齊云云，溫鵬，于詩(shī)怡，李全凱，李曉娟，陳文，韓博

(石河子大學(xué)藥學(xué)院/新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832000)

世界上約有五分之一的人受到口腔潰瘍的困擾，潰瘍反復(fù)發(fā)作其病引起疼痛與不適，影響進(jìn)食[1]。其病因復(fù)雜，認(rèn)為與局部創(chuàng)傷、細(xì)菌感染、免疫紊亂等因素有關(guān)[2-3]。局部使用氯己定、類固醇類藥物帶來(lái)的牙齒著色、味覺障礙和藥物依賴性等副作用使其在臨床應(yīng)用中受到限制[4-5]。2019版《國(guó)家基本藥品目錄》中收錄的治療口腔潰瘍的中成藥有冰硼散、口腔潰瘍散和西帕依固齦液等。其中長(zhǎng)期使用冰硼散會(huì)導(dǎo)致汞在人體內(nèi)蓄積，不宜久服[6]，且其有效成分—冰片會(huì)對(duì)感覺神經(jīng)產(chǎn)生刺激，患者滿意度較低；口腔潰瘍散具有消潰止痛的功效，但其藥性較弱，作用時(shí)間較短。在現(xiàn)有藥物治療效果不理想的情況下是否可以從植物藥中尋找治療口腔潰瘍的藥物？五倍子為五倍子蚜寄生在鹽膚木等漆樹科鹽膚木屬植物的葉上形成的蟲癭，主要成分為多酚類化合物(60%～80%)。

五倍子藥用歷史悠久，始載于距今1200余年的《本草拾遺》。研究表明，五倍子具有鎮(zhèn)痛抗炎[7]、收斂止瀉[8]及抗氧化[9]等藥理活性，對(duì)多種動(dòng)物模型均具有抗炎和鎮(zhèn)痛作用，可作為治療炎癥和疼痛相關(guān)疾病的候選藥物[7]。此外，五倍子對(duì)口腔致病菌具有一定抑制活性，能減少細(xì)菌粘附、清除口腔細(xì)菌生物膜[10]。目前對(duì)于五倍子在口腔潰瘍治療中發(fā)揮主要活性的化合物及其作用機(jī)制的系統(tǒng)性研究卻鮮有報(bào)道，因此基于系統(tǒng)藥理學(xué)從抗菌和抗炎兩方面觀察五倍子中活性化合物對(duì)口腔疾病的干預(yù)和影響。

本工作結(jié)合系統(tǒng)藥理學(xué)結(jié)果與前期工作基礎(chǔ)[11]，采用C18柱層析分離五倍子中化學(xué)成分并采用LC-MS技術(shù)進(jìn)行分析鑒定。通過(guò)系統(tǒng)藥理學(xué)預(yù)測(cè)五倍子中化合物潛在靶點(diǎn)并研究其作用機(jī)制。通過(guò)體外抗菌實(shí)驗(yàn)檢測(cè)五倍子中多酚成分段對(duì)口腔致病菌的抑制作用，以冰醋酸誘導(dǎo)的口腔潰瘍大鼠為模型進(jìn)行研究，篩選出五倍子中具有抗口腔潰瘍活性的成分段，對(duì)系統(tǒng)藥理學(xué)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證(圖1)。

圖1 工作思路圖

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

1.1.1 試劑與材料

TNF-α ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)SU-B20852)；IL-1β 試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，SU-B20174)；IL-6 ELISA 試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，SU-B20652)；甲酸(天津光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)20170806)；微晶纖維素微孔濾膜(0.22 μm，上海興亞凈化材料廠)；無(wú)水乙醇(天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，批號(hào)20170525)；乙腈(色譜級(jí)，美國(guó)Thermo Fisher公司，批號(hào)20170726)；TSB培養(yǎng)基(南通凱恒生物科技發(fā)展有限公司，批號(hào)20180127)；瓊脂(南通凱恒生物科技發(fā)展有限公司，批號(hào)20180220)；桂林西瓜霜(桂林三金藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)171246)；多聚甲醛(索萊寶科技有限公司，批號(hào)20171016)。

五倍子購(gòu)于陜西秦嶺藥材批發(fā)市場(chǎng)，經(jīng)石河子大學(xué)藥學(xué)院韓博教授鑒定為五倍子RhuschinensisMill.，存放于新疆特種植物藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室藥劑學(xué)研究室(批號(hào)：20180715)。

1.1.2 動(dòng)物

健康SD大鼠60只，雌雄各30只，質(zhì)量約(180±30)g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(新)2016—0003，合格證號(hào)：2016—0002。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于溫度20～22 ℃，濕度45%～55%的環(huán)境中，食用標(biāo)準(zhǔn)顆粒狀飼料，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作均符合醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理實(shí)施細(xì)則相關(guān)政策，并經(jīng)石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)菌株

牙齦卟啉單胞菌(P.gingivalis, ATCC 33277)和粘性放線菌(A.viscosus,ATCC 27044)購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏中心。

1.1.4 儀器

液相色譜-質(zhì)譜分析儀(HPLC-MS，美國(guó)Waters公司)，自動(dòng)純化系統(tǒng)包括恒流泵(Waters 2545)，補(bǔ)償泵(waters 515)，紫外可見光譜檢測(cè)器(Waters 2489)，QDa質(zhì)譜檢測(cè)器(Waters，美國(guó))，樣品管理器(Waters 2767)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-2000，上海亞龍生化儀器廠)；電熱恒溫水浴鍋(DZKW-S-6)；Milli-Q Integral水系統(tǒng)(Millipore,Bedford,USA)；分析天平(FA2014B，上海精密科學(xué)儀器有限公司)；BBS-SDC型超凈工作臺(tái)(BIOBASE，濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司)；高壓滅菌鍋(HVE-50，日本Hirayama平山制作所株式會(huì)社)；厭氧培養(yǎng)箱(Whitley DG250，英國(guó)Don Whitley Scientific)；恒溫培養(yǎng)搖床(QYC-200，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；紫外分光光度計(jì)(UV-2600，日本島津集團(tuán)有限公司)；低溫超速離心機(jī)(HIMA，日本立川TACHI公司)；電熱恒溫水浴鍋(DZKW-S-6)；Milli-Q Integral水系統(tǒng)(Millipore,Bedford,USA)；分析天平(AR1140，奧豪斯儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 提取與分離

五倍子除去蟲癭后粉碎過(guò)80目篩，精密稱定60.0 g，加180 mL蒸餾水煎煮3次，每次2 h，合并濾液，減壓濃縮至50 mL。采用C18柱(30 cm×10 cm,i.d.)對(duì)五倍子濃縮液進(jìn)行分離，分別用3倍柱體積的0%，30%，70%的乙醇-水溶液梯度洗脫，洗脫流速為4 mL/min，收集洗脫液，濃縮、凍干，得五倍子中三段組分，分別命名為GCE-1、GCE-2、GCE-3。取適量各組分稀釋至2 mg·mL-1，過(guò)0.22 μm微晶纖維素微孔濾膜后濾液進(jìn)LC-MS進(jìn)行分析。

1.2.2 LC-MS分析

分析條件如下：色譜柱：C18柱(SunFire,5 μm,Ф 4.8×250 mm,Waters)；流動(dòng)相：A-0.2%甲酸水溶液，B-乙腈；梯度洗脫：0～4 min：93%～93% A；4～35 min：93%～80% A；35～50 min：80%～70% A；50～60 min：70%～0% A。流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL；樣品濃度：1 mg·mL-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm和269 nm；電噴霧負(fù)離子模式；掃描范圍：m/z 100～1250；源溫度：120 ℃；去溶劑化溫度：250 ℃；毛細(xì)管電壓2.8 kV；錐電壓50 V。

1.2.3 五倍子化合物建立、靶點(diǎn)預(yù)測(cè)與相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通常系統(tǒng)藥理學(xué)研究中會(huì)通過(guò)化合物的吸收、分布、代謝和排泄(ADME)性質(zhì)進(jìn)行活性篩選，但在本研究中口服生物利用度對(duì)口腔黏膜局部給藥影響較小，因此未通過(guò)ADME性質(zhì)五倍子化合物進(jìn)行篩選。采用LC-MS技術(shù)對(duì)五倍子中的成分進(jìn)行分析，并結(jié)合文獻(xiàn)挖掘與TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)檢索構(gòu)建五倍子成分庫(kù)，以類藥性(Drug likeness,DL)≥ 0.18為條件對(duì)五倍子中化合物進(jìn)行初步篩選。DL是指影響藥物分子藥代動(dòng)力學(xué)和藥物性質(zhì)的分子參數(shù)，用來(lái)評(píng)估化合物與藥物相似程度[12]?；陔S機(jī)森林(Random Forest,RF)和支持向量機(jī)(Support Vector Machine,SVM)兩種算法，整合化學(xué)、基因組學(xué)和藥理學(xué)信息對(duì)藥物候選活性化合物進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測(cè)，并將RF≥0.7或SVM≥0.8的化合物和靶點(diǎn)相互作用視為有效。運(yùn)用Cytoscape3.2.1軟件繪制五倍子中化合物-靶點(diǎn)-疾病(C-T-D)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。

1.2.4 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

將牙齦卟啉單胞菌及粘性放線菌于溫度為37 ℃、濕度為75%的厭氧培養(yǎng)箱(CO2:N2:H2=8∶1:1)中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并稀釋成濃度為108CFU/mL的菌液，采用二倍稀釋法[13]測(cè)定五倍子中各組分對(duì)牙齦卟啉單胞菌及粘性放線菌的最小抑菌濃度。觀察結(jié)果：若孔中培養(yǎng)基渾濁視為有細(xì)菌生長(zhǎng)，孔中完全澄清視為無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。為驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性，將各孔中的培養(yǎng)液接種于TSB瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，若仍無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，則該濃度為對(duì)應(yīng)藥液的MIC，每組實(shí)驗(yàn)平行3次。

1.2.5 抑菌圈實(shí)驗(yàn)

將牙齦卟啉單胞菌及粘性放線菌分別制備成濃度為108CFU/mL的菌液，采用牛津杯法測(cè)定1.2.5中篩選出的抑菌活性組分在不同濃度對(duì)牙齦卟啉單胞菌或粘性放線菌的抑菌圈大小[14]，甲硝唑(5 mg·mL-1)作為陽(yáng)性對(duì)照，每組設(shè)3個(gè)平行組。具體方法如下：于培養(yǎng)皿中加入15 mL TSB瓊脂培養(yǎng)基和0.15 mL菌液，迅速混勻。待培養(yǎng)基凝固后，將牛津杯均勻放置于培養(yǎng)皿中，每孔加入各待測(cè)液100 μL。將培養(yǎng)皿置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑。抑菌效果判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑r>20 mm以上為極度敏感，15 mm

1.2.6 動(dòng)物分組及給藥

采用化學(xué)灼燒建立大鼠口腔潰瘍模型[15]。大鼠腹腔注射水合氯醛(10%，3 mL·kg-1)麻醉，將直徑為3 mm×3 mm濾紙片浸潤(rùn)50%冰醋酸后貼于下切牙唇側(cè)黏膜30 s，對(duì)照組采用生理鹽水浸潤(rùn)的濾紙同法處理，24 h后觀察大鼠黏膜形成潰瘍即為造模成功。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為GCE-1組(110 mg·mL-1)、GCE-2組(110 mg·mL-1)、GCE-3組(110 mg·mL-1)、模型組(生理鹽水)、陽(yáng)性藥組(桂林西瓜霜，200 mg·mL-1)，每組10只。造模24 h后開始進(jìn)行藥物干預(yù)，將0.15 mL各組藥液噴于大鼠黏膜破損處，每天給藥2次，連續(xù)7 d，給藥后30 min內(nèi)禁食禁水。治療期間使用游標(biāo)卡尺測(cè)量各組大鼠給藥前及給藥后第3天、第5天、第7天口腔潰瘍的直徑，觀察大鼠潰瘍面形態(tài)、愈合情況并拍照記錄。

1.2.7 黏膜組織(HE)染色

治療結(jié)束后處死大鼠，剪取口腔潰瘍處黏膜組織。取部分潰瘍組織于4%多聚甲醛溶液中固定、石蠟包埋、切片，HE染色并通過(guò)圖像采集分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集，觀察各組潰瘍組織病理學(xué)變化。

1.2.8 炎癥因子的表達(dá)

精密稱定剩余組織，加入9倍量的生理鹽水進(jìn)行勻漿處理，勻漿液于4 ℃、5 000×g離心10 min，取上清液按照ELISA試劑盒說(shuō)明書分別檢測(cè)TNF-α，IL-1β和IL-6含量。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 LC-MS分析結(jié)果

本課題組前期采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù) (UPLC-MS/MS) 對(duì)五倍子中的化合物快速分析鑒定[12]，以多酚類化合物為主，且各化合物結(jié)構(gòu)相似度高。為尋找五倍子中發(fā)揮藥理作用的活性組分，通過(guò)各化合物的保留時(shí)間與柱層析分離結(jié)果，將五倍子中化合物分為GCE-1、GCE-2、GCE-3三段，并利用LC-MS技術(shù)對(duì)五倍子各組分進(jìn)行分析、鑒定出7種多酚化合物，分別為沒食子酸(m/z169.07)、雙沒食子酸(m/z321.09)、一-O-沒食子酰基葡萄糖(m/z331.20)、二-O-沒食子酰基葡萄糖(m/z483.27)、三-O-沒食子酰基葡萄糖(m/z 635.35)、四-O-沒食子?；咸烟?m/z787.25)和五-O-沒食子酰基葡萄糖(m/z939.27)，GCE-1、GCE-2、GCE-3總離子流圖如圖2所示，GCE-1組包括沒食子酸與一-O-沒食子?；咸烟?，GCE-2組主要為雙沒食子酸、二-O-沒食子?；咸烟呛腿?O-沒食子?；咸烟牵珿CE-3組包括四-O-沒食子?；咸烟?、五-O-沒食子酰基葡萄糖。圖2中部分化合物未完全分離，以圖2a中化合物3為例，在保留時(shí)間為2～7 min內(nèi)分布有6個(gè)峰，其分子量均為331，鑒定為一-O-沒食子?；咸烟堑亩鄠€(gè)同分異構(gòu)體，其結(jié)構(gòu)和極性相似，不易通過(guò)C18柱分離。各組分化合物詳細(xì)信息如表1所示。

a、b、c為GCE-1、GCE-2、GCE-3的總離子流圖。

表1 LC-MS對(duì)五倍子中各組分化合物鑒別分析

2.2 網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建與分析

五倍子化合物與其潛在靶點(diǎn)和疾病之間的相互作用關(guān)系如圖3所示，包括52個(gè)節(jié)點(diǎn)和62條邊，圖中節(jié)點(diǎn)分別代表9個(gè)化合物成分(通過(guò)文獻(xiàn)挖掘得到五倍子中化合物沒食子酸甲酯和沒食子酸乙酯，分別作為化合物M8、M9)、35個(gè)靶點(diǎn)和8類口腔潰瘍相關(guān)疾病，化合物信息見表1，節(jié)點(diǎn)大小與此節(jié)點(diǎn)的degree值呈正相關(guān)。其中預(yù)測(cè)得到的核心靶點(diǎn)前列腺素G/H合酶2(PTGS2)、前列腺素G/H合酶1(PTGS1)、絲裂原激活蛋白激酶14(MAPK14)、二肽基肽酶4(DPP4)和ampC與口腔潰瘍相關(guān)。PTGS2和PTGS1是炎性疾病的重要靶點(diǎn)，當(dāng)機(jī)體受脂多糖、真菌病原體和TNF-α、IL-1β等促炎癥因子刺激后，PTGS2和PTGS1的表達(dá)迅速增加，引起炎性反應(yīng)，導(dǎo)致組織損傷[16-17]。MAPK14參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)與炎癥反應(yīng)，可以調(diào)控TNF-α、IL-1、IL-6等細(xì)胞因子的基因表達(dá)[18]。

其中黃色圓形節(jié)點(diǎn)表示化合物，藍(lán)色三角形節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)，綠色三角形節(jié)點(diǎn)表示核心靶點(diǎn)，橙色六邊形節(jié)點(diǎn)口腔潰瘍相關(guān)疾病，邊表示相互作用關(guān)系。

通過(guò)PTGS2、PTGS1和MAPK14對(duì)巨噬細(xì)胞的凋亡、局灶性黏附和炎癥的調(diào)節(jié)可能是五倍子中活性成分發(fā)揮抗炎活性的作用機(jī)制。DPP4是一種細(xì)胞表面糖蛋白，通過(guò)調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化、細(xì)胞因子的水平、T細(xì)胞依賴性抗體的生成和B細(xì)胞免疫球蛋白參與介導(dǎo)機(jī)體免疫功能和疾病的發(fā)病機(jī)制，在巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥、組織重塑[19]和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[20]，但其在口腔病理環(huán)境中的作用未見報(bào)道。ampC誘導(dǎo)了頭孢菌素耐藥性菌株的生長(zhǎng)，其往往與腸菌群固有耐藥性密切相關(guān)，但在口腔菌群中的作用未見文獻(xiàn)報(bào)道。而有研究表明，在LPS誘導(dǎo)的牙齦成纖維細(xì)胞模型中Toll-like receptors 4(TLR4)表達(dá)水平與IL-1、IL-6的水平呈正相關(guān)，而antiTLR4單克隆抗體可抑制LPS誘導(dǎo)的人牙周膜細(xì)胞中TNF-α，IL-1β和IL-6的表達(dá)[21]。接下來(lái)本工作從抗菌和抗炎兩個(gè)角度對(duì)五倍子中活性化合物及其作用機(jī)制進(jìn)行初步分析。

2.3 五倍子中各組分MIC測(cè)定結(jié)果

采用二倍稀釋法測(cè)定沒食子各組分對(duì)牙齦卟啉單胞菌和粘性放線菌的MIC，結(jié)果如表2、表3所示。經(jīng)驗(yàn)證，GCE-1、GCE-2和GCE-3對(duì)牙齦卟啉單胞菌的MIC分別為10、5、5 mg·mL-1，GCE-1、GCE-2和GCE-3對(duì)粘性放線菌的MIC分別為5、5、10 mg·mL-1。結(jié)果提示，GCE-2對(duì)兩種口腔致病菌均具有強(qiáng)抗菌活性，GCE-1和GCE-3抗菌活性稍弱于GCE-2。

表2 五倍子各組分對(duì)牙齦卟啉單胞菌的MIC

表3 五倍子各組分對(duì)粘性放線菌的MIC

2.4 抑菌圈直徑及藥物敏感性測(cè)定結(jié)果

進(jìn)一步采用牛津杯法測(cè)定5 mg·mL-1甲硝唑、10 mg·mL-1GCE-2(H- GCE-2)和5 mg·mL-1GCE-2(L- GCE- 2)對(duì)牙齦卟啉單胞菌和粘性放線菌的抑菌圈直徑，結(jié)果圖4所示?？咕钚裕杭紫踹?H-GCE-2 >L-GCE-2，牙齦卟啉單胞菌和粘性放線菌對(duì)GCE-2敏感程度呈濃度依賴性。結(jié)果提示，GCE-2具有一定抗菌能力，五倍子參與口腔潰瘍的治療機(jī)制可能與抗菌有關(guān)。

圖4 GCE-2對(duì)牙齦卟啉單胞菌和粘性放線菌抑菌圈

2.5 一般情況觀察

實(shí)驗(yàn)周期安排如圖5A所示，給藥期間各組大鼠體重變化無(wú)明顯差異，活動(dòng)量正常，進(jìn)食飲水、排便情況無(wú)明顯差異。觀察各組大鼠口腔潰瘍面形態(tài)如圖5B-D所示。冰醋酸刺激后可出現(xiàn)明顯的口腔潰瘍，表面覆有灰白色假膜，周圍黏膜充血、紅腫。在持續(xù)給藥第3、5、7天分別記錄各組大鼠黏膜表觀，如圖5D所示。

圖5 實(shí)驗(yàn)周期圖及治療期間各組大鼠潰瘍表觀

模型大鼠口腔潰瘍隨著時(shí)間呈現(xiàn)出一定自愈性，潰瘍面積略有減小。治療后期經(jīng)陽(yáng)性藥、GCE-1、GCE-2治療的大鼠潰瘍面有新生組織覆蓋，周圍黏膜充血紅腫程度減輕，其中GCE-2效果僅次于陽(yáng)性對(duì)照組，經(jīng)GCE-3治療的大鼠黏膜組織出現(xiàn)潰爛，顏色發(fā)黑。

2.6 實(shí)驗(yàn)期間大鼠潰瘍直徑記錄

治療期間大鼠口腔潰瘍直徑如圖6所示。

與模型組相比*P<0.05,**P<0.01 and ***P<0.001。

各組大鼠建模24 h后大鼠潰瘍面積大小無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。治療后期，模型大鼠口腔潰瘍面積逐漸減小，表現(xiàn)出一定自愈性。與模型組比較，陽(yáng)性藥組、GCE-1和GCE-2治療組潰瘍直徑顯著減小(P<0.01)，其中陽(yáng)性藥組與GCE-2治療組分別有4只和3只大鼠潰瘍完全愈合。而GCE-3成分組治療期間潰瘍面積與模型對(duì)照組無(wú)明顯差異(P>0.05)。該結(jié)果與抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，提示GCE-2組分對(duì)冰醋酸誘導(dǎo)的口腔潰瘍具有治療作用。

2.7 口腔黏膜組織病理切片分析

大鼠口腔潰瘍黏膜組織病理變化如圖7所示。

A—對(duì)照組；b—模型組；c—陽(yáng)性藥組；d—GCE-1組；e—GCE-2組；f—GCE-3組

對(duì)照組口腔黏膜組織上皮完整，細(xì)胞排列有序，黏膜下層的結(jié)締組織疏松，未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

模型組口腔黏膜組織破損，上皮層破潰脫落，結(jié)締組織細(xì)胞排列不完整，黏膜下層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。

與模型組比較，陽(yáng)性藥組、GCE-1治療組和GCE-2治療的大鼠黏膜組織上皮層趨于完整，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。結(jié)果表明，GCE-2可促進(jìn)冰醋酸誘導(dǎo)的黏膜組織病理結(jié)構(gòu)的修復(fù)，原因可能為GCE-2中的多酚類化合物與潰瘍表面蛋白質(zhì)結(jié)合，形成保護(hù)膜，隔絕口腔中細(xì)菌與毒素的侵蝕，防止?jié)兠胬^發(fā)感染，加速創(chuàng)面愈合。

2.8 口腔潰瘍大鼠TNF-α，IL-1β，IL-6表達(dá)變化

實(shí)驗(yàn)性大鼠潰瘍組織中IL-1β、IL-6、TNF-α含量變化如圖8所示。與對(duì)照組相比，模型組大鼠潰瘍組織中IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，GCE-1治療組、GCE-2治療組和陽(yáng)性藥組大鼠的潰瘍組織中IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著降低，其中陽(yáng)性藥組最顯著(P<0.001)，GCE-2治療組次之(P<0.01)，GCE-1治療組較弱(P<0.05)，GCE-3成分組IL-1β、IL-6水平無(wú)顯著性差異(P>0.05)，TNF-α水平顯著降低(P<0.05)。結(jié)果提示，GCE-2可以降低潰瘍組織中IL-1β、IL-6和TNF-α水平，其治療醋酸誘導(dǎo)的口腔潰瘍機(jī)制可能與炎癥相關(guān)。

與模型組相比*P<0.05,**P<0.01 and ***P<0.001；n=6。

3 討論

口腔潰瘍的治療以減輕患者疼痛，促進(jìn)潰瘍愈合，減少發(fā)作持續(xù)時(shí)間和復(fù)發(fā)率為主[22]。臨床治療口腔潰瘍的中成藥很多，如：西瓜霜、三七粉、青黛散等，但這些藥物對(duì)改善患者疼痛及促進(jìn)口腔潰瘍的愈合無(wú)明顯療效[23]。五倍子多酚對(duì)口腔潰瘍的療效已有報(bào)道[24]。五倍子多酚類化合物與潰瘍表面滲出物結(jié)合，收斂潰瘍面；神經(jīng)末梢蛋白質(zhì)被沉淀，具有微弱的局麻作用，可緩解潰瘍引起的疼痛；體外實(shí)驗(yàn)顯示五倍子對(duì)口腔致病菌具有明顯的抑制作用，可用于治療繼發(fā)性感染引起的口腔潰瘍，不需要與其他抗菌藥物聯(lián)合使用。針對(duì)五倍子中活性化合物物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制不明確的問(wèn)題，我們從系統(tǒng)水平對(duì)五倍子中的活性成分并作用機(jī)理進(jìn)行研究。結(jié)果表明，組分GCE-2具有較強(qiáng)的抑菌活性及促進(jìn)潰瘍愈合、減輕炎癥的作用，其主要成分為雙沒食子酸與三-O-沒食子酰基葡萄糖，可作為五倍子中的活性成分單獨(dú)或與其他藥物聯(lián)合用藥用于口腔潰瘍的治療。

目前口腔潰瘍模型建立方法包括免疫誘導(dǎo)法、化學(xué)灼燒法、氧自由基誘導(dǎo)法和細(xì)菌感染法等。其中，免疫誘導(dǎo)法與人體口腔潰瘍發(fā)病機(jī)制相似，該模型具有免疫力低下、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，但操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)，且不易控制潰瘍的數(shù)目、大小與出現(xiàn)部位；細(xì)菌誘導(dǎo)法適用于評(píng)價(jià)抗炎藥物對(duì)感染性口腔潰瘍的療效，但該模型需反復(fù)注射，易引起動(dòng)物感染，且成功率較低；氧自由基誘導(dǎo)法易引起動(dòng)物全身毒性；化學(xué)灼燒法以冰醋酸、苯酚或氫氧化鈉等誘導(dǎo)口腔潰瘍的建立，且造模成功率高、個(gè)體差異性小，適用于規(guī)模較大的實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物研究[25]。因此本實(shí)驗(yàn)選擇以50%冰醋酸誘導(dǎo)的大鼠口腔潰瘍?yōu)槟Ｐ停糜谠u(píng)價(jià)五倍子的抗炎活性。

在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中主要成分為四-O-沒食子酰基葡萄糖與五-O-沒食子?；咸烟堑慕M分GCE-3對(duì)大鼠口腔潰瘍療效不佳，且干預(yù)后潰瘍組織表面發(fā)黑。有文獻(xiàn)記載，小鼠皮下注射或腹腔注射高劑量的五倍子煎煮液后出現(xiàn)局部組織糜爛、壞死或動(dòng)物致死的現(xiàn)象，主要原因?yàn)槲灞蹲喻焚|(zhì)進(jìn)入體內(nèi)被分解為梧酸和焦梧酸，產(chǎn)生大量分解物質(zhì)，引起灶性肝細(xì)胞壞死，從而具有一定肝毒性[26]。另外，自1997年Christopher A.Lipinski提出類藥性五原則后，大量文獻(xiàn)將其用于評(píng)估活性化合物的類藥性[27]，如Shahinozzaman等[28]根據(jù)該法則和計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)快速高效地篩選出草藥中的PAK1抑制劑。通過(guò)類藥性五項(xiàng)原則對(duì)四-O-沒食子?；咸烟桥c五-O-沒食子?；咸烟堑念愃幮赃M(jìn)行評(píng)估，違背了其分子量不大于500 Da和氫鍵供體不超過(guò)5個(gè)兩項(xiàng)原則[29]，成藥性較低。本工作為五倍子在臨床中的應(yīng)用的安全性提供了依據(jù)。

系統(tǒng)藥理學(xué)分析得知，五倍子化合物中可能通過(guò)靶點(diǎn)PTGS1、PTGS2、MAPK14、DPP4和ampC發(fā)揮治療口腔潰瘍的活性，但DPP4、ampC參與口腔潰瘍發(fā)生發(fā)展過(guò)程的文獻(xiàn)記載較少，經(jīng)查閱文獻(xiàn)，TLR4受體與IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子可能參與口腔潰瘍的病理過(guò)程中。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)分離出五倍子中具有抗炎、抗菌活性的化合物，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了初步驗(yàn)證。系統(tǒng)藥理學(xué)從化合物的吸收、分布、代謝和排泄(ADME)性質(zhì)、靶點(diǎn)和蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)等多方面對(duì)中草藥中的活性成分與進(jìn)行了大規(guī)模的數(shù)據(jù)整合，但仍存在一定局限性，需進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行相應(yīng)的驗(yàn)證。且系統(tǒng)藥理學(xué)計(jì)算無(wú)法分析出化合物與靶點(diǎn)之間的量效關(guān)系，這限制了其在中草藥活性成分研究中的應(yīng)用。為深入研究五倍子中活性化合物、靶點(diǎn)與疾病之間復(fù)雜的關(guān)系，我們通過(guò)LC-MS技術(shù)對(duì)各組分中的主要成分進(jìn)行鑒定與分析，排除含量占比較低的化合物在疾病治療中的發(fā)揮主導(dǎo)作用的可能。通過(guò)LC-MS技術(shù)與系統(tǒng)藥理學(xué)相結(jié)合，對(duì)中草藥中活性化合物及作用機(jī)制進(jìn)行更精準(zhǔn)的預(yù)測(cè)。

本工作從系統(tǒng)的角度為五倍子治療口腔潰瘍的活性成分及作用機(jī)理研究提供了新的策略，利于促進(jìn)五倍子中單體成分的開發(fā)與應(yīng)用[30]。同時(shí)為進(jìn)一步研究五倍子中活性化合物組合，深入研究其藥用價(jià)值提供了重要的參考。