丁樹榮，李婷婷*，陸冰洋，劉華棟，唐娟，王彩先

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所太原 030032）

2020 年4 月太谷縣某雞場發(fā)生疫病，30 日齡雛雞陸續(xù)發(fā)病，出現(xiàn)精神沉郁、采食量下降、并有零星死亡，場主帶3 只剛死亡雛雞和3 只發(fā)病活雛雞前來本實驗室進(jìn)行診斷。經(jīng)病理剖檢和實驗室診斷，確診為傳染性法氏囊病繼發(fā)感染大腸桿菌。經(jīng)對癥治療后，病情很快得到控制。

1 臨床癥狀

病雞精神沉郁，有的閉眼縮脖、羽毛蓬亂，有的臥地不起、反應(yīng)遲鈍；體溫升高，采食量和飲水量均下降，排白色水樣稀便、肛門周圍羽毛被糞便污染，病程6d 左右，每天零星死亡3～5 只。

2 病理變化

對病雞和病死雞進(jìn)行病理剖檢可見，心臟和肝臟被白色纖維素性沉淀物包裹，呈現(xiàn)“包心包肝”現(xiàn)象；氣囊渾濁；肝臟腫大，呈土黃色，質(zhì)脆易碎；腺胃與肌胃交界處出血；十二指腸、小腸黏膜水腫、出血；盲腸扁桃體腫大、出血；法氏囊水腫，體積增大約2～3倍，有出血點和出血斑，法氏囊切開，可見白色滲出物。其他臟器未見明顯病變。

3 實驗室檢測

3.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

無菌采集病雞心血及肝臟組織，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板。經(jīng)37℃恒溫培養(yǎng)24h，可見瓊脂上形成一種圓形凸起、表面光滑濕潤、邊緣整齊的灰白色菌落。挑取單個菌落，劃線接種于麥康凱瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂，穿刺接種于三糖鐵斜面，37℃培養(yǎng)24h。結(jié)果如圖1、2、3。

培養(yǎng)結(jié)果可見，在麥康凱瓊脂上形成紅色圓形菌落，伊紅美藍(lán)瓊脂上形成黑色帶金屬光澤的菌落，三糖鐵斜面產(chǎn)氣變色。

挑取麥康凱瓊脂上單個菌落涂片，經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢，結(jié)果如圖4，可見兩端鈍圓、呈紅色的革蘭氏陰性短桿菌。

圖1 麥康凱瓊脂

圖2 伊紅美藍(lán)瓊脂

圖3 三糖鐵斜面

圖4 革蘭氏染色結(jié)果

3.2 生化鑒定

將純化培養(yǎng)的細(xì)菌接種于營養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)24h 后，進(jìn)行常規(guī)生化試驗鑒定，結(jié)果可見表1，根據(jù)生化試驗結(jié)果，判定分離菌為大腸桿菌。

表1 生化鑒定結(jié)果

3.2 細(xì)菌藥敏試驗

采用K-B 試紙擴(kuò)散法[1]，以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株ATCC25922 為參照，選用22 種臨床常用藥物進(jìn)行敏感性試驗。使用滅菌棉拭子蘸取純培養(yǎng)的大腸桿菌菌液，均勻涂布在營養(yǎng)瓊脂平板上，將鑷子于酒精燈灼燒后，取藥敏紙片等距離貼于營養(yǎng)瓊脂表面。37℃培養(yǎng)24h 后觀察結(jié)果。結(jié)果參考CLSI 標(biāo)準(zhǔn)做出判定[2]，結(jié)果見表2。

由表2 結(jié)果可知，大腸桿菌分離株對氧氟沙星、丁胺卡那、環(huán)丙沙星高度敏感，對磷霉素、培氟沙星、頭孢噻肟、恩諾沙星、慶大霉素中度敏感，其他藥物均耐藥。

表2 藥敏試驗結(jié)果

3.3 IBDV RT-PCR 鑒定

根據(jù)GeneBank 中發(fā)表的IBDV 基因序列設(shè)計引物：IBDVF：5'-CGTTTCCCTCWCAATCCACG-3'，IBDVR：5'-CTCATGTCTTCATGAGACAG-3'，擴(kuò)增其保守序列，目的片段為831bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行合成。

3.3.1 病毒RNA 的提取采集送檢發(fā)病雞的肝臟、脾臟、肺臟和法氏囊器官各1g，剪碎混勻后稱取0.05g 混合物，加入1mL 生理鹽水進(jìn)行研磨勻漿。8000rpm 離心2min 后，取上清液100μL 于新的離心管中，按照RNA 提取試劑盒使用說明書，經(jīng)過裂解、吸附、洗滌、洗脫后得到模板RNA 備用。

3.3.2 RT-PCR 擴(kuò)增及電泳 參照PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒說明書對病毒RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。PCR 反應(yīng)按照10×Dream Taq Buffer 5μL；IBDVF（10 μmol/L）2μL；IBDVR（10μmol/L）2μL；dNTP（10μmol/L）1μL；ddH2O 28.5μL；Template 8μL；Taq 酶（5U/μL）0.5μL；MgCl23μL；混合均勻成50μL 反應(yīng)體系。PCR擴(kuò)增程序為：94℃預(yù)變性10min，94℃變性30s，56℃退火60s，72℃延伸60s，循環(huán)共35 次；最后72℃延伸10min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在110V 電壓下使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖5。

由圖5 可見，被檢測樣品擴(kuò)增出831bp 的特異性條帶，初步判定從病料中分離的病毒為IBDV。

圖5 新城疫RT-PCR 檢測結(jié)果

4 結(jié)果與診斷

根據(jù)病雞臨床癥狀、病理剖檢變化及實驗室檢測結(jié)果，病雞可診斷為傳染性法氏囊病繼發(fā)大腸桿菌感染。

5 治療

淘汰并無害化處理發(fā)病雞。雞群緊急注射接種傳染性法氏囊高免卵黃抗體1mL/羽。根據(jù)藥敏試驗結(jié)果選用高敏藥物丁胺卡那飲水治療大腸桿菌感染，連用5～7d。加強(qiáng)養(yǎng)殖場飼養(yǎng)管理，做好日常消毒和清潔工作。第3d 開始無新增發(fā)病和死亡病雞，經(jīng)過5d 治療，雞群基本痊愈。

6 討論

傳染性法氏囊病（Infectious bursal disease，IBD）是由傳染性法氏囊病病毒（lnfectious bursal disease virus，IBDV）引起的一種急性、高度接觸性傳染病[3]，該病主要侵害3～7 周齡雛雞，以損傷雞的免疫器官法氏囊中的淋巴細(xì)胞為特征，導(dǎo)致免疫抑制，降低病雞對疫苗的免疫效力，增加了病雞對其它細(xì)菌性和病毒性疾病的易感性，臨床上常伴發(fā)細(xì)菌性疾病的混合感染[4]，且近年來山西分離到IBDV 超強(qiáng)毒株[5]，使雞的死亡、淘汰率增加，生產(chǎn)性能下降，給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大危害和損失。目前針對IBD 的治療尚無特效藥物，疫苗接種仍是主要防治手段。隨著養(yǎng)殖業(yè)和免疫技術(shù)的發(fā)展，大型現(xiàn)代化養(yǎng)殖場雞傳染性法氏囊病免疫良好，但仍有部分地區(qū)的散養(yǎng)戶未嚴(yán)格執(zhí)行免疫程序和雞舍消毒措施，導(dǎo)致免疫失敗甚至IBD 的流行和傳染。本研究中該雞場在已免疫IBD 疫苗后仍發(fā)病，可能與雛雞母源抗體參差不齊、疫苗運輸及使用不當(dāng)?shù)纫蛩赜嘘P(guān)[5,6]。

大腸桿菌是生產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的一種條件性致病菌，雞群在受到IBD 等免疫抑制疾病感染時，免疫力下降，加之較差的雞舍飼養(yǎng)環(huán)境都增加了大腸桿菌等致病菌的感染率。臨床上分離到的大腸桿菌耐藥性強(qiáng)，嚴(yán)重影響了藥物的選用和治療，因此在雞群發(fā)病初期就應(yīng)及時通過實驗室診斷及藥敏試驗選擇合理高敏的抗生素藥物進(jìn)行治療。

養(yǎng)殖場和養(yǎng)殖戶要選擇正確的疫苗，嚴(yán)格執(zhí)行合理的免疫程序和免疫監(jiān)測制度，雞群發(fā)生本病后，病雞應(yīng)及時注射雞傳染性法氏囊病高免血清或高免卵黃抗體進(jìn)行治療；定期消毒，每周輪流使用兩種消毒劑，對養(yǎng)殖環(huán)境和養(yǎng)殖工具進(jìn)行全面徹底的噴灑消毒2～3 次，防止疫情擴(kuò)散和蔓延；保持雞舍通風(fēng)，由于山西地區(qū)春季晝夜溫差較大，要協(xié)調(diào)好通風(fēng)和保溫工作。█