植物DNA分子身份證已廣泛應(yīng)用于品種保護和種質(zhì)資源鑒定中。唐玉娟等［6］對34 份廣東夏大豆材料進行了SSR檢測，并利用5個SSR引物構(gòu)建其分子身份證，為廣東夏大豆品種的鑒定提供了依據(jù)。Zhang等［7］用SSR分子標記對中黃18、中黃68、中黃35、中黃13和菏豆13等5個大豆栽培種進行檢測，構(gòu)建了進化樹，并進行了主成分分析，發(fā)現(xiàn)中黃18、中黃68、中黃35之間存在較大差異，而中黃13與菏豆13的親緣性較高。基于DNA分子身份證的廣泛應(yīng)用和高通量測序的快速發(fā)展［8］，田志喜團隊［9-10］從2 898份大豆種質(zhì)中篩選了26個野生和栽培大豆，進行了遺傳多樣性分析和泛基因組學(xué)研究，構(gòu)建進化樹并挖掘得到與性狀相關(guān)的重要基因，對育種具有重要意義。

【本研究切入點】光熱資源豐富、雨水充足的華南地區(qū)是大豆生產(chǎn)最具發(fā)展?jié)摿Φ牡貐^(qū)之一［11-12］。廣東省大豆品種資源豐富，但目前有關(guān)該地區(qū)大豆遺傳多樣性及DNA分子身份證的研究報道不多［6,13-14］，涉及的品種數(shù)量太少。此外，對廣東省農(nóng)家種大豆的品種來源和性狀鑒定方面的信息收集相對較少。【擬解決的關(guān)鍵問題】鑒于此，本研究采用30對SSR分子標記對收集的96份廣東大豆農(nóng)家種資源進行遺傳多樣性分析，初步確定大豆資源的親緣關(guān)系，篩選核心引物并構(gòu)建DNA分子身份證體系，以期為廣東省大豆種質(zhì)資源遺傳評價、資源保護及創(chuàng)新利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試96份大豆材料為幼苗期葉片，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心于全國第三次資源調(diào)查活動中從廣東省19個市37個縣市收集得到，樣品采集信息見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 選用CTAB法［15］提取植株DNA，采集幼苗期10株大豆葉片混合提取DNA并進行電泳檢測DNA質(zhì)量，DNA保存于-20℃。

1.2.2 PCR擴增 大豆引物（表2）來源于Soybase數(shù) 據(jù) 庫（http://soybase.org/resources/ssr.php）， 以等位變異片段≥3，擴增效率高，引物特異性好以及具有多態(tài)性為標準進行預(yù)篩選，從中得到了30對SSR引物，所用引物均由閱微基因技術(shù)有限公司合成。PCR擴增體系為10 μL，其中10×Buffer 1 μL，2.5 mmol/L dNTP 0.8 μL，Primer Mix（5 μmol/L），正、反 SSR引物各0.6 μL，HSTaq（5U/μL）0.1 μL，模板 DNA 1 μL，ddH2O補齊至10 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s、60℃退火30 s、72 ℃延伸 30 s，35個循環(huán)；72℃延伸 5 min，4℃保存。

1.2.3 PCR產(chǎn)物毛細管電泳檢測及數(shù)據(jù)分析 于96孔板中每孔加入ROX-500分子量內(nèi)標0.5 μL和甲酰胺混合液8.5 μL，混勻后加入1 μL 經(jīng)純化后的PCR產(chǎn)物，然后使用ABI3730XL測序儀進行毛細管電泳檢測。待電泳結(jié)束后，利用Genemapper 3.2軟件自動生成每個位點的圖譜文件，分析擴增片段峰值，讀取擴增片段大小。

根據(jù)一個引物一個基因位點，將不同引物不同資源電泳片段大小錄入到EXCEL中，用DataFormate2.7軟件轉(zhuǎn)化成POPGENE軟件所要求的格式后，使用該軟件分析計算等位變異片段數(shù)（A）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）和Shannon 信息指數(shù)（I）。采用DataFormate2.7軟件對電泳數(shù)據(jù)進行轉(zhuǎn)化為“0”“1”格式二元矩陣，使用NTSYS-PC 2.1軟件計算遺傳距離矩陣［16］，使用MEGA7軟件進行聚類分析構(gòu)建NJ系統(tǒng)樹狀圖，并使用在線軟件iTOL（https://itol.embl.de/）優(yōu)化。

1.2.4 DNA分子身份證構(gòu)建 大豆種質(zhì)資源SSR分子身份證的編碼，采用數(shù)字和字母表示，具體方法如下：根據(jù)每對引物擴增片段（等位變異片段）從小到大以阿拉伯數(shù)字1～9標注，9個以上的等位變異片段，以大寫英文字母A～Z 標注，若該位點在某個資源中無擴增記為0；每個引物位點占兩位，構(gòu)建成數(shù)字與字母相結(jié)合的DNA分子身份證。將身份證編碼錄入條形碼生成器（http://www.t-x-m.com/）構(gòu)建條形碼身份證。將大豆的基本信息、形態(tài)特征、生長特征、品質(zhì)數(shù)據(jù)、DNA身份證編碼等文本信息錄入二維碼生成器（https://cli.im/），生成可供掃描的大豆DNA身份證二維碼。

表1 供試大豆資源信息Table 1 Information of 96 soybean resources

表2 SSR引物序列Table 2 List of 30 SSR primers

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標記多態(tài)性分析

利用PCR擴增后的產(chǎn)物經(jīng)熒光毛細管電泳后，準確獲取每對引物在不同材料的DNA片段大小和相應(yīng)的毛細管電泳圖。由表3可知，采用30對引物對96份大豆共擴增出273個多態(tài)性等位變異片段，平均每對引物擴增出14.29個多態(tài)性等位變異片段。其中，引物Sat_258擴增出的等位變異片段最多（23.0個）；引物Satt619、Satt256和Satt703擴增出的等位變異片段最少（4.0個）。30對引物檢測到等位變異片段數(shù)（Na）共273個，平均每對引物擴增出多態(tài)性等位變異片段9.1個。Nei’s多樣性指數(shù)（H）的變化范圍為0.4324～0.9348，平均值為0.7133；Shannon 信息指數(shù)（I）的變化范圍為0.8007～2.8763，平均值為1.5893；期望雜合度（He）的變化范圍為0.4345～0.9348，平均值為0.7138；多態(tài)性信息含量（PIC）的范圍為0.3891～0.9310，平均值為0.6786。一般認為，當PIC＞0.50時可以認為該引物為高度多態(tài)性信息引物［17］。因此，所選的大部分引物為高度多態(tài)性信息引物，說明這些引物可用于大豆種質(zhì)資源的鑒定和研究。

2.2 聚類分析

根據(jù)30對引物在96個大豆資源的多態(tài)性片段信息建立數(shù)據(jù)矩陣，由NTSYSpc 2.1e軟件用UPGMA的算法計算遺傳距離矩陣，然后采用MEGA7的Neighbour-joining算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹［16］，結(jié)果表明，96份大豆資源可以劃分為3個類群（圖1），第一個組類群包含47份大豆資源，第二個組類群包含32份大豆資源，第三個組類群包含17份大豆資源。結(jié)合聚類結(jié)果和原產(chǎn)地分析發(fā)現(xiàn)，3個組群同一地理來源的資源并沒有完全聚在一起，不同地區(qū)來源的資源發(fā)生了聚類，這說明收集的96份廣東省農(nóng)家種大豆具有品種多樣性，各類群品種之間親緣關(guān)系較近，遺傳差異較小。

2.3 核心引物的構(gòu)建

構(gòu)建DNA分子身份證的最終目的是使用最少的SSR標記引物達到區(qū)分所收集的農(nóng)家種大豆種質(zhì)資源并賦予其可辨的分子身份證，同時選取的SSR引物需要滿足能區(qū)分最多大豆種質(zhì)的原則。存在特異性位點的材料能通過單一的引物即可直接鑒定，但一般存在于少量的品種中。為了區(qū)分盡可能多的材料，通常采用多引物組合，直至將所有材料完全區(qū)分開。以30對引物的PIC指數(shù)（表3）為標準；選用PIC最高的引物開始篩選供試資源，再加入PIC第二高的引物組合；以此類推，直至篩選出可將全部供試大豆種質(zhì)全部區(qū)分的引物組合，結(jié)果見表4。通過PIC由高到低組合，發(fā)現(xiàn)在30對SSR引物中用9對引物即可完全分離96份大豆?；谧钌僖飬^(qū)分最多種質(zhì)的原則，對9對引物進行精簡化，將分離種質(zhì)數(shù)目較低的Satt197、Satt547、AZ302047引物在9對引物中剔除，發(fā)現(xiàn)Sat_258、Sat_351、Satt540、BE806308、Sat_164、Satt346 共6對引物組合即可將96個大豆資源完全區(qū)分。

為驗證上述6對引物分離96份大豆的可行性，根據(jù)這6對SSR引物的等位變異系數(shù)分別為23、16、11、13、17、8，按照引物組合能區(qū)分最多品種數(shù) A=N1N2N3… Nn（N1、N2、N3… Nn為每對引物的觀測等位變異片段數(shù)Na）的理論值計算，結(jié)果表明6對SSR引物組合能夠區(qū)分最大品種數(shù)目的理論值為7 156 864個。因此該6對SSR引物可作為核心引物用于96份大豆DNA指紋圖譜身份證的構(gòu)建。

2.4 大豆DNA分子身份證編碼

采用上述6對核心引物構(gòu)建了96份大豆資源的DNA分子身份證（表5）；進一步將DNA身份證導(dǎo)入條形碼生成器，將大豆的資源信息、特征特性、產(chǎn)量表現(xiàn)、栽種措施及DNA身份證編碼等文本信息錄入二維碼生成器，成功構(gòu)建了96份廣東大豆資源的DNA身份證二維碼。圖2為第43號大豆資源的DNA身份證結(jié)果示例。

3 討論

SSR分子標記作為穩(wěn)定、高效且多態(tài)性好的種質(zhì)資源鑒評方法［18］，有助于分析大豆的親緣關(guān)系與遺傳多樣性，并被廣泛應(yīng)用于大豆種質(zhì)資源鑒評研究中［19］。本研究利用30對擴增效果清晰、穩(wěn)定的SSR引物檢測96份廣東省農(nóng)家種大豆資源，結(jié)果顯示平均等位變異片段數(shù)（Na）為9.1個，平均有效等位變異片段數(shù)（Ne）為4.2657個，Nei’s多樣性指數(shù)（H）平均值為0.7133，Shannon 信息指數(shù)（I）平均值為1.5893，期望雜合度（He）平均值為0.7138，多態(tài)性信息含量（PIC）平均值為0.6786。根據(jù)30對SSR引物在96份廣東省農(nóng)家種大豆資源中的多態(tài)性結(jié)果進行親緣關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，供試大豆資源可以分為3個類群，這3個類群并不完全依據(jù)地理劃分，聚類分析結(jié)果并不能用以判定品種的來源地，但該親緣關(guān)系說明所收集的96份農(nóng)家種大豆具有資源多樣性，達到了廣泛收集農(nóng)家品種的目的，為廣東省大豆品種選育積累了豐富的種質(zhì)資源。

表3 30對SSR在96份大豆的遺傳信息統(tǒng)計Table 3 Genetic information statistics of 30 SSR pairs in 96 soybean resources

圖1 96份大豆樣品基于遺傳距離的Neighbour-joining系統(tǒng)發(fā)生樹Fig. 1 Neighbour-joining phylogenetic tree of 96 soybean resources based on genetic distance

本研究通過對96份大豆進行遺傳多樣性和親緣性分析，以PIC為指標對30對引物進行篩選，剔除分離率較低以及相似性過高的引物，得到可區(qū)分96份大豆的6對核心引物組合：Sat_258、Sat_351、Satt540、BE806308、Sat_164、Satt346。第三次全國農(nóng)作物種質(zhì)資源普查與收集過程中，我們已經(jīng)收集了大量的大豆地方品種，為避免后期重復(fù)收集，可將這些核心引物應(yīng)用于種質(zhì)資源的甄別工作，推進種質(zhì)資源的鑒評和利用。符小發(fā)等［20］通過對大豆品種的產(chǎn)量、成熟期、分枝等農(nóng)藝性狀進行鑒評，利用聚類分析得到了產(chǎn)量相關(guān)的主成分因子。孔凡江團隊利用基因組學(xué)與生物信息學(xué)，發(fā)掘了野生大豆開花馴化過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子Tof11和Tof12［21-22］。因此，可以對收集到的大豆資源開展SSR分子標記與農(nóng)藝性狀相關(guān)研究的同時，結(jié)合基因組學(xué)、生物信息學(xué)等方法，進一步挖掘大豆農(nóng)藝性狀的關(guān)鍵影響因子。同時核心引物也能對廣東省農(nóng)家種大豆進行快速的指紋圖譜構(gòu)建，對應(yīng)相關(guān)DNA分子身份證信息以及鑒評性狀，為廣東省農(nóng)家種大豆資源的保護提供有力支撐。本研究將DNA身份證導(dǎo)入條形碼生成器，錄入相關(guān)資源信息，成功構(gòu)建數(shù)字化的96份大豆資源DNA身份證。將所得到的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為可視化的信息進行普及，不僅豐富了種質(zhì)資源信息數(shù)據(jù)庫，也為種質(zhì)資源的保護和創(chuàng)新利用奠定了重要基礎(chǔ)。同時，大豆資源DNA分子身份證的構(gòu)建也有利于農(nóng)戶的大豆生產(chǎn)相關(guān)栽培知識的宣傳，對大豆資源的保護與規(guī)范化種植具有促進作用。

表4 有效SSR標記引物組合對大豆資源的區(qū)分Table 4 Identification of soybean resources by effective SSR marker primer combinations

表5 96份大豆資源的分子身份證編碼Table 5 Molecular ID of 96 soybean landraces

圖2 第43號大豆資源DNA身份證條形碼和二維碼身份證Fig. 2 DNA ID barcode and QR code ID of No. 43 soybean resources

4 結(jié)論

本研究收集了廣東省19個市37個縣市共96份農(nóng)家種大豆種質(zhì)資源，利用30對SSR引物進行檢測獲得相關(guān)多態(tài)性結(jié)果，通過聚類分析發(fā)現(xiàn)該96份大豆品種具有資源多樣性，并且可以分為3個類群。對30對SSR引物進行篩選后得到6對核心引物，基于該6對SSR引物的多態(tài)性結(jié)果構(gòu)建了供試大豆的DNA分子身份證，進一步記錄相關(guān)品種性狀并轉(zhuǎn)化為可視化信息，為廣東省大豆種質(zhì)資源的保護與鑒評積累了基礎(chǔ)，也為大豆品種的推廣與利用提供了重要依據(jù)。