張昆麗，李春玲

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，廣東 廣州 510640）

副豬嗜血桿菌病又稱格拉澤氏?。℅l?sser's disease），是由副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis, HPS）引起的豬全身性炎癥反應(yīng)，主要表現(xiàn)為急性滲出性纖維素炎、多發(fā)性纖維素性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等。Gl?sser于1910年首次發(fā)現(xiàn)豬漿液性纖維素性胸膜炎、心包炎和腦膜炎的病料中存在一種革蘭氏陰性菌，但由于該菌在外界死亡速度較快，對(duì)培養(yǎng)和保存條件要求苛刻，很大程度上阻礙了人們對(duì)該病的研究，直到1922年Schermer和Ehrlich首次從病料中分離到該菌。該菌由于生長(zhǎng)過程中需要V因子和X因子，1931年被命名為豬副流感（Haemophilus influenza suis），1943年Hj?rre和Wramby又將其命名為豬嗜血桿菌（Haemophilus suis），之后證明該菌生長(zhǎng)僅需V因子，最終更名為副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis）。2020年，經(jīng)過詳細(xì)的系統(tǒng)發(fā)育分析，副豬嗜血桿菌被重新命名為Glaesserella parasuis，但該命名尚未在國(guó)際上統(tǒng)一使用［1］。

副豬嗜血桿菌病在全球范圍內(nèi)廣泛流行，歐洲、大洋洲以及美國(guó)、加拿大、日本等國(guó)均有報(bào)道，在我國(guó)不同地區(qū)也普遍流行。2020年Ni等［2］綜合分析了PubMed、中國(guó)知網(wǎng)等5個(gè)國(guó)內(nèi)外數(shù)據(jù)庫(kù)中關(guān)于HPS血清流行病學(xué)及病原流行病學(xué)的數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，2005—2019年，HPS在我國(guó)豬群中的綜合平均陽(yáng)性率約27.8%，其中血清流行病學(xué)陽(yáng)性率為29.8%，病原流行病學(xué)陽(yáng)性率為12.5%；2011—2015年綜合平均陽(yáng)性率高達(dá)41.0%；該病全年發(fā)病，秋冬季節(jié)陽(yáng)性率為35.4%，春夏季節(jié)約21.8%，且全年齡段的豬均易感?？梢姡谖覈?guó)豬群中HPS感染較為常見。副豬嗜血桿菌病的發(fā)生通常與動(dòng)物應(yīng)激密切相關(guān)，多呈散發(fā)，隨著生產(chǎn)模式的轉(zhuǎn)變和免疫抑制病毒的出現(xiàn)，HPS常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環(huán)病毒、偽狂犬病毒、鏈球菌、大腸桿菌等混合感染，加上長(zhǎng)期濫用抗生素，使HPS的耐藥性嚴(yán)重，導(dǎo)致該病成為當(dāng)前生豬養(yǎng)殖過程中常見、多發(fā)且危害嚴(yán)重的豬呼吸系統(tǒng)重要傳染性疾病之一［3-4］?？股厥沁^去治療和預(yù)防HPS感染最常見的手段，但由于抗生素的耐藥性對(duì)公共衛(wèi)生安全具有重大的隱患，減少抗生素使用已成為全球共識(shí)。自2020年7月1日起，我國(guó)開始全面執(zhí)行在飼料中禁止添加抗生素、在養(yǎng)殖過程中減少抗生素使用的政策，替代抗生素的防控策略將成為副豬嗜血桿菌病防控的主要方案。本文總結(jié)了國(guó)內(nèi)外關(guān)于HPS的致病機(jī)制、診斷方法和疫苗的研究進(jìn)展，以期為副豬嗜血桿菌病的防控提供參考。

1 副豬嗜血桿菌的致病機(jī)理研究

1.1 血清型

HPS是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide, NAD）依賴的非運(yùn)動(dòng)、多形態(tài)、有莢膜的革蘭氏陰性小桿菌，為豬的上呼吸道常駐菌，一般在仔豬出生2 d后就能在鼻腔中檢測(cè)到。該菌血清型眾多，且各菌株間毒力差距較大，非毒力菌株是仔豬鼻腔中正常微生物菌群的一部分，毒力菌株則是引起副豬嗜血桿菌病的主要病原。HPS呈地方性流行，不同地區(qū)、國(guó)家的流行毒株不盡相同。研究發(fā)現(xiàn)，HPS至少有15個(gè)血清型，且部分分離株的血清型仍不確定，其中血清4型、5型是目前全球流行最廣泛的菌株。2007—2015年間，我國(guó)南方以4型（25.17%）、5型（23.15%）、12型（20.47%）和13型（6.04%）為主要流行血清型［5］；2014—2017年，5型（26.6%）、4型（22.4%）、7型（9.1%）、13型（6.3%）、12型（5.6%） 和不能分型的HPS菌株（8.4%）為我國(guó)的優(yōu)勢(shì)流行血清型［6］；廣東地區(qū)的HPS也以4型、5型和12型為主要流行血清型［7］。HPS菌株血清型還與毒力相關(guān)，其中血清1型、5型、10型、12型、13型、14型為強(qiáng)毒力菌株，血清2型、4型、8型、15型為中等毒力菌株，3型、6型、7型、9型和11型為無毒力型菌株［8］。

1.2 致病機(jī)制與毒力因子

細(xì)菌的致病機(jī)制主要包括病原菌對(duì)宿主粘附、入侵，逃避宿主的免疫防御體系，細(xì)菌在體內(nèi)繁殖和對(duì)組織損傷等多種方式。HPS通過附著在黏液層和下層上皮細(xì)胞而定植在粘膜上。毒力菌株和無毒力菌株均可在上呼吸道定植，一旦進(jìn)入氣管及下呼吸道，毒力菌株就表現(xiàn)出更高的定植能力。毒力菌株的成功定植與其逃避宿主免疫球蛋白IgA的殺傷作用相關(guān)。IgA是宿主粘膜防御功能中一道重要防線，通過結(jié)合病原菌，捕獲病原及其產(chǎn)物，阻斷粘附素和細(xì)胞受體的相互作用而抑制病原菌的定植。研究表明，一些HPS菌株可以切割豬源IgA，這些菌株可能通過IgA蛋白酶的作用克服宿主粘膜的防御機(jī)制，從而向各組織侵入，但目前尚未發(fā)現(xiàn)與HPS編碼IgA蛋白酶相關(guān)的基因［9］。此外，HPS在引起肺炎感染時(shí)，與生物被膜形成相關(guān)的基因siaB、htrA、fumC、gcpE和acrR表達(dá)上調(diào)［10］，表明HPS在粘膜表面的定植能力與體外生物被膜的形成相關(guān)。

肺部的天然免疫系統(tǒng)是控制呼吸道病原感染最重要的防線，逃避宿主肺組織的天然免疫反應(yīng)是HPS導(dǎo)致全身感染的另一關(guān)鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)，與非毒力菌株相比，在感染早期，毒力菌株能夠逃避肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬，其中HPS三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中的VtaA8、VtaA9及生物被膜形成在這過程中具有重要作用［11-12］。致病性HPS進(jìn)入血液能夠逃避抗體依賴補(bǔ)體介導(dǎo)的殺傷作用，在血液中存活且隨著血液流動(dòng)導(dǎo)致全身性感染。引起豬全身性感染的HPS分離株普遍具有血清抗性，而從健康豬鼻腔分離的菌株則對(duì)血清的殺菌效應(yīng)十分敏感，表明HPS菌株的血清抗性是其致病的重要特性之一。目前發(fā)現(xiàn)HPS外膜蛋白OmpP2、脂寡糖庚糖轉(zhuǎn)移酶（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）、調(diào)節(jié)LOS末端唾液酸化的α-2'3'唾液酸轉(zhuǎn)移酶（lsgB）、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（GalU）、UDP-葡萄糖-4表異構(gòu)酶（GalE）、多糖合成蛋白（CapD），以及細(xì)胞致死膨脹毒素（CDTs）等表面結(jié)構(gòu)與血清抗性相關(guān)［13-17］。

炎癥反應(yīng)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生是病原微生物感染后進(jìn)一步介導(dǎo)宿主損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。HPS感染誘導(dǎo)新生仔豬氣管細(xì)胞（NPTR）、豬腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（PBMEC）、PK-15細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IL-8等細(xì)胞因子，6-磷酸葡萄糖脫氫酶（6PGD）、脂寡糖（LOS）等毒力因子在此過程中發(fā)揮重要作用［18］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HPS通過MyD88依賴途徑和TRIF依賴途徑激活PK-15細(xì)胞的NF-κB、p38和JNK MAPK信號(hào)通路，誘導(dǎo)IL-8、CCL4及RANTES表達(dá)［19-21］。此外，HPS感染PK-15和NPTR細(xì)胞，激活與細(xì)胞膜移動(dòng)性和粘附性相關(guān)的Wnt/β-catenin信號(hào)通路，且HPS感染后導(dǎo)致細(xì)胞膜上E-cadherin表達(dá)下調(diào)，并使β-catenin和E-cadherin的相互作用減弱，破壞細(xì)胞的黏附連接［22］。此外，HPS感染氣管上皮細(xì)胞后，通過誘導(dǎo)Caspase3依賴的細(xì)胞調(diào)亡，促進(jìn)氣管粘膜的破壞。在病原微生物感染過程中，病原微生物與機(jī)體免疫反應(yīng)的相互博弈推動(dòng)疾病的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸。

綜上，HPS主要通過降解粘膜表面的IgA、抵抗巨噬細(xì)胞吞噬和血清中補(bǔ)體介導(dǎo)的殺菌作用來逃避天然免疫，在宿主中持續(xù)存在，進(jìn)而引發(fā)廣泛的炎癥反應(yīng)，這可能是導(dǎo)致副豬嗜血桿菌病的重要原因。但關(guān)于HPS如何突破血腦屏障導(dǎo)致腦膜炎，如何進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)形成菌血癥，以及HPS感染導(dǎo)致全身性漿膜炎、纖維素炎等的具體分子機(jī)制仍不清楚。

2 副豬嗜血桿菌的實(shí)驗(yàn)室診斷研究

對(duì)病原微生物準(zhǔn)確、高效地診斷是防控細(xì)菌性疫病的關(guān)鍵措施之一。病原診斷包括臨床診斷、病理剖檢和實(shí)驗(yàn)室診斷。HPS感染的臨床癥狀通常并非特異性的，如發(fā)熱、咳嗽、腹部呼吸、關(guān)節(jié)腫脹和跛行，以及側(cè)壓、蹬車和震顫等中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的癥狀。剖檢急性死亡的仔豬可見特有的纖維性多漿膜炎，偶爾還會(huì)出現(xiàn)膿性卡他性肺炎，慢性感染則表現(xiàn)出生長(zhǎng)減緩和纖維性多漿膜炎病變。但由于目前豬病混合感染嚴(yán)重，通過臨床癥狀和病理剖檢很難對(duì)疾病進(jìn)行診斷，而要弄清病原乃至病原的血清型必須依靠實(shí)驗(yàn)室診斷。常用實(shí)驗(yàn)診斷方法包括細(xì)菌分離鑒定、血清學(xué)診斷和分子生物學(xué)檢測(cè)等。

2.1 細(xì)菌分離鑒定

細(xì)菌分離鑒定是HPS診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。利用金色葡萄球菌給HPS生長(zhǎng)提供NAD的原理，用接種金色葡萄球菌的TSA/PPLO培養(yǎng)基進(jìn)行HPS分離培養(yǎng)，HPS在金色葡萄球菌周圍生長(zhǎng)呈“衛(wèi)星現(xiàn)象”；巧克力瓊脂平板、添加NAD的PPLO/TSA培養(yǎng)基也常用于HPS分離培養(yǎng)［23-24］。由于HPS是豬上呼吸道的常在菌，鼻咽試紙、扁桃體等分離到的HPS往往不能代表致病性HPS，因此對(duì)副豬嗜血桿菌病的診斷，通常選擇具有呼吸道癥狀豬的心、肝、脾、腎、腦等內(nèi)臟組織病料，且分菌病料必須保證無菌采樣、新鮮，離體時(shí)間過長(zhǎng)，長(zhǎng)期冷凍的病料往往很難分離到HPS。對(duì)分離到的疑似菌株還必須結(jié)合生化鑒定結(jié)果，與其他不溶血的NAD依賴菌（如吲哚放線桿菌、豬放線桿菌和小放線桿菌）相區(qū)別。

2.2 血清學(xué)診斷

臨床上應(yīng)采用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（Complement fixation test, CF）、平板凝集試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)（Indirect hemagglutination test, IHA）及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）檢測(cè)HPS的抗體水平。Nielsen等［8］早已證實(shí)，在補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)中各種血清型之間具有廣泛的交叉反應(yīng)性，無法區(qū)分待檢HPS血清型。平板凝集試驗(yàn)常用于評(píng)估HPS疫苗免疫的抗體水平，如魏子貢等［25］通過醛化鞣酸化的綿羊紅細(xì)胞凝集4型、5型抗原的間接血球凝集試驗(yàn)，得到免疫2周后的豬群抗體檢出率達(dá)89%，且特異性和重復(fù)性良好。ELISA具有簡(jiǎn)便、快捷、適用場(chǎng)景廣泛等優(yōu)點(diǎn)，是目前研發(fā)較多的HPS血清學(xué)檢測(cè)方法。以HPS的保護(hù)性抗原外膜蛋白P2（OPP2）和P5（OPP5）作為ELISA檢測(cè)抗原，已建立了多種不同的檢測(cè)方法［26-29］；馮小明等［30］以超聲波裂解的HPS作為抗原，建立了間接ELISA抗體檢測(cè)方法，與間接血凝方法比較，具有簡(jiǎn)單、快速、敏感等特點(diǎn)；宋帥等［31］以O(shè)PP5的特異性單克隆抗體作為捕獲抗體、HPS的兔多克隆抗體作為檢測(cè)抗體，建立了檢測(cè)靈敏度達(dá)1 ×106CFU/mL的雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法。與CF和IHA相比，ELISA檢測(cè)方法敏感性較高，穩(wěn)定性較好，易于自動(dòng)化操作，檢測(cè)效率較高，是一種良好的早期診斷方法。

2.3 分子生物學(xué)檢測(cè)

分子生物學(xué)診斷方法主要針對(duì)病原核酸，利用不同的檢測(cè)原理，準(zhǔn)確診斷樣品中是否含有病原的特異性基因序列，具有特異性好、靈敏度高、快速、簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。HPS的分子生物學(xué)診斷方法，主要有PCR法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）、交叉引物擴(kuò)增核酸試紙條法等。目前已經(jīng)建立的HPS分子生物學(xué)檢測(cè)方法主要針對(duì)16S rRNA、infB、OmpP2、PalA、wzs5基因，其中16S rRNA、infB是最常用的檢測(cè)靶標(biāo)基因。普通PCR檢測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，但檢測(cè)靈敏度不足。目前已建立的HPS普通PCR檢測(cè)方法特異性較好，對(duì)DNA的檢測(cè)下限為 10-5～10-6μg/mL［32］。靈敏度較高的SYBR Green或Taq Man探針的熒光定量PCR檢測(cè)方法的檢測(cè)下限為10～100 copies/μL，該類方法敏感性高、特異性好，且較為穩(wěn)定，是目前HPS實(shí)驗(yàn)室診斷和定量分析的常用方法［33-34］。由于PCR、熒光定量PCR檢測(cè)方法必須借助儀器才能對(duì)病原進(jìn)行診斷，而LAMP和交叉引物擴(kuò)增核酸試紙條法這類核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)則不需要特殊儀器，在恒溫條件下即可進(jìn)行快速反應(yīng)，并呈現(xiàn)可視化的反應(yīng)結(jié)果，比較適用于基層的臨床檢測(cè)和進(jìn)出口岸的通關(guān)檢測(cè)。HPS的LAMP法檢測(cè)下限為10-5～10-7μg/mL，其敏感度與普通PCR相近甚至高于普通PCR的100倍，結(jié)果的靈敏度往往與反應(yīng)體系、可視化判斷結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)［35］。由于LAMP的結(jié)果主要通過肉眼對(duì)液體的濁度和熒光亮度進(jìn)行判定，存在一定的主觀性，不利于可疑樣品的精確判斷。交叉引物擴(kuò)增核酸試紙條法是通過設(shè)計(jì)特異的交叉引物和探針，并進(jìn)行特殊的生物標(biāo)記后將等溫?cái)U(kuò)增和核酸試紙條技術(shù)相結(jié)合的一種簡(jiǎn)單快速的檢測(cè)方法。Gou等［36］針對(duì)HPS的wzs5基因建立的交叉引物擴(kuò)增核酸試紙條檢測(cè)方法，60℃恒溫反應(yīng)1 h，即可通過帶有垂直流可視化的反應(yīng)條帶，對(duì)14 CFU以上的HPS進(jìn)行檢測(cè)。此外，由于臨床上HPS常與豬鏈球菌、偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒等混合感染，多重PCR或多重?zé)晒舛縋CR等方法相繼建立，如賈愛卿等［37］根據(jù)HPS和豬鏈球菌的16S rRNA保守區(qū)建立了雙重鑒別診斷PCR檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)一次檢驗(yàn)即可高效快速地鑒定兩個(gè)病原。

分子血清分型是HPS分子生物學(xué)診斷一大研究熱點(diǎn)。根據(jù)腸桿菌基因間重復(fù)序列（ERIC）核心序列設(shè)計(jì)反向引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增出HPS基因組結(jié)構(gòu)特征條帶，對(duì)臨床菌株進(jìn)行血清型分型。HPS的ERIC-PCR基因分型可為地方性暴發(fā)的HPS遺傳背景及種源追溯提供重要的參考依據(jù)，比血清分型更適合流行病學(xué)分析［38］。從眾多HPS菌株中區(qū)分出毒力菌株，很有可能從根本上改變副豬嗜血桿菌病的診斷。根據(jù)VtaA基因與菌株毒力的相關(guān)性，Galofre-Mila等通過PCR擴(kuò)增VtaA基因的先導(dǎo)序列預(yù)測(cè)菌株的毒力［39-40］；Howell等［41］采用全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）對(duì)200個(gè)HPS分離菌株進(jìn)行分析，優(yōu)選出10個(gè)可能與HPS致病性相關(guān)的基因，并通過建立多重PCR篩選高致病性菌株。上述鑒定毒力菌株的PCR方法，通過呼吸道樣品就能夠?yàn)轲B(yǎng)豬場(chǎng)中副豬嗜血桿菌病的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供重要依據(jù)，但仍需要對(duì)更多臨床菌株作進(jìn)一步分析才能完全驗(yàn)證這些技術(shù)的準(zhǔn)確性。

3 副豬嗜血桿菌病疫苗的研究

控制副豬嗜血桿菌病3個(gè)關(guān)鍵要素分別是科學(xué)的種群管理、合理使用抗菌藥物和有效的免疫接種。母豬是HPS在豬群中傳播的源頭，因此母豬是該病的重要防控群體。隨著對(duì)濫用抗生素危害的認(rèn)識(shí)，我國(guó)和世界各國(guó)已相繼出臺(tái)相關(guān)減抗、禁抗政策法規(guī)，抗生素將逐步退出HPS的防控環(huán)節(jié)。因此疫苗接種將成為防控該病的最主要措施。

HPS是一種胞外病原體，體液免疫反應(yīng)產(chǎn)生的抗體在豬群感染發(fā)病中發(fā)揮重要作用［42］。仔豬在哺乳期間與母豬接觸后，獲得HPS定植，同時(shí)通過初乳獲得母源抗體，建立定植和免疫之間的平衡?？贵w能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬并殺死HPS，且抗體對(duì)補(bǔ)體的殺傷作用影響較小。但經(jīng)商品化ELISA試劑盒和PCR檢測(cè)抗體與抗原陰性的豬仍能抵抗高致病性菌株，表明機(jī)體可能還存在除抗體以外的其他免疫保護(hù)性機(jī)制。疫苗是目前已知的用于防控病原微生物最直接、經(jīng)濟(jì)、高效的方式，接種疫苗和免疫抗體通常被認(rèn)為是控制副豬嗜血桿菌病最有效的手段。目前研發(fā)的HPS疫苗主要包括滅活疫苗、亞單位疫苗和菌影疫苗。

3.1 滅活疫苗

滅活疫苗在全球副豬嗜血桿菌病的防控中發(fā)揮了重要作用。細(xì)菌滅活疫苗通常用37℃甲醛溶液處理48 h滅活，用高速離心將細(xì)菌培養(yǎng)物制粒后，再用無菌的磷酸鹽緩沖液重懸，然后用適當(dāng)?shù)淖魟┤绲V物油、氫氧化鋁或蜂膠配制。目前HPS的商品化疫苗均為滅活疫苗，相同血清型保護(hù)效果較好，但不同血清型間的交叉保護(hù)效果較差，甚至沒有保護(hù)力。因此，目前商品化的HPS疫苗以多價(jià)苗為主。疫苗菌株通常是從臨床感染的強(qiáng)毒株中篩選出來，主要以血清1型、4型、5型為主［43］。目前，市場(chǎng)上流通的HPS疫苗有7種，分別是西班牙海博萊生物大藥廠生產(chǎn)的預(yù)防血清1型和6型二價(jià)滅活苗、美國(guó)勃林格殷格翰公司生產(chǎn)的Z-1517株滅活苗、山東濱州沃華生物公司等生產(chǎn)的1型LC株+5型LZ株滅活苗、普萊柯生物公司生產(chǎn)的4型JS株+5型ZJ株滅活苗、武漢科前生物公司生產(chǎn)的二價(jià)滅活苗以及共同預(yù)防豬鏈球菌感染的二聯(lián)滅活苗，以及山東華宏生物公司生產(chǎn)的預(yù)防血清4型、5型、12型和13型的四價(jià)蜂膠滅活苗［44］。廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所針對(duì)廣東地區(qū)HPS的主要流行血清型，通過動(dòng)物模型篩選出臨床優(yōu)勢(shì)強(qiáng)毒株，成功研制出HPS的4型、5型和12型三價(jià)滅活疫苗［45-48］。該疫苗對(duì)HPS的同型菌株具有80%的免疫保護(hù)力，對(duì)其他血清型具有一定交叉免疫保護(hù)作用，目前已獲得三類新獸藥證書。

HPS滅活疫苗通常在母豬產(chǎn)前接種，誘導(dǎo)母體產(chǎn)生持續(xù)3周左右的高濃度抗體，仔豬斷奶前接種可持續(xù)保護(hù)豬群。雖然副嗜血桿菌的滅活疫苗有眾多優(yōu)勢(shì)，在市場(chǎng)上也具有較好的應(yīng)用前景，但存在一些局限性。首先，滅活疫苗不可能包含區(qū)域內(nèi)傳播的所有毒力血清型；其次，礦物油和氫氧化鋁等現(xiàn)有佐劑，在含有多種抗原的疫苗中很難保持相同的注射劑量和相同的保護(hù)水平，接種時(shí)缺乏其中一種抗原都很可能導(dǎo)致接種動(dòng)物免疫失敗，暴發(fā)副豬嗜血桿菌病，故開發(fā)更有效的佐劑可能是改進(jìn)HPS疫苗的新途徑；第三，免疫保護(hù)期短，需要多次免疫才能產(chǎn)生長(zhǎng)期的保護(hù)作用；第四，無法區(qū)分自然感染和疫苗接種的動(dòng)物。

3.2 亞單位疫苗

亞單位疫苗是含有特異HPS抗原分子，通過對(duì)致病性菌株中存在的共同表位進(jìn)行免疫反應(yīng)，達(dá)到免疫保護(hù)的效果。這類疫苗不含有病原微生物的核酸等遺傳物質(zhì)，對(duì)豬群無安全隱患。此外，該類疫苗穩(wěn)定性好、易儲(chǔ)存和運(yùn)輸，能區(qū)分自然感染與免疫接種的動(dòng)物，因此更適合作為一種新型疫苗的研究方向，并成為未來防治HPS感染的理想疫苗。

亞單位疫苗的設(shè)計(jì)通常根據(jù)免疫蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組序列聯(lián)合分析，選擇可能具有免疫原性的表面蛋白和分泌蛋白。成功表達(dá)重組蛋白、獲取高效的蛋白產(chǎn)量以及蛋白折疊充分是亞單位疫苗研發(fā)必須逐一突破的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。近期已鑒定到的具有高效免疫原性的重組蛋白有超氧化物歧化酶、Omp26、VacJ、HAPS 0742、HxuC、HxuB、TolC、LppC、HAPS_0926、Omp16、HbpA、OppA、HPS-04307、AfuA 和 HktE［49-52］。其中用 TolC、LppC、HAPS_0926的重組蛋白免疫后，小鼠抗原特異性IgG滴度和淋巴增殖反應(yīng)顯著升高，外周血中CD4+、CD8+T細(xì)胞上升，IL-2、IL-4和IFN-γ分泌水平顯著增加；在HPS全血?dú)⒕囼?yàn)中，這3個(gè)抗原的抗血清能有效抑制細(xì)菌存活，且多蛋白聯(lián)合免疫能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更明顯的免疫反應(yīng)，免疫保護(hù)效果與單一蛋白免疫效果相比顯著上升［50］；在豚鼠模型中，Omp26、VacJ和HAPS 0742重組蛋白分別免疫后，用致死劑量的HPS感染豚鼠，具有顯著的保護(hù)作用［53］；Li等［53-54］研究發(fā)現(xiàn)，重組表達(dá)HbpA、OppA、HPS-04307、AfuA、OmpP2蛋白免疫小鼠后，能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，有效抑制了HPS在小鼠體內(nèi)的增殖并給予小鼠40%～80%的保護(hù)。但上述新發(fā)現(xiàn)的蛋白是否能有效地保護(hù)豬還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。與毒力菌株高效反應(yīng)的特異性抗原表位決定了亞單位疫苗免疫保護(hù)的效率。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)氨酸酶、VtaA和TbpAB蛋白的特異性抗原表位在抗HPS特定血清型感染中發(fā)揮了重要作用，但這些抗原表位對(duì)HPS其他血清型的交叉保護(hù)作用仍不理想，通用抗原表位的發(fā)現(xiàn)很可能是解決HPS亞單位疫苗交叉保護(hù)力差的一種途徑［55-57］。

外膜囊泡（Outer membrane vesicles，OMVs）是革蘭氏陰性菌在自然環(huán)境下分泌的一種雙層膜泡狀囊泡，由脂多糖、磷脂、肽聚糖、外膜蛋白、細(xì)胞壁成分、核酸（DNA、RNA）和離子代謝物等多種生物活性物質(zhì)組成，直徑在20～250 nm之間［58］。OMVs不僅具有較好的免疫原性，能有效激活機(jī)體的免疫反應(yīng)，還能作為免疫佐劑使用。隨著腦膜炎奈瑟菌B群OMVs疫苗的上市，OMVs被認(rèn)為是極具潛力的候選亞單位疫苗或者疫苗載體。McCaig等［59］研究發(fā)現(xiàn)，HPS（Nagasaki株）的OMVs免疫無母源抗體的仔豬后，用致死劑量的同菌株經(jīng)滴鼻感染仔豬，免疫組14 d內(nèi)的保護(hù)率達(dá)100%。豚鼠模型試驗(yàn)表明，經(jīng)滴鼻免疫OMVs的后，豚鼠粘膜免疫水平顯著上升［60］。但HPS自然分泌的OMVs產(chǎn)量較少，純化過程復(fù)雜，且缺乏精確定性標(biāo)準(zhǔn)，如何高效提升OMVs的產(chǎn)量和控制OMVs的質(zhì)量，是OMVs亞單位疫苗能否成為商品化疫苗的關(guān)鍵技術(shù)瓶頸。

雖然上述多種實(shí)驗(yàn)性亞單位疫苗已在豬模型中顯示出保護(hù)作用，但仍未能解決血清型間交叉保護(hù)的問題。高效交叉保護(hù)性疫苗是今后HPS亞單位疫苗研制的方向，該類疫苗的研發(fā)有賴于更加詳細(xì)的HPS致病機(jī)制的闡明，以及更多毒力因子和交叉保護(hù)性抗原的揭示。

3.3 菌影疫苗

“細(xì)菌幽靈”是革蘭氏陰性菌在噬菌體PhiX174的裂解基因E作用下，在細(xì)菌膜上形成一個(gè)直徑為40～200 nm的特異性跨膜孔道，由于滲透壓的差異，胞質(zhì)內(nèi)容物經(jīng)孔道排出，形成無細(xì)胞漿和核酸的細(xì)菌空殼［61］。菌影疫苗正是以這種細(xì)菌空殼作為抗原免疫動(dòng)物，以獲得對(duì)該菌的免疫保護(hù)力。與其他類型的疫苗相比，菌影疫苗具有完整的細(xì)菌膜和相關(guān)免疫原性蛋白，可有效遞送抗原和誘導(dǎo)較強(qiáng)免疫應(yīng)答；而且“細(xì)菌幽靈”中含有的脂多糖和肽聚糖等成分均可作為天然佐劑；“細(xì)菌幽靈”還可以作為載體，表達(dá)其他細(xì)菌或病毒抗原，制備多聯(lián)多價(jià)疫苗。此外，由于“細(xì)菌幽靈”特殊的遺傳滅活方式，疫苗中不含核酸等遺傳物質(zhì)，具有良好的生物安全性，且可常溫儲(chǔ)藏與運(yùn)輸，因此可降低生產(chǎn)成本。目前研究表明，大腸桿菌、幽門螺旋桿菌、胸膜肺炎防線桿菌、多殺性巴氏桿菌、嗜血桿菌等在裂解基因E的作用下均能產(chǎn)生“細(xì)菌幽靈”。胡明明［62］以血清5型HPS為載體，成功制備了HPS菌影，發(fā)現(xiàn)該菌影疫苗對(duì)仔豬具有較好的免疫保護(hù)力，為HPS新型高效菌影疫苗的研制開發(fā)與應(yīng)用提供了支持。胡本鋼［63］利用抗菌肽聯(lián)合超高壓方法成功制備的HPS菌影，對(duì)小鼠具有100%免疫保護(hù)力，為HPS菌影疫苗的大規(guī)模制備和工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

4 展望

副豬嗜血桿菌可感染斷奶到屠宰任何階段的豬群，且廣泛地與多種病毒、細(xì)菌、支原體混合感染，是導(dǎo)致豬呼吸系統(tǒng)疾病的重要病原。在全球限制抗生素使用和我國(guó)減抗、禁抗政策實(shí)行的背景下，副豬嗜血桿菌病的流行很可能更加普遍，多血清型、多病原的混合感染將更加嚴(yán)重，發(fā)病特征也將更加模糊，給疾病的診斷與治療造成更大困難。因此，如何高效防控HPS感染將成為現(xiàn)代化、集約化養(yǎng)殖需要解決的關(guān)鍵問題。精準(zhǔn)的病原監(jiān)控與診斷、良好的生物安全措施和合理的疫苗接種計(jì)劃是控制副豬嗜血桿菌病的關(guān)鍵。深入開展HPS的致病機(jī)制研究，闡明不同分子在HPS感染中的作用，揭示HPS的毒力因子，準(zhǔn)確鑒別毒力菌株與非毒力菌株，推動(dòng)HPS診斷方法的發(fā)展和疫苗設(shè)計(jì)至關(guān)重要。隨著各種檢測(cè)方法不斷改進(jìn)，對(duì)于HPS的診斷已更加靈敏、準(zhǔn)確、客觀和迅速，但目前HPS的確診主要依賴實(shí)驗(yàn)室診斷，且目前用于血清分型的檢測(cè)方法操作、分析繁瑣，仍需開發(fā)更多適用于不同場(chǎng)景的簡(jiǎn)便、快速、特異性強(qiáng)的檢測(cè)方法，這對(duì)HPS早期感染的及時(shí)診斷、新菌株的發(fā)現(xiàn)和流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義。

疫苗免疫是今后細(xì)菌性疾病防控的主要手段，但目前HPS商品化疫苗僅滅活疫苗一類，且血清型間交叉保護(hù)效率差，現(xiàn)有的滅活疫苗技術(shù)又無法包含所有血清型，這很可能成為HPS防控的漏洞。多種亞單位疫苗、菌影疫苗等研究雖已取得較好試驗(yàn)結(jié)果，但仍未解決疫苗交叉保護(hù)力差這一難題。由于流行疫病較多，仔豬在較短的免疫期內(nèi)往往需要進(jìn)行多次不同病原的疫苗接種，導(dǎo)致多次應(yīng)激、免疫力下降、疾病暴發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)增加，且疫苗間可能存在相互影響而降低免疫效果，直接增加了生產(chǎn)成本。因此，研究新的安全高效佐劑、不同疫苗接種途經(jīng)和具有高效交叉保護(hù)作用的疫苗，以及推動(dòng)單針疫苗的研制是今后HPS疫苗研發(fā)的重點(diǎn)。