朱 源，李檢秀，李堅斌，黃日波

(1.廣西科學院，非糧生物質酶解國家重點實驗室，國家非糧生物質能源工程技術研究中心，廣西生物質工程技術研究中心，廣西生物煉制重點實驗室，廣西南寧 530007；2.廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧 530004)

0 引言

藥用植物是中藥材的主要來源，其植株的全部或特定組織中含有特殊藥效成分，可作為保健食材或藥物，預防和治療疾病。中國地域遼闊，氣候多樣，已知植物品種約25.7萬種。中國是藥用植物資源最豐富的國家之一，第四次全國中藥資源普查結果顯示，我國有野生藥用資源1.3萬余種，特有藥用植物3 150種[1]。廣西具有中藥資源7 088種，其中藥用植物5 996種，中藥資源和藥用植物數(shù)量目前居全國第一。藥用植物產(chǎn)生的特殊(或次生)代謝物，具有豐富的結構和獨特的生物活性，是現(xiàn)代藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)的天然產(chǎn)物庫[2]。根據(jù)生物合成類型，藥用成分可分為萜類、生物堿、苯丙類及其衍生物三大類。

萜類化合物是大部分藥用植物的有效成分，是已知最古老、結構最多樣化、分子種類最多的次級代謝產(chǎn)物，目前已發(fā)現(xiàn)鑒定的萜類化合物超過7萬種[3]。萜類化合物在藥用植物組織中分布廣泛，而且骨架龐雜，結構多樣。從化學結構來看，萜類化合物以異戊二烯單元(C5單元)分子骨架為基本結構單元。從生物合成源來看，甲戊二羥酸(Mevalonic Acid，MVA)是其生物合成的關鍵前體，其分子式符合(C5Hx)n通式。根據(jù)異戊二烯單元的數(shù)目，萜類化合物可分為半萜、單萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜、四萜、多聚萜，如單萜香葉醇(Geraniol)[4]、倍半萜青蒿素(Artemisinin)[5]、二萜雷公藤甲素(Triptolide)[6]、三萜皂苷(Triterpenoid saponins)[7]、四萜類胡蘿卜素(Carotenoids)[8]等。萜類化合物藥理活性和生物學功能也不盡相同，如青蒿素是抗瘧疾藥物[9]、紫杉醇是抗癌藥物[10]、穿心蓮內酯是抗菌消炎藥[11]、四環(huán)三萜類皂苷(人參皂苷、田七皂苷、絞股藍皂苷)可提高機體免疫力[12]、羅漢果苷是功能性甜味劑[13]、胡蘿卜素類化合物是抗氧化劑[14]。其中，四環(huán)三萜類皂苷是人參、西洋參和田七等名貴中藥材的主要藥效成分，具有抗癌、抗衰老、抗疲勞、抗心律失常、改善記憶力、保護神經(jīng)和治療心血管疾病等多種作用。素有“南方人參”“不老長壽藥草”美譽的絞股藍也含有大量的四環(huán)三萜類皂苷，具有抗腫瘤、調節(jié)血脂和血糖、保護肝臟、抗衰老等多種藥理活性。

四環(huán)三萜皂苷作為三萜類化合物的重要次生代謝物之一，由6個異戊二烯單元(C5H8)組成其骨架結構。目前，四環(huán)三萜類化合物主要從自然生物資源中直接提取純化獲得，該法嚴重依賴大量生物資源的獲取和消耗，面臨野生資源匱乏、地域分布窄、人工種植周期長等諸多限制，且提取和純化過程復雜、成本高昂[15]。例如，7年生人參根部總皂苷含量僅占根部干重的2%左右，一些具有重要藥用活性的稀有皂苷含量更是低于十萬分之一[16，17]。四環(huán)三萜類化合物結構復雜，含有多個手性中心，化學合成過程中容易形成難以分離的非活性甚至是有毒的光學異構體。此外，其化學合成過程復雜、轉化率低、能耗高，所使用的有機溶劑容易對生態(tài)環(huán)境造成嚴重污染，難以滿足未來可持續(xù)綠色工業(yè)化的需要[18]。植物組織細胞培養(yǎng)法可以大幅降低植物生長周期、有效避免使用重金屬和有機溶劑。然而該方法與常規(guī)微生物發(fā)酵相比，步驟煩瑣、操作復雜、轉化率低、細胞生長周期長、成本高昂，難以實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)[19]。隨著高通量測序技術和分子生物學基因編輯技術的逐漸成熟，一條可持續(xù)發(fā)展的替代途徑受到生物科學家們的關注：合成生物學通過整合基因組學、轉錄組學、代謝組學等多組學研究，利用生物信息學技術挖掘和鑒定傳統(tǒng)藥用植物活性成分合成途徑中涉及的關鍵基因，闡明天然產(chǎn)物的合成機理；在微生物中模擬藥用植物代謝調控網(wǎng)絡，設計人工合成途徑，構建微生物“人造細胞工廠”；利用廉價的碳源和氮源定向合成高附加值、稀有、特殊用途的天然化合物。隨著研究不斷深入，合成生物學技術極大地提高了微生物“細胞工廠”生產(chǎn)目標天然產(chǎn)物的能力[20]。因此合理利用合成生物學設計思維，在微生物宿主中重構底盤細胞前體合成途徑、引入天然產(chǎn)物關鍵修飾基因、改造全局代謝網(wǎng)絡和產(chǎn)物運輸?shù)饶K，可實現(xiàn)目標天然產(chǎn)物的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)[21，22]。

近年來，藥用植物四環(huán)三萜類化合物的研究主要集中在提取工藝、成分分析及藥理活性方面。隨著分子生物學研究的不斷深入，藥用植物四環(huán)三萜皂苷的生物合成途徑中的功能基因成為藥用植物學研究領域的熱點。本文對常見的藥用植物四環(huán)三萜皂苷的生物合成學研究現(xiàn)狀展開論述，重點介紹了以達瑪烷型、葫蘆烷型、環(huán)阿屯烷型為代表的幾類化合物的生物合成研究進展，在高效合成四環(huán)三萜皂苷，推動藥用植物資源可持續(xù)利用等方面具有參考意義。

1 藥用植物中四環(huán)三萜皂苷的生物合成途徑

三萜類化合物的合成途徑有兩種：一是細胞質體中的2-甲基赤蘚糖-4-磷酸途徑(Methylerythritol Phosphate Pathway，MEP)，主要參與二萜、單萜、類胡蘿卜素、異戊二烯等的生物合成；二是胞漿中的甲羥戊酸途徑(Mevalonate Pathway，MVA)，主要參與單萜、半倍萜和三萜等次生代謝產(chǎn)物的生物合成。至今，三萜類化合物的生物合成途徑逐漸明晰，其生物合成途徑可分為3個階段。

首先，異戊二烯焦磷酸(Cisopentenyl Pyrophosphate，IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(Dimethylallyl Diphosphate，DMAPP)均可通過MVA途徑和MEP途徑形成，兩種途徑可以通過交換IPP和DMAPP調節(jié)生物體萜類化合物的合成。

其次，牻牛兒基焦磷酸合酶(Geranyl Diphosphate Synthase，GPS)催化IPP和DMAPP，合成牻牛兒基焦磷酸(Geranyl Diphosphate，GPP)，IPP與GPP在法呢烯焦磷酸合酶(Farnesyl Pyrophosphate Synthase，F(xiàn)PS)的催化下形成法呢烯焦磷酸酯(Farnesyl Diphosphate，F(xiàn)PP)。隨后角鯊烯合酶(Squalene Synthase，SQS)催化FPP頭尾結合成角鯊烯(Squalene，SQ)，并在鯊烯環(huán)氧化酶(Squalene Epoxidase，SQE)的作用下進一步催化形成2,3-環(huán)氧鯊烯(2,3-Oxidosqualene)。2,3-環(huán)氧鯊烯在不同種類的氧化鯊烯環(huán)化酶(Oxidosqualene Cyclases，OSC)的催化下，經(jīng)環(huán)化、重排得到結構多樣化的三萜骨架。

最后，經(jīng)過一系列修飾酶，如細胞色素P450酶(Cytochrome P450 Monooxygenase，CYP450)、糖基轉移酶(UDP-Glycosyltransferases，UGT)等進行三萜骨架修飾[23]，從而合成結構多樣和功能各異的三萜類化合物，具有代表性的藥用植物四環(huán)三萜皂苷主要包括達瑪烷型、葫蘆烷型、環(huán)阿屯烷型和羊毛脂烷型。

2 常見四環(huán)三萜類化合物及其研究現(xiàn)狀

2.1 達瑪烷型

人參、西洋參、田七是傳統(tǒng)名貴中藥，需要在特定地域條件下生長3—6年才能收獲。其主要活性成分是四環(huán)三萜皂苷[24]，具有抗腫瘤、抗癌、抗心律失常、保護神經(jīng)、治療心血管疾病、提高機體免疫力等多種藥理活性[25]。素有“南方人參”美譽的絞股藍中也含有大量四環(huán)三萜皂苷[26]。目前已從人參中鑒定出皂苷150多種，從田七中鑒定出70多種，從絞股藍中鑒定出200多種，這些皂苷以達瑪烷型三萜皂苷為主。達瑪烷型四環(huán)三萜皂苷的共同前體2,3-環(huán)氧鯊烯，首先通過達瑪烯二醇合酶(Dammarenediol-Ⅱ Synthase，DS)催化生成達瑪烯二醇(Damanediol，DM)；其次在細胞色素P450酶(CYP450)的作用下，生成原人參二醇(Protopanaxadiol，PPD)和原人參三醇(Protopanaxatriol，PPT)；最后通過糖基轉移酶(UGT)進行糖基化修飾，分別在原人參二醇的C3和/或C20位點，原人參三醇的C6和/或C20位點，以及其他位點進行糖基化修飾，進一步分化為不同的人參/田七/絞股藍皂苷(圖1)。

圖1 人參皂苷及羅漢果苷生物合成途徑Fig.1 Biosynthesis pathway of ginsenoside and mogroside

王冬等[27]在構建釀酒酵母細胞工廠、優(yōu)化MVA途徑工程菌的基礎上，綜合運用途徑的模塊化及組合優(yōu)化、基因元件篩選、密碼子優(yōu)化、反義RNA技術、發(fā)酵工藝等技術策略，通過基因模塊組合優(yōu)化的方法獲得由丹參法尼基焦磷酸合酶(SmFPS)和擬南芥鯊烯合酶 (AtSQS2)組成的功能模塊，顯著提高三萜類化合物前體的含量。該課題組首次將三萜合成通量提高到 10 g·L-1級別，構建出產(chǎn)量高達 15 g·L-1達瑪烯二醇的酵母細胞工廠。Jung等[28]對人參轉錄組進行了測序和組裝，鑒定了2個參與人參皂苷生物合成的糖基轉移酶(PgUGT74AE2和PgUGT94Q2)，隨后將這2個糖基轉移酶基因與達瑪烯二醇合酶(PgDS)和原人參二醇合酶(PgPPDS)基因一起導入酵母細胞，從頭合成人參皂苷Rg3。結果表明2個糖基轉移酶是人參皂苷Rg3合成的關鍵酶。

同期，Wang等[29]在人參中克隆并鑒定2個糖基轉移酶(UGTPg29和UGTPg45)，通過建立2個酵母細胞工廠，以葡萄糖為原料，實現(xiàn)了稀有人參皂苷Rg3和Rh2的人工生物合成。隨后該課題組系統(tǒng)地優(yōu)化了酵母底盤細胞，為前體合成提供充足碳通量，提高C3-OH位點糖基轉移酶的表達水平和效率，通過10 L發(fā)酵罐補料發(fā)酵，人參皂苷Rh2產(chǎn)量達到2.25 g·L-1[30]。

2.2 葫蘆烷型

羅漢果甜苷是在羅漢果果實中發(fā)現(xiàn)的葫蘆烷型四環(huán)三萜皂苷，近年來在世界各地被廣泛用作天然食品甜味劑[31]，其本身具有抗炎抗菌、抗腫瘤、降血糖、增強免疫力等多種藥理活性。葫蘆烷型四環(huán)三萜皂苷的共同前體2,3-環(huán)氧鯊烯在葫蘆二烯醇合酶(Cucurbitadienol Synthase，CDS)的作用下生成葫蘆二烯醇(Cucurbitadienol)。隨后，葫蘆二烯醇在細胞色素P450酶和糖基轉移酶的作用下，依次形成羅漢果醇(Mogrol)和羅漢果苷(Mogroside)(圖1)。研究發(fā)現(xiàn)，在羅漢果苷的生物合成途徑中，關鍵酶葫蘆二烯醇合酶(SgCDS)是導致其皂苷類合成的第一個限速酶，該酶也是合成途徑唯一的環(huán)化酶。

Dai等[32]運用RNA測序結合基因表達譜分析，首次鑒定了羅漢果中葫蘆二烯醇合酶SgCDS和糖基轉移酶UGT74AC1的基因功能。體外活性測定表明，UGT74AC1將UDP-葡萄糖醛酸中的葡萄糖基轉移至葫蘆烷二烯醇的C3—OH位點，催化葫蘆烷二烯醇形成羅漢果苷Ⅰ E (Mogroside Ⅰ E)。隨后該課題組成功鑒定與葫蘆二烯醇C11位點氧化有關的細胞色素P450酶CYP87D18[33]。體外實驗結果證實，CYP87D18可氧化葫蘆烷二烯醇C11位，生成11-氧化葫蘆二烯醇(11-oxo cucurbitadienol)和11-羥基葫蘆二烯醇(11-hydroxy cucurbitadienol)。將SgCDS與CYP87D18在酵母宿主中共表達，得到11-氧化-24,25-環(huán)氧葫蘆二烯醇(11-oxo-24,25-epoxy cucurbitadienol)、11-氧化葫蘆二烯醇(11-oxo cucurbitadienol)和11-羥基葫蘆二烯醇(11-hydroxy cucurbitadienol)，其結構經(jīng)液相色譜-固相萃取-核磁共振-質譜聯(lián)用(LC/SPENMR/MS)確證。

Itkin等[34]確定了羅漢果成熟果實中主要甜苷羅漢果苷Ⅴ(Mogroside Ⅴ)的生物合成途徑，鑒定了參與羅漢果苷Ⅴ合成途徑的5個關鍵酶家族成員：鯊烯環(huán)氧酶(Squalene Epoxidases，SE)、葫蘆二烯醇合酶(SgCDS)、環(huán)氧化物水解酶(Epoxide Hydrolases，EPH)、細胞色素P450酶(CYP450)和糖基轉移酶(UGT)。2,3-環(huán)氧鯊烯(2,3-oxidosqualene)通過鯊烯環(huán)氧酶轉化為2,3-22,23-二環(huán)氧鯊烯(2,3-22,23-diepoxysqualene)，再經(jīng)過葫蘆二烯醇合酶、環(huán)氧化物水解酶及CYP87D18合成葫蘆素(Mogrol)。葫蘆素再經(jīng)UGT720-269-1和UGT94-289-3兩個糖基轉移酶的催化，最后形成羅漢果苷Ⅴ。

Zhao等[35]進一步研究羅漢果皂苷的生物合成途徑，采用cDNA末端快速擴增聚合酶鏈反應(RACE-PCR)的方法，克隆羅漢果鯊烯合酶SgSQS和環(huán)阿糖醇合成酶(Cycloartenol Synthase，CAS)的全長cDNA鏈，推導出的SgSQS蛋白在C末端有兩個跨膜區(qū)。通過對羅漢果的角鯊烯合成酶SgSQS和環(huán)阿糖醇合成酶SgCAS的克隆與鑒定，為進一步研究羅漢果SgSQS蛋白和SgCAS蛋白的基因功能奠定基礎。隨后，該課題組鑒定羅漢果細胞色素P450酶(CYP450)的基因功能[36]。研究結果表明，羅漢果轉錄組數(shù)據(jù)庫中有兩個全長細胞色素P450還原酶亞型，且SgCPR1和SgCPR2轉錄結果在羅漢果的所有組織中均可檢測到。該表達模式與幾種關鍵酶相似，而且SgCPR1和SgCPR2對NADPH、FAD和FMN都具有一定的活性功能。因此，SgCPR1和SgCPR2都可能參與羅漢果次生代謝，尤其是羅漢果皂苷的生物合成。

葫蘆二烯醇作為葫蘆烷型四環(huán)三萜皂苷合成的關鍵中間體，其含量在相關藥用植物組織中極低。Chiu等[37]利用靈芝菌絲體對羅漢果提取物進行生物轉化來富集羅漢果苷Ⅲ E (Mogroside Ⅲ E)，通過高效液相色譜-質譜-核磁共振聯(lián)用技術對靈芝菌絲體的代謝產(chǎn)物進行分析，確定羅漢果苷Ⅲ E為靈芝菌絲體的主要代謝物。該菌通過脫糖反應將羅漢果提取物中豐富的羅漢果苷Ⅴ轉化為羅漢果苷Ⅲ E，并檢測到高水平的β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)活性。通過動力學模型擬合、動態(tài)吸附研究和解吸實驗，優(yōu)化HP-20大孔吸附樹脂純化，獲得17.38 g羅漢果苷Ⅲ E，純度55.14%，回收率74.71%。因此，羅漢果苷生物合成途徑的闡明，一定程度上為工程菌的構建及后續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了理論和實驗基礎。

2.3 環(huán)阿屯烷型

黃芪作為一種重要的藥用植物，分布范圍廣且種類多，主要用于治療腎炎、糖尿病和癌癥，其藥理活性包括免疫調節(jié)[38]、降血糖[39]、抗氧化[40]和抗病毒[41]等。黃芪具有補氣強壯之功效，所含的皂苷、黃酮和多糖被認為是其臨床療效的主要成分。黃芪中分離鑒定出的皂苷大約20種，多數(shù)皂苷元為環(huán)黃芪醇(Cycloastragenol)[42]。在已知的黃芪生物合成途徑中，環(huán)阿屯醇是合成黃芪皂苷的主要前體，由2,3-氧化鯊烯通過環(huán)阿屯烷合酶(Cycolartenol Synthase，CS)催化生成。目前，黃芪皂苷的結構和藥理特性得到歸類，但其應用基礎研究尚很薄弱，特別是其藥用成分黃芪皂苷類化合物的生物合成途徑的解析基礎甚少。

黃芪皂苷的結構根據(jù)四環(huán)三萜骨架的C-17延伸側鏈分類。迄今為止，已有文獻報道了3種主要的皂苷元結構(Cycloastragenol、Cyclocanthagenol和Cyclocerebrotol)(圖2)，它們分別衍生自20,24-環(huán)氧基和20,25-環(huán)氧基側鏈[43-45]。李振秋等[46]通過總RNA的提取及逆轉錄PCR方法，從黃芪中克隆了鯊烯合酶基因cDNA序列。研究發(fā)現(xiàn)黃芪鯊烯合酶的氨基酸序列與大豆鯊烯合酶(BAA22559.1)序列相似性達88%。劉玥輝等[47]運用二維核磁共振技術(2D NMR)，對黃芪中環(huán)阿屯烷型四環(huán)三萜皂苷所有核磁共振信號進行準確歸屬，通過ROESY實驗結果確認環(huán)阿屯烷型皂苷的相對構型。

圖2 黃芪中環(huán)阿屯烷型皂苷元結構示意圖Fig.2 Schematic diagram structures of cycloartane sapogenin from Astragalus

Guo等[48]從黃芪根部分離并鑒定出一個新的環(huán)阿屯烷化合物(3β-acetoxy-9β-19-cyclolanost-24E-ene-1α,16β-diol-27-O-β-d-glucopyranoside)，通過質譜分析確定了該化合物結構。Jiao等[49]通過茉莉酸甲酯誘導提高黃芪毛狀根培養(yǎng)物中黃芪甲苷(Astragaloside)的產(chǎn)量，并增強其生物合成基因的轉錄反應。黃芪毛狀根培養(yǎng)物在茉莉酸甲酯、水楊酸和乙酰水楊酸誘導下，黃芪甲苷的生物合成增加。通過對所選的誘導條件進行優(yōu)化，黃芪甲苷最大產(chǎn)量(5.5±0.13) mg/g。此外，該課題組還分析了黃芪甲苷含量與基因表達水平之間的關系，闡明了黃芪甲苷生物合成途徑的關鍵調控點。然而，黃芪皂苷的生物合成途徑機制尚未得到完整解析，研究人員需要不斷努力，如確定細胞色素P450酶和糖基轉移酶下游裝飾基因，最終闡明不同個體黃芪皂苷的生物合成機制。

3 展望

迄今為止，研究人員已經(jīng)在藥用植物活性代謝產(chǎn)物(如人參皂苷、三七皂苷、絞股藍皂苷及羅漢果甜苷等)的分子合成機制研究方面取得一定進展，特別是對多基因家族氧化鯊烯環(huán)化酶(OSCs)關鍵酶的基因克隆研究。雖然藥用植物四環(huán)三萜類化合物的類型眾多且結構復雜，但是各成分的提取與結構鑒定都有所突破。同時新型四環(huán)三萜類化合物及其衍生物也不斷被科學家發(fā)現(xiàn)。另外，在四環(huán)三萜化類合物的骨架修飾階段，由于涉及修飾關鍵酶基因種類數(shù)量龐大，官能團反應機制復雜，其具體合成路徑的闡明進展緩慢，對特定活性物質的生物合成途徑的解析還不夠具體，如藥用植物黃芪的次級代謝產(chǎn)物黃芪甲苷的生物合成途徑解析，尤其是關鍵修飾酶如細胞色素P450酶、糖基轉移酶等的挖掘和鑒定。

因此，未來的研究重點應該是進一步解析更多珍稀四環(huán)三萜皂苷的生物合成途徑，挖掘與表征系列生物元件，利用酶工程手段提高關鍵酶的催化效率，優(yōu)化細胞工廠及發(fā)酵條件來提高目標產(chǎn)物的產(chǎn)量和轉化率，最終實現(xiàn)藥用植物四環(huán)三萜類化合物的工業(yè)化高效生產(chǎn)。