李萍, 洪珍平

天津市津南醫(yī)院 1婦產(chǎn)科， 2內科(天津 300350)

羊水栓塞(amniotic fluid embolism，AFE)為分娩過程中出現(xiàn)的羊水突然進入母體血液循環(huán)所引起的一種罕見的、難以預測的危重的臨床綜合征，其主要以急性肺栓塞、過敏性休克、嚴重時猝死等嚴重的分娩期并發(fā)癥，對母嬰安全有著嚴重威脅，當被胎糞污染的羊水進入到母體血液后，其在反應過程中將補體及中心粒細胞激活后即可導致炎癥反應，引起肺部血管內皮細胞受損，細胞的通透性升高使細胞的滲出液增多，引起肺水腫，從而導致患者出現(xiàn)呼吸困難，低氧血癥甚至是呼吸衰竭[1-2]。烏司他丁(UTI)目前已廣泛應用于多種危重疾病的治療，其對各種原因所致的急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征均有顯著的療效[3-4]，但是烏司他丁對于羊水栓塞所致的肺損傷的治療效果和機制未見相關報道。2019年3月15日至8月21日,本研究擬構建羊水栓塞肺部損傷大鼠模型后，予以烏司他丁干預，探討烏司他丁對羊水栓塞所致肺損傷的保護作用及可能機制，為臨床有效治療羊水栓塞提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及材料 雌性SD孕鼠60只，胎齡20 d，體重270～390 g，由南開大學動物實驗中心提供[動物質量合格證號：SCXK(津)20120024，SYXK(津)2014-0083]；烏司他丁(廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，國藥準字H19990133)；基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、GAPDH單克隆抗體(Sigma公司，美國)Trizol試劑盒、IP細胞裂解液、ELISA相關試劑盒、Western blot試劑盒(碧云天生物技術研究所)；相關引物合成(北京賽百勝生物技術公司)；普通光學倒置顯微鏡(Nikon)。

1.2 動物造摸及分組 取妊娠晚期(孕19～20 d)SD 雌鼠60 只，自由飲水，禁食12 h后按0.35 mg/100 g劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉滿意后,將大鼠仰臥固定,腹部中線備皮，經(jīng)75%的酒精消毒后, 腹正中行3 cm切口,暴露子宮, 取胎鼠后行子宮次切術后關腹。1 mL 注射器抽取羊水后注入到胎鼠腸腔內，將胎糞沖洗出來，生理鹽水配置 1% 的羊水胎糞液備用。實驗分為3組，每組20只: 對照組經(jīng)股靜脈注入生理鹽水；羊水栓塞組：股靜脈按0.25 mL/100 g 注入羊水胎糞液后腹腔注射等體積的生理鹽水；烏司他丁組：股靜脈按0.25 mL/100 g 注入羊水胎糞液后腹腔注射烏司他丁10×104U/kg，8 h后進行后繼檢測。若實驗中大鼠死亡, 則重新造摸后增補。

1.3 炎癥因子ELISA測定 每組隨機選5只大鼠予10% KCl處死后，打開胸腔，分離氣管，用手術刀在氣管上行“T”形切口，經(jīng)切口向氣管內置入適當長度的靜脈導管，通過注射器吸取適量無菌生理鹽水，經(jīng)靜脈導管注入肺中反復沖洗，經(jīng)3次沖洗后將抽出的液體置入到2 mL 的EP管內，采用ELISA法檢測肺泡灌洗液中的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-10、IL-1β及IL-6因子含量。具體操作步驟照各種ELISA試劑說明書進行操作。

1.4 肺組織病理改變 每組隨機選5只大鼠10% KCl處死大鼠后，打開胸腔，將雙側肺組織取出，并放于事先準備好的容器中，容器中盛有10%甲醛，將肺組織進行固定24 h后，取出肺組織用石蠟進行包埋，經(jīng)過特定時間的包埋后，將肺組織進行切片處理，切片厚度應均勻，然后將各組切片均進行HE染色，將染色后的切片再經(jīng)過樹膠封固及烤干后，置于光鏡下進行觀察肺組織結構的改變。

1.5 光鏡分析小鼠肺組織濕干比變化 每組隨機選5只大鼠予10% KCl處死后，打開胸腔，將雙側肺組織取出，置于備好的錫箔紙上，錫箔紙已經(jīng)測定重量且設定為W0，將肺組織與錫箔紙一起再次測定重量設為W1，W1-W0為大鼠肺組織的濕重，同法對各只大鼠肺組織濕重測定并記錄，打開烘干箱，將各組大鼠肺組織均置入其中進行烘干，烘干條件為70℃，時長為72 h，烘干后取出對烘干的肺組織與錫箔紙再次稱重，重量設定為W2，W2-W0為大鼠肺組織干重，稱量完畢后，W/D值=(W1-W0)/(W2-W0)。

1.6 RT-PCR檢測 每組隨機選5只大鼠予10% KCl 處死后，打開胸腔，將雙側肺組織取出，取50 mg于液氮中研碎，加入TRIzol試劑裂解細胞提取總RNA。根據(jù)逆轉錄說明書合成相應的cDNA并進行擴增。反應條件：95℃預變性2 min，95℃退火15 s，54℃ 30 s，65℃ 20 s，擴增40循環(huán)，最終72℃延伸7 min。MMP-2引物序列上游:5′-TTTTTGTGCCCAAAGAAAGG-3′,下游：5′- ATGTCAGACAACCCGAGTCC-3′;擴增長度為414 bp; MMP-9引物序列上游：5′- GGTTTCTGTCCAGACCAAGG-3′，下游：5′- TGCAAGGATTGTCATCTGGA-3′;擴增長度為379 bp；參照物GAPDH引物序列上游：5′-TGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3′；下游：5′-TTCCCATTCTCAGCCTTGAC-3′，擴增長度為190 bp。以GAPDH為內參，測定MMP-2、MMP-9 mRNA相對表達水平。

1.7 Western blot檢測 將RT-PCR提取后剩余物以1 500 r/min，離心30 min，取上清為粗體蛋白質，通過BCA法測定各組蛋白含量，5%濃縮膠40 V衡壓1 h，10%分離膠恒壓60 V，3.5 h，濕轉14 V恒壓14 h，37℃搖床封閉2 h，轉印后加入MMP-2、MMP-9及GAPDH一抗(1∶1 000)孵育過夜，二抗(1∶1 500)室溫孵育1 h，暗室加入ECL發(fā)光液后曝光后顯影，X線膠片照相，行灰度值分析。

2 結果

2.1 BALF中炎癥因子含量 采用ELISA法測定各組大鼠BALF中的炎癥因子的含量，將各組檢測結果進行比較，與對照組相比，羊水栓塞組肺泡灌洗液TNF-α、IL-8、IL-1β及IL-6明顯升高(P<0.05)，烏司他丁組以上指標較羊水栓塞組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明羊水栓塞后予以烏司他丁治療能夠降低大鼠肺部炎癥水平，與對照組相比，烏司他丁組BALF中的TNF-α、IL-8、IL-1β及IL-6仍高(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠BALF中炎癥因子的含量(n=5)

2.2 肺組織HE染色 羊水栓塞組大鼠肺組織可見不同程度水腫,局部血管豐富,可見少量出血,支氣管及血管的周圍有大量炎癥細胞浸潤;烏司他丁組肺組織病理改變較羊水栓塞組減輕;對照組大鼠肺組織則無明顯改變,見圖1，可見予以烏司他丁治療能夠減輕羊水栓塞大鼠肺部病理損傷。

注：A:對照組；B:羊水栓塞組；C:烏司他丁組

2.3 大鼠肺組織濕干比變化 與對照組相比，羊水栓塞組大鼠肺組織W/D值明顯升高(P<0.05)，烏司他丁組較羊水栓塞組W/D值降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明大鼠羊水栓塞后予以烏司他丁干預能夠有效的減輕AFE大鼠肺水腫，與對照組相比，烏司他丁組大鼠肺組織W/D值仍高(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠肺組織濕干比變化(n=5)

2.4 MMP-2、MMP-9 mRNA表達水平 RT-PCR檢測顯示與對照組相比，羊水栓塞組肺組織MMP-2、MMP-9 mRNA表達明顯升高(P<0.05)，烏司他丁組肺組織MMP-2、MMP-9 mRNA表達較羊水栓塞組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明大鼠羊水栓塞后予以烏司他丁干預可能通過降低MMP-2、MMP-9 mRNA表達，發(fā)揮降低肺部損傷的作用，與對照組相比，烏司他丁組大鼠肺組織MMP-2、MMP-9 mRNA表達仍高(P<0.05)，見圖2。

2.5 MMP-2、MMP-9 蛋白表達水平 Western blot檢測顯示與對照組相比，羊水栓塞組肺組織MMP-2、MMP-9蛋白表達明顯升高(P<0.05)，烏司他丁組肺組織MMP-2、MMP-9蛋白表達較羊水栓塞組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明大鼠羊水栓塞后予以烏司他丁干預可能通過降低 MMP-2、MMP-9 蛋白表達，發(fā)揮降低肺部損傷的作用。 與對照組相比，烏司他丁組大鼠肺組織MMP-2、MMP-9 蛋白表達仍高(P<0.05)，見圖3。

注：A：MMP-2、MMP-9 mRNA電泳圖;B:MMP-2、MMP-9 mRNA的表達量

3 討論

羊水栓塞是指由于羊水進入母體循環(huán)后所引起的，敏感母體對羊水成份產(chǎn)生抗原抗體反應以及內源性介質釋放，從而引起低氧、低血壓導致呼吸循環(huán)衰竭等病理改變嚴重綜合征，盡管目前對羊水栓塞的認識和治療水平有所提高，但是羊水栓塞仍然是孕產(chǎn)婦死亡的主要原因。羊水和或胎糞成份在母體循環(huán)引起不受控制的抗原抗體反應和內源性介質釋放并進一步發(fā)展為急性肺損傷和呼吸循環(huán)衰竭[5-8]。炎癥介質在羊水栓塞所致的肺損傷中起著著重要的作用，過度的炎癥反應會引起肺組織直接損傷并在局部激活炎癥級聯(lián)反應。烏司他丁是從健康男性尿液提取的糖蛋白，其具有對溶酶體膜穩(wěn)定和抑制溶酶體釋放的作用，能夠有效抑制氧自由基和心肌抑制因子產(chǎn)生，可以發(fā)揮保護組織細胞，調節(jié)炎癥因子的釋放以及改善血液循環(huán)的作用。烏司他丁可抑制絲氨酸蛋白酶，并具有抑制炎癥介質產(chǎn)生和釋放的功能， 能夠抑制和消除氧自由基的產(chǎn)生，保護身體器官功能的穩(wěn)定性。

近期臨床及基礎相關研究顯示，烏司他丁治療能減輕各種原因所引起的肺部損傷[9-11]，本研究將烏司他丁用于羊水栓塞所致的大鼠肺部損傷的治療，探討其保護作用和機制。本研究經(jīng)股靜脈注入自體羊水加胎糞制作羊水栓塞模型大鼠，肺組織病理觀察發(fā)現(xiàn)大鼠肺組織出現(xiàn)不同程度水腫,局部血管豐富, 可見少量出血, 支氣管及血管的周圍被大量炎癥細胞浸潤，表明羊水栓塞模型大鼠模型制作成功，進一步檢測顯示 羊水栓塞組較對照組W/D 升高，說明損傷后肺組織出現(xiàn)水腫，與羊水栓塞組相比，烏司他丁組大鼠肺組織HE 染色顯示肺泡結構得到明顯改善，炎癥細胞浸潤情況降低，烏司他丁組W/D值較羊水栓塞組亦降低，濕干比變化能夠反應肺部損傷水腫情況及治療效果。TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-8均為促炎因子，其中TNF-α是一個起始因子，其由單核巨噬細胞及淋巴細胞合成分泌并能引起炎癥級聯(lián)反應，促進其他炎癥因子IL-1β、IL-6 和IL-8等的釋放，引起肺組織損傷，并誘導淋巴細胞凋亡[12-14]，故檢驗造摸后及烏司他丁治療后 TNF-α、IL-8、IL-1β及IL-6的水平及變化，能夠反映造摸是否成功及治療后的效果。烏司他丁組BALF中的TNF-α、IL-8、IL-1β及IL-6較羊水栓塞組顯著降低，說明烏司他丁能夠降低羊水栓塞肺損傷的氧化應激反應，發(fā)揮肺功能保護作用，故烏司他丁的應用能夠阻斷以上病理生理反應，對羊水栓塞所致的肺部損傷發(fā)揮保護作用。為了深入探討烏司他丁減輕羊水栓塞肺組織損傷的可能機制，本研究對各組肺組織MMP-2、MMP-9進行分子生物學檢測，既往研究表明MMP-2、MMP-9高表達與肺和支氣管細胞基底膜斷裂密切相關，其表達水平與肺損傷的嚴重程度呈正相關，MMP- 2、MMP-9降解的胞外基質片段對炎癥細胞還有趨化作用，可放大局部炎癥反應，加重肺水腫[15-16]。本研究結果顯示羊水栓塞組MMP-2、MMP-9表達高于對照組，經(jīng)烏司他丁液治療后MMP-2、MMP-9表達降低，表明烏司他丁可能通過下調MMP-2、MMP-9表達保護大鼠肺功能，減輕肺水腫和炎癥反應，發(fā)揮治療羊水栓塞肺組織損傷的作用，當然本研究仍需進一步深入研究，羊水栓塞所致的全身性反應需要綜合治療，藥物治療只是治療手段之一，臨床治療過程中需要與其他治療方法聯(lián)合應用，此外烏司他丁在臨床治療羊水栓塞中的具體療效，療程及作用有待進一步進行臨床觀察及研究。