超聲-微波協(xié)同優(yōu)化啤酒花殘?jiān)性ㄇ嗨氐奶崛」に?/h1>
2020-11-19 01:15:24魏文慧劉小波于長(zhǎng)青張曉雪賈鴻震
食品工業(yè)科技 2020年21期
魏文慧,劉小波,于長(zhǎng)青,張曉雪,李 冰,賈鴻震
(甘肅省輕工研究院有限責(zé)任公司,甘肅蘭州 730030)
原花青素(Procyanidins,OPC),又稱(chēng)前花青素,它是雙黃酮衍生物的多酚類(lèi)化合物[1],是一種國(guó)際上公認(rèn)的最有效的天然抗氧化劑之一。醫(yī)學(xué)研究表明,原花青素具有清除人體自由基、抗腫瘤、降血脂、預(yù)防老年癡呆等的作用[2-4]。啤酒花(HumunuslupulusL)是多年生草質(zhì)蔓生藤本植物,是釀造啤酒的主要原料之一,它不僅能提供啤酒獨(dú)特的香氣,而且還賦予啤酒獨(dú)特的口感和防腐作用,被譽(yù)為“啤酒的靈魂”[5]。我國(guó)啤酒花的種植主要分布在甘肅、新疆和寧夏等地。目前,研究發(fā)現(xiàn)啤酒花中有400多種化合物,其中主要包括:α-酸、β-酸、酒花油、酒花樹(shù)脂和酒花多酚等[6]。啤酒花主要用于提取酒花浸膏,提取浸膏后的殘?jiān)蠖啾粡U棄,其中還含有多種有效成分未被利用,造成了資源的浪費(fèi)。
目前,從植物中提取原花青素的方法多為直接浸提法,該方法不僅提取時(shí)間長(zhǎng),且提取率不高[7]。超聲波提取是一種利用它的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)和熱效應(yīng),通過(guò)增大溶劑分子的運(yùn)動(dòng)速度和穿透力來(lái)快速有效地提取生物活性成分的提取方法[8-9]。微波提取也是一項(xiàng)新的輔助提取技術(shù),在微波場(chǎng)中,由于微波的輻射作用下,物料細(xì)胞內(nèi)部溫度迅速升高,壓力增大,細(xì)胞漲破,使有效成分快速被溶出,同時(shí)在萃取體系中由于基體物質(zhì)的差異性選擇吸收微波能，使某些組分被選擇性的加熱,從而被萃取出來(lái)[10-11]。超聲波和微波輔助提取在不同植物原料提取原花青素中均有所應(yīng)用。徐潔等[12]分別利用超聲波和微波從玫瑰花中提取原花青素,提取量分別為96.94和100.81 mg/g。張佰清和陳月英等[13-14]利用微波提取技術(shù)從葡萄皮渣和樹(shù)莓籽中提取原花青素,提取量分別為9.12和7.19 mg/g。超聲-微波協(xié)同提取法能有效地結(jié)合超聲波提取法和微波提取法的優(yōu)點(diǎn),具有協(xié)同有效地提高提取效率,縮短提取時(shí)間、降低能耗等優(yōu)點(diǎn),在天然產(chǎn)物提取方面應(yīng)用廣泛[15]。然而,目前對(duì)于超聲-微波協(xié)同提取法在原花青素提取上的研究并不多見(jiàn),應(yīng)用該技術(shù)提取啤酒花殘?jiān)械脑ㄇ嗨氐姆椒ㄟ€未見(jiàn)報(bào)道。
因此,本研究以啤酒花殘?jiān)鼮樵?利用超聲-微波協(xié)同法進(jìn)行原花青素的提取,研究微波功率、微波時(shí)間、乙醇濃度、料液比、浸提溫度和浸提時(shí)間對(duì)原花青素提取的影響,在此基礎(chǔ)上利用Plackett-Burnman試驗(yàn)設(shè)計(jì)選出對(duì)其提取量影響較大的4個(gè)因素,然后再運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲-微波協(xié)同提取原花青素的最佳工藝參數(shù),以期為啤酒花殘?jiān)木C合利用提供理論基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
啤酒花殘?jiān)?超臨界CO2萃取殘?jiān)? 甘肅省玉門(mén)拓璞科技開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司提供;原花青素標(biāo)準(zhǔn)品(純度:95%) 美國(guó)Solarbio公司;甲醇(色譜純)、甲醇、無(wú)水乙醇、石油醚(30～60 ℃)、硫酸鐵銨、正丁醇、鹽酸、異丙醇、甲酸 分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。
YC-2型索氏抽提器 上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司;HD-E804-34A型恒溫鼓風(fēng)干燥箱 東莞市海達(dá)儀器有限公司;CW-2000型超聲-微波協(xié)同提取儀 上海新拓分析儀器科技有限公司;SHZ-D(III)型循環(huán)水真空泵 上海貝侖儀器設(shè)備有限公司;ES1035A型分析天平 廈門(mén)群隆儀器有限公司;Agilent 1260高效液相色譜 北京京科瑞達(dá)科技有限公司;KQ-2200DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 樣品前處理 參考《食品中脂肪的測(cè)定》[16]的方法,略作修改。稱(chēng)取一定量的酒花殘?jiān)?利用索氏抽提法對(duì)其進(jìn)行脫脂,石油醚熱回流抽提1.5 h,然后將其取出放在50 ℃烘箱中烘至恒重,裝入自封袋冷藏備用。
1.2.2 原花青素的提取 工藝流程:啤酒花殘?jiān)樘崛ブ?微波協(xié)同提取→水浴浸提→抽濾→原花青素提取液
稱(chēng)取10 g去脂后的酒花殘?jiān)糜?00 mL圓底燒瓶中,按照一定的料液比加入一定濃度的乙醇溶液,然后將其放在超聲功率為50 W、溫度為60 ℃的超聲-微波協(xié)同提取儀中,設(shè)定一定的微波功率和時(shí)間對(duì)其進(jìn)行超聲-微波處理,處理結(jié)束后將其取出,然后再在一定溫度和時(shí)間的水浴鍋中進(jìn)行振搖提取,提取結(jié)束后抽濾,將濾液置于容量瓶中,沉淀物再重復(fù)上述提取過(guò)程提取1次。合并兩次提取液,用相應(yīng)濃度的乙醇溶液定容備用。
1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在超聲波功率為50 W、溫度為60 ℃條件下,研究微波功率、微波時(shí)間、乙醇濃度、料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間6個(gè)因素對(duì)酒花殘?jiān)性ㄇ嗨氐寐实挠绊?每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。以三次提取的平均值為評(píng)價(jià)值。
1.2.3.1 微波功率 按照“1.2.2”的方法,控制微波時(shí)間為50 s,乙醇濃度60%,料液比1∶20 g/mL,浸提溫度55 ℃,浸提時(shí)間1.5 h,考察微波功率(400、500、600、700、800 W)對(duì)酒花殘?jiān)性ㄇ嗨氐寐实挠绊憽?/p>
1.2.3.2 微波時(shí)間 在上述優(yōu)化微波功率的基礎(chǔ)上,確定微波功率為600 W,乙醇濃度60%,料液比1∶20 g/mL,浸提溫度55 ℃,浸提時(shí)間1.5 h,考察微波時(shí)間(10、30、50、70、90 s)對(duì)酒花殘?jiān)性ㄇ嗨氐寐实挠绊憽?/p>
1.2.3.3 乙醇濃度 在上述優(yōu)化微波功率和微波時(shí)間的基礎(chǔ)上,確定微波功率為600 W、時(shí)間為70 s,料液比1∶20 g/mL,浸提溫度55 ℃,浸提時(shí)間1.5 h,考察乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%)對(duì)酒花殘?jiān)性ㄇ嗨氐寐实挠绊憽?/p>
1.2.3.4 料液比 在上述優(yōu)化微波功率、微波時(shí)間和乙醇濃度的基礎(chǔ)上,確定微波功率為600 W、時(shí)間為70 s,乙醇濃度為60%,浸提溫度55 ℃,浸提時(shí)間1.5 h,考察料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)對(duì)酒花殘?jiān)性ㄇ嗨氐寐实挠绊憽?/p>
1.2.3.5 浸提溫度 在上述優(yōu)化微波功率、微波時(shí)間、乙醇濃度和料液比的基礎(chǔ)上,確定微波功率600 W、時(shí)間70 s,乙醇濃度60%,料液比1∶15 g/mL,浸提時(shí)間1.5 h,考察浸提溫度(25、40、55、70、85 ℃)對(duì)酒花殘?jiān)性ㄇ嗨氐寐实挠绊憽?/p>
1.3.3.6 浸提時(shí)間 在上述優(yōu)化微波功率、微波時(shí)間、乙醇濃度、料液比和浸提溫度的基礎(chǔ)上,確定微波功率600 W、時(shí)間70 s,乙醇濃度60%,料液比1∶15 g/mL,浸提溫度55 ℃,考察浸提時(shí)間(0.5、1、1.5、2、2.5 h)對(duì)酒花殘?jiān)性ㄇ嗨氐寐实挠绊憽?/p>
1.2.4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)可以確定因素對(duì)響應(yīng)值的影響作用,篩選出對(duì)響應(yīng)值有影響的因素[17-18]。本試驗(yàn)以原花青素含量為響應(yīng)值,在單因素的基礎(chǔ)上,利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)來(lái)篩選微波功率、微波時(shí)間、乙醇濃度、料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間6個(gè)因素對(duì)原花青素含量的影響,為進(jìn)一步的Box-Behnken試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。
表1 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平表Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman test design
1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過(guò)單因素試驗(yàn)及Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)的結(jié)果,篩選出對(duì)啤酒花殘?jiān)崛≡ㄇ嗨赜绊懽畲蟮?個(gè)因素,然后運(yùn)用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化。以原花青素的含量為響應(yīng)值(Y),分別以微波功率(A)、微波時(shí)間(B)、乙醇濃度(C)、浸提溫度(D)為自變量進(jìn)行優(yōu)化。Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。
表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平表Table 2 Factors and levels of Box-Behnken test
1.2.6 超聲波、微波輔助提取原花青素 分別稱(chēng)取兩份去脂后的試樣10 g,放入500 mL圓底燒瓶中,一份進(jìn)行超聲波輔助提取,另一份進(jìn)行微波輔助提取,提取工藝同1.2.2。超聲波輔助提取和微波輔助提取條件參考超聲-微波協(xié)同提取的最優(yōu)提取條件進(jìn)行設(shè)定。每個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。
超聲波提取條件:超聲波功率50 W、超聲溫度55 ℃、超聲時(shí)間76 s,乙醇濃度60%、浸提溫度55 ℃、浸提時(shí)間1.0 h、料液比1∶15 g/mL。
微波提取條件:微波功率540 W、微波溫度55 ℃、微波時(shí)間76 s、乙醇濃度60%、浸提溫度55 ℃、浸提時(shí)間1.0 h、料液比1∶15 g/mL。
1.2.7 原花青素含量的測(cè)定
1.2.7.1 色譜條件 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線制作參考《保健食品中前花青素的測(cè)定》[19]的方法,略作修改。色譜柱:Symmetry C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相:水∶甲醇(色譜純)∶異丙醇∶甲酸=73∶13∶6∶8,紫外檢測(cè)器波長(zhǎng):525 nm,進(jìn)樣量:10 μL,流速:1.0 mL/min,柱溫:35 ℃。
1.2.7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱(chēng)取20.00 mg原花青素標(biāo)準(zhǔn)品,將其溶解在甲醇溶液中,配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液,然后分別吸取1、2、3、4、5 mL置于5 mL容量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻。配制成梯度標(biāo)準(zhǔn)液,然后各取2 mL進(jìn)行水解反應(yīng),并上高效液相色譜分析測(cè)定,水解處理方法同試樣測(cè)定,以峰面積對(duì)原花青素濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.2.7.3 試樣測(cè)定 將正丁醇與鹽酸按95∶5的體積比混合后,取出15 mL置于具塞錐形瓶中,再加入0.5 mL 2%的硫酸鐵銨溶液和2 mL試樣溶液,混勻,置于沸水中水浴回流,精確加熱40 min后,立即置于冰水中冷卻,經(jīng)0.45 μm膜過(guò)濾,待進(jìn)高效液相色譜分析。
試樣中原花青素計(jì)算公式如下:
式中:x:原花青素的含量,單位(mg/g);X1:從標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到的原花青素,單位(mg/mL);V1:試樣定容體積,單位(mL);f:稀釋倍數(shù);m:試樣的體積,單位(mL);V2:提取液體積,單位(mL);M:去脂后啤酒花殘?jiān)|(zhì)量，單位(g)。
1.3 數(shù)據(jù)處理
2 結(jié)果與分析
2.1 原花青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線
以不同濃度的原花青素標(biāo)準(zhǔn)品繪制的原花青素含量與峰面積之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示,原花青素濃度在200～1000 μg/mL時(shí),峰面積與原花青素濃度之間呈很好的線性關(guān)系,線性方程為y=0.2703x-9.3506(R2=0.9997,n=5),因此,在測(cè)定原花青素濃度時(shí),將待測(cè)樣品稀釋到一定的濃度,用此方法在相同條件下測(cè)定原花青素的出峰面積,通過(guò)出峰面積計(jì)算原花青素的含量。
圖1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Procyanidins standard curve
圖2 微波功率對(duì)原花青素提取量的影響Fig.2 Effect of microwave power on the yield of procyanidins注:不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05);圖3～圖7同。
2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.2.1 微波功率對(duì)原花青素提取量的影響 圖2反映的是微波功率對(duì)啤酒花殘?jiān)性ㄇ嗨靥崛×康挠绊?從圖2中可以看出,微波功率在400～600 W之間時(shí),隨著功率的增加,酒花殘?jiān)性ㄇ嗨氐奶崛×恐饾u增大,在功率為600 W時(shí),提取量最大14.22 mg/g。之后隨著功率的增大,原花青素提取量趨于平穩(wěn),當(dāng)功率增大到800 W時(shí),原花青素含量出現(xiàn)了下降的趨勢(shì),這可能是由于微波功率增大,微波產(chǎn)生的熱效應(yīng)增大,破壞了原花青素的穩(wěn)定性。
2.2.2 微波時(shí)間對(duì)原花青素提取量的影響 由圖3可知,當(dāng)微波時(shí)間在10～70 s時(shí),隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)從啤酒花殘?jiān)刑崛〉脑ㄇ嗨睾匡@著增大(P<0.05),在微波處理70 s時(shí),提取液中原花青素含量最大14.66 mg/g,之后當(dāng)時(shí)間延長(zhǎng)到90 s時(shí)原花青素含量略有下降,但差異不顯著(P>0.05)。這是由于微波對(duì)啤酒花殘?jiān)M織不斷的破壞,使的酒花殘?jiān)械脑ㄇ嗨乇会尫懦鰜?lái),故提取液中原花青素的含量逐漸增加,當(dāng)微波工作一定的時(shí)間后,原花青素的溶解量已經(jīng)達(dá)到了最大,微波持續(xù)工作引起溶液局部溫度升高,破壞了原花青素的結(jié)構(gòu),含量下降[20]。
圖3 微波時(shí)間對(duì)原花青素提取量的影響Fig.3 Effect of microwave time on the yield of procyanidins
2.2.3 乙醇濃度對(duì)原花青素提取量的影響 不同乙醇濃度對(duì)原花青素提取量的影響如圖4所示,隨著乙醇濃度的增加,啤酒花殘?jiān)性ㄇ嗨氐奶崛×砍氏壬吆笙陆档内厔?shì),當(dāng)乙醇濃度在60%時(shí),提取液中原花青素的含量最高14.59 mg/g,之后繼續(xù)增大乙醇濃度,原花青素含量反而下降,這是由于原花青素含有酚羥基,具有一定的極性[21]。在提取過(guò)程中乙醇溶液作為提取劑,隨著濃度的不同乙醇溶液的極性不同,進(jìn)而影響對(duì)原花青素的溶解性及選擇性。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇乙醇濃度為60%,在該濃度下原花青素的溶出量最大。
圖4 乙醇濃度對(duì)原花青素提取量的影響Fig.4 Effect of ethanol concentrationon the yield of procyanidins
2.2.4 料液比對(duì)原花青素提取量的影響 料液比對(duì)原花青素提取量的影響如圖5所示。隨著料液比的增加,原花青素的提取量逐漸增大,當(dāng)料液比達(dá)到1∶15 g/mL后,持續(xù)加大料液比,原花青素提取量變化不再顯著(P>0.05)。這是由于提取劑用量是提取過(guò)程中一個(gè)很好的推動(dòng)力,在提取過(guò)程中,適宜的濃度差,能夠起到很好的提取效果。一般而言,提取劑用量越大,能夠被提出來(lái)的物質(zhì)越多,啤酒花殘?jiān)刑崛≡ㄇ嗨貙?shí)際上是一個(gè)溶質(zhì)被溶劑化的過(guò)程,當(dāng)擴(kuò)散達(dá)到平衡點(diǎn)之后,如果繼續(xù)增加溶劑的量,溶質(zhì)的溶出量不會(huì)發(fā)生太大的變化[22]。同時(shí),如果一味的增大溶劑的用量,對(duì)后續(xù)的過(guò)濾、濃縮和溶劑的回收會(huì)造成很大的困難,提取成本增大。由圖5結(jié)果顯示,當(dāng)料液比達(dá)1∶15 g/mL以后,原花青素的提取量相差不大,但是料液比的增加會(huì)給后續(xù)處理帶來(lái)麻煩,且過(guò)高的料液比造成了溶劑的極大浪費(fèi),因而選擇料液比為1∶15 g/mL較為合適。
圖5 料液比對(duì)原花青素提取量的影響Fig.5 Effect of material/liquid ratioon the yield of procyanidins
2.2.5 浸提溫度對(duì)原花青素提取量的影響 當(dāng)浸提溫度在25～55 ℃的范圍時(shí),隨著浸提溫度的升高,啤酒花殘?jiān)性ㄇ嗨乇惶岢龅牧吭酱?當(dāng)浸提溫度55 ℃時(shí),原花青素提取量達(dá)到最大12.48 mg/g,之后隨溫度的升高,原花青素的提取量顯著下降(P<0.05)(圖6)。這是由于溫度的升高增大了溶劑分子的布朗運(yùn)動(dòng),使得溶劑擴(kuò)散速度增大,從而更多的原花青素被帶出來(lái),溫度55 ℃時(shí),原花青素的溶出達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡,提取量最大,繼續(xù)升高浸提溫度,高溫使得原花青素遭到破壞,溫度越高破壞越嚴(yán)重[23],該研究結(jié)果與鄭洪亮從紅皮云杉中提取原花青素的結(jié)果一致[24]。因此,在后續(xù)的提取過(guò)程中選取55 ℃為浸提溫度。
表4 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 4 Analysis of variance of Plackett-Burman test
圖6 浸提溫度對(duì)原花青素提取量的影響Fig.6 Effect of extraction temperatureon the yield of procyanidins
2.2.6 浸提時(shí)間對(duì)原花青素提取量的影響 如圖7所示,在浸提時(shí)間0.5～1.0 h時(shí),浸提時(shí)間對(duì)啤酒花殘?jiān)性ㄇ嗨氐奶崛∮绊戯@著(P<0.05),當(dāng)浸提時(shí)間超過(guò)1.5 h時(shí)原花青素含量變化不再顯著(P>0.05),這可能是由于浸提時(shí)間較短,部分與蛋白質(zhì)和纖維素結(jié)合的原花青素類(lèi)物質(zhì)來(lái)不及溶出[25],但是浸提時(shí)間過(guò)長(zhǎng),原花青素類(lèi)物質(zhì)穩(wěn)定性較差,容易發(fā)生氧化聚合等反應(yīng),同時(shí),啤酒花殘?jiān)械脑ㄇ嗨亟^大部分已經(jīng)溶出。繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間只會(huì)增加提取成本,同時(shí)使得原花青素發(fā)生氧化反應(yīng)而分解。故認(rèn)為浸提時(shí)間為1.0 h較好。
圖7 浸提時(shí)間對(duì)原花青素提取量的影響Fig.7 Effect of extraction time on the yield of procyanidins
2.3 Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果
通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響啤酒花殘?jiān)刑崛≡ㄇ嗨氐囊蛩剡M(jìn)行顯著性分析,Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3,試驗(yàn)結(jié)果方差分析見(jiàn)表4。
表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Experimental design and resultsof Plackett-Burman test
由表4 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果方差分析可知,試驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆O顯著(P<0.01)。同時(shí)結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)及Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果可知,微波功率(A)、微波時(shí)間(B)、乙醇濃度(C)和浸提溫度(E)四個(gè)因素對(duì)啤酒花殘?jiān)性ㄇ嗨氐奶崛∮绊戯@著(P<0.05),所以選擇微波功率、微波時(shí)間、乙醇濃度和浸提溫度進(jìn)行響應(yīng)面的優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)。料液比(D)和浸提時(shí)間(F)兩個(gè)因素對(duì)原花青素提取量影響不顯著(P>0.05),所以在后續(xù)試驗(yàn)中將其固定為1∶15 g/mL和1.0 h。
表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Experimental design and results of Box-Behnken test
表6 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 6 Analysis of variance of Box-Behnken test
2.4 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果
2.4.1 原花青素得率試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 利用Design-Expert 8.0對(duì)表5中的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和回歸分析,對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合。以微波功率(A)、微波時(shí)間(B)乙醇濃度(C)和浸提時(shí)間(D)為自變量,擬合得到回歸方程:
原花青素含量(mg/g)=14.38+0.25A+0.59B+0.28C+0.15D+0.36AB-0.065AC-0.070AD-0.66BC-0.23BD+0.085CD-0.50A2-1.13B2-0.70C2-1.21D2。
圖8 交互作用對(duì)原花青素含量影響的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface of the effect of interaction terms on the yield of procyanidins
2.4.2 響應(yīng)面交互作用分析 響應(yīng)面3D曲面圖反映的是兩兩因素之間對(duì)響應(yīng)值的影響作用,其中3D曲面圖越陡峭,說(shuō)明兩因素之間交互作用越明顯。從圖8可以看出微波時(shí)間和乙醇濃度、微波功率和微波時(shí)間、微波時(shí)間和浸提溫度之間交互作用顯著(P<0.05),其余兩兩因素之間交互作用不顯著(P>0.05)。該結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。
2.4.3 最優(yōu)提取工藝參數(shù)及驗(yàn)證 通過(guò)利用Design-Expert 8.0設(shè)計(jì)分析得到的超聲-微波協(xié)同提取原花青素最佳工藝為微波功率535.70 W、微波時(shí)間76.07 s、乙醇濃度60.43%、浸提溫度55.35 ℃,預(yù)測(cè)原花青素含量為14.53 mg/g?？紤]到實(shí)際操作,驗(yàn)證試驗(yàn)取超聲波功率50 W、超聲-微波處理溫度55 ℃、微波功率540 W、微波時(shí)間76 s、乙醇濃度60%、浸提溫度55 ℃、浸提時(shí)間1.0 h、料液比1∶15 g/mL的條件下進(jìn)行。在此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn),得到的啤酒花殘?jiān)性ㄇ嗨睾繛?4.68±0.33 mg/g,與預(yù)測(cè)值相差1.03%,說(shuō)明模型有效。這一研究與李玉妹[26]研究的利用有機(jī)溶劑提取不同種類(lèi)啤酒花中原花青素含量有所差異,這是由于啤酒花經(jīng)過(guò)超臨界CO2提取酒花浸膏后部分原花青素也被帶走,導(dǎo)致了酒花殘?jiān)性ㄇ嗨睾科?同時(shí)在原花青素的測(cè)定方法,本研究與李玉妹[26]的研究也有所不同。
2.5 啤酒花殘?jiān)暡?、微波及超?微波協(xié)同提取原花青素的比較
通過(guò)對(duì)超聲波輔助提取、微波輔助提取及超聲-微波協(xié)同提取的結(jié)果比較發(fā)現(xiàn),超聲-微波協(xié)同提取原花青素含量顯著(P<0.05)高于單一輔助提取法提取的原花青素含量。同時(shí)還可以看出微波輔助提取效果優(yōu)于超聲波輔助提取,且差異顯著(P<0.05),這可能是由于在該研究中所用的超聲波功率較低,使得超聲波沒(méi)有起到很好的輔助效果,原花青素沒(méi)有完全溶出,提取出的含量較低。從三種輔助提取方法的結(jié)果比較可以看出,超聲-微波協(xié)同提取能夠起到很好的提取效果,該輔助提取法具有一定的推廣應(yīng)用價(jià)值。
表7 不同輔助提取方法提取原花青素的比較Table 7 Comparison of procyanidins extractedby different extraction methods
3 結(jié)論
通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)及Plackett-Burman試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),利用超聲-微波協(xié)同輔助提取原花青素時(shí),當(dāng)料液比和浸提時(shí)間達(dá)到一定的大小后,其對(duì)原花青素含量的影響差異不再顯著,但在萃取過(guò)程中原花青素的含量隨著微波功率、微波時(shí)間、乙醇濃度、浸提溫度的增大呈先增大后降低的趨勢(shì)。因此,在此基礎(chǔ)上利用Design-Expert 8.0中的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)一步對(duì)超聲-微波協(xié)同提取原花青素的工藝進(jìn)行研究,得到了超聲-微波協(xié)同儀輔助提取原花青素的最佳工藝:超聲波功率50 W、超聲-微波處理溫度55 ℃、微波功率540 W、微波時(shí)間76 s、乙醇濃度60%、浸提溫度55 ℃、浸提時(shí)間1.0 h、料液比1∶15 g/mL,在此條件下,原花青素的提取量可達(dá)到14.68 mg/g。且顯著高于單另一種超聲波提取或微波提取(P<0.05)。該研究可以為啤酒花殘?jiān)刑崛≡ㄇ嗨氐难芯刻峁┮欢ǖ睦碚搮⒖肌?/p>
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魏文慧,劉小波,于長(zhǎng)青,張曉雪,李 冰,賈鴻震
(甘肅省輕工研究院有限責(zé)任公司,甘肅蘭州 730030)
原花青素(Procyanidins,OPC),又稱(chēng)前花青素,它是雙黃酮衍生物的多酚類(lèi)化合物[1],是一種國(guó)際上公認(rèn)的最有效的天然抗氧化劑之一。醫(yī)學(xué)研究表明,原花青素具有清除人體自由基、抗腫瘤、降血脂、預(yù)防老年癡呆等的作用[2-4]。啤酒花(HumunuslupulusL)是多年生草質(zhì)蔓生藤本植物,是釀造啤酒的主要原料之一,它不僅能提供啤酒獨(dú)特的香氣,而且還賦予啤酒獨(dú)特的口感和防腐作用,被譽(yù)為“啤酒的靈魂”[5]。我國(guó)啤酒花的種植主要分布在甘肅、新疆和寧夏等地。目前,研究發(fā)現(xiàn)啤酒花中有400多種化合物,其中主要包括:α-酸、β-酸、酒花油、酒花樹(shù)脂和酒花多酚等[6]。啤酒花主要用于提取酒花浸膏,提取浸膏后的殘?jiān)蠖啾粡U棄,其中還含有多種有效成分未被利用,造成了資源的浪費(fèi)。
目前,從植物中提取原花青素的方法多為直接浸提法,該方法不僅提取時(shí)間長(zhǎng),且提取率不高[7]。超聲波提取是一種利用它的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)和熱效應(yīng),通過(guò)增大溶劑分子的運(yùn)動(dòng)速度和穿透力來(lái)快速有效地提取生物活性成分的提取方法[8-9]。微波提取也是一項(xiàng)新的輔助提取技術(shù),在微波場(chǎng)中,由于微波的輻射作用下,物料細(xì)胞內(nèi)部溫度迅速升高,壓力增大,細(xì)胞漲破,使有效成分快速被溶出,同時(shí)在萃取體系中由于基體物質(zhì)的差異性選擇吸收微波能，使某些組分被選擇性的加熱,從而被萃取出來(lái)[10-11]。超聲波和微波輔助提取在不同植物原料提取原花青素中均有所應(yīng)用。徐潔等[12]分別利用超聲波和微波從玫瑰花中提取原花青素,提取量分別為96.94和100.81 mg/g。張佰清和陳月英等[13-14]利用微波提取技術(shù)從葡萄皮渣和樹(shù)莓籽中提取原花青素,提取量分別為9.12和7.19 mg/g。超聲-微波協(xié)同提取法能有效地結(jié)合超聲波提取法和微波提取法的優(yōu)點(diǎn),具有協(xié)同有效地提高提取效率,縮短提取時(shí)間、降低能耗等優(yōu)點(diǎn),在天然產(chǎn)物提取方面應(yīng)用廣泛[15]。然而,目前對(duì)于超聲-微波協(xié)同提取法在原花青素提取上的研究并不多見(jiàn),應(yīng)用該技術(shù)提取啤酒花殘?jiān)械脑ㄇ嗨氐姆椒ㄟ€未見(jiàn)報(bào)道。
因此,本研究以啤酒花殘?jiān)鼮樵?利用超聲-微波協(xié)同法進(jìn)行原花青素的提取,研究微波功率、微波時(shí)間、乙醇濃度、料液比、浸提溫度和浸提時(shí)間對(duì)原花青素提取的影響,在此基礎(chǔ)上利用Plackett-Burnman試驗(yàn)設(shè)計(jì)選出對(duì)其提取量影響較大的4個(gè)因素,然后再運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲-微波協(xié)同提取原花青素的最佳工藝參數(shù),以期為啤酒花殘?jiān)木C合利用提供理論基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
啤酒花殘?jiān)?超臨界CO2萃取殘?jiān)? 甘肅省玉門(mén)拓璞科技開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司提供;原花青素標(biāo)準(zhǔn)品(純度:95%) 美國(guó)Solarbio公司;甲醇(色譜純)、甲醇、無(wú)水乙醇、石油醚(30～60 ℃)、硫酸鐵銨、正丁醇、鹽酸、異丙醇、甲酸 分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。
YC-2型索氏抽提器 上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司;HD-E804-34A型恒溫鼓風(fēng)干燥箱 東莞市海達(dá)儀器有限公司;CW-2000型超聲-微波協(xié)同提取儀 上海新拓分析儀器科技有限公司;SHZ-D(III)型循環(huán)水真空泵 上海貝侖儀器設(shè)備有限公司;ES1035A型分析天平 廈門(mén)群隆儀器有限公司;Agilent 1260高效液相色譜 北京京科瑞達(dá)科技有限公司;KQ-2200DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 樣品前處理 參考《食品中脂肪的測(cè)定》[16]的方法,略作修改。稱(chēng)取一定量的酒花殘?jiān)?利用索氏抽提法對(duì)其進(jìn)行脫脂,石油醚熱回流抽提1.5 h,然后將其取出放在50 ℃烘箱中烘至恒重,裝入自封袋冷藏備用。
1.2.2 原花青素的提取 工藝流程:啤酒花殘?jiān)樘崛ブ?微波協(xié)同提取→水浴浸提→抽濾→原花青素提取液
稱(chēng)取10 g去脂后的酒花殘?jiān)糜?00 mL圓底燒瓶中,按照一定的料液比加入一定濃度的乙醇溶液,然后將其放在超聲功率為50 W、溫度為60 ℃的超聲-微波協(xié)同提取儀中,設(shè)定一定的微波功率和時(shí)間對(duì)其進(jìn)行超聲-微波處理,處理結(jié)束后將其取出,然后再在一定溫度和時(shí)間的水浴鍋中進(jìn)行振搖提取,提取結(jié)束后抽濾,將濾液置于容量瓶中,沉淀物再重復(fù)上述提取過(guò)程提取1次。合并兩次提取液,用相應(yīng)濃度的乙醇溶液定容備用。
1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在超聲波功率為50 W、溫度為60 ℃條件下,研究微波功率、微波時(shí)間、乙醇濃度、料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間6個(gè)因素對(duì)酒花殘?jiān)性ㄇ嗨氐寐实挠绊?每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。以三次提取的平均值為評(píng)價(jià)值。
1.2.3.1 微波功率 按照“1.2.2”的方法,控制微波時(shí)間為50 s,乙醇濃度60%,料液比1∶20 g/mL,浸提溫度55 ℃,浸提時(shí)間1.5 h,考察微波功率(400、500、600、700、800 W)對(duì)酒花殘?jiān)性ㄇ嗨氐寐实挠绊憽?/p>
1.2.3.2 微波時(shí)間 在上述優(yōu)化微波功率的基礎(chǔ)上,確定微波功率為600 W,乙醇濃度60%,料液比1∶20 g/mL,浸提溫度55 ℃,浸提時(shí)間1.5 h,考察微波時(shí)間(10、30、50、70、90 s)對(duì)酒花殘?jiān)性ㄇ嗨氐寐实挠绊憽?/p>
1.2.3.3 乙醇濃度 在上述優(yōu)化微波功率和微波時(shí)間的基礎(chǔ)上,確定微波功率為600 W、時(shí)間為70 s,料液比1∶20 g/mL,浸提溫度55 ℃,浸提時(shí)間1.5 h,考察乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%)對(duì)酒花殘?jiān)性ㄇ嗨氐寐实挠绊憽?/p>
1.2.3.4 料液比 在上述優(yōu)化微波功率、微波時(shí)間和乙醇濃度的基礎(chǔ)上,確定微波功率為600 W、時(shí)間為70 s,乙醇濃度為60%,浸提溫度55 ℃,浸提時(shí)間1.5 h,考察料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)對(duì)酒花殘?jiān)性ㄇ嗨氐寐实挠绊憽?/p>
1.2.3.5 浸提溫度 在上述優(yōu)化微波功率、微波時(shí)間、乙醇濃度和料液比的基礎(chǔ)上,確定微波功率600 W、時(shí)間70 s,乙醇濃度60%,料液比1∶15 g/mL,浸提時(shí)間1.5 h,考察浸提溫度(25、40、55、70、85 ℃)對(duì)酒花殘?jiān)性ㄇ嗨氐寐实挠绊憽?/p>
1.3.3.6 浸提時(shí)間 在上述優(yōu)化微波功率、微波時(shí)間、乙醇濃度、料液比和浸提溫度的基礎(chǔ)上,確定微波功率600 W、時(shí)間70 s,乙醇濃度60%,料液比1∶15 g/mL,浸提溫度55 ℃,考察浸提時(shí)間(0.5、1、1.5、2、2.5 h)對(duì)酒花殘?jiān)性ㄇ嗨氐寐实挠绊憽?/p>
1.2.4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)可以確定因素對(duì)響應(yīng)值的影響作用,篩選出對(duì)響應(yīng)值有影響的因素[17-18]。本試驗(yàn)以原花青素含量為響應(yīng)值,在單因素的基礎(chǔ)上,利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)來(lái)篩選微波功率、微波時(shí)間、乙醇濃度、料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間6個(gè)因素對(duì)原花青素含量的影響,為進(jìn)一步的Box-Behnken試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。
表1 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平表Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman test design
1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過(guò)單因素試驗(yàn)及Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)的結(jié)果,篩選出對(duì)啤酒花殘?jiān)崛≡ㄇ嗨赜绊懽畲蟮?個(gè)因素,然后運(yùn)用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化。以原花青素的含量為響應(yīng)值(Y),分別以微波功率(A)、微波時(shí)間(B)、乙醇濃度(C)、浸提溫度(D)為自變量進(jìn)行優(yōu)化。Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。
表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平表Table 2 Factors and levels of Box-Behnken test
1.2.6 超聲波、微波輔助提取原花青素 分別稱(chēng)取兩份去脂后的試樣10 g,放入500 mL圓底燒瓶中,一份進(jìn)行超聲波輔助提取,另一份進(jìn)行微波輔助提取,提取工藝同1.2.2。超聲波輔助提取和微波輔助提取條件參考超聲-微波協(xié)同提取的最優(yōu)提取條件進(jìn)行設(shè)定。每個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。
超聲波提取條件:超聲波功率50 W、超聲溫度55 ℃、超聲時(shí)間76 s,乙醇濃度60%、浸提溫度55 ℃、浸提時(shí)間1.0 h、料液比1∶15 g/mL。
微波提取條件:微波功率540 W、微波溫度55 ℃、微波時(shí)間76 s、乙醇濃度60%、浸提溫度55 ℃、浸提時(shí)間1.0 h、料液比1∶15 g/mL。
1.2.7 原花青素含量的測(cè)定
1.2.7.1 色譜條件 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線制作參考《保健食品中前花青素的測(cè)定》[19]的方法,略作修改。色譜柱:Symmetry C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相:水∶甲醇(色譜純)∶異丙醇∶甲酸=73∶13∶6∶8,紫外檢測(cè)器波長(zhǎng):525 nm,進(jìn)樣量:10 μL,流速:1.0 mL/min,柱溫:35 ℃。
1.2.7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱(chēng)取20.00 mg原花青素標(biāo)準(zhǔn)品,將其溶解在甲醇溶液中,配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液,然后分別吸取1、2、3、4、5 mL置于5 mL容量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻。配制成梯度標(biāo)準(zhǔn)液,然后各取2 mL進(jìn)行水解反應(yīng),并上高效液相色譜分析測(cè)定,水解處理方法同試樣測(cè)定,以峰面積對(duì)原花青素濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.2.7.3 試樣測(cè)定 將正丁醇與鹽酸按95∶5的體積比混合后,取出15 mL置于具塞錐形瓶中,再加入0.5 mL 2%的硫酸鐵銨溶液和2 mL試樣溶液,混勻,置于沸水中水浴回流,精確加熱40 min后,立即置于冰水中冷卻,經(jīng)0.45 μm膜過(guò)濾,待進(jìn)高效液相色譜分析。
試樣中原花青素計(jì)算公式如下:
式中:x:原花青素的含量,單位(mg/g);X1:從標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到的原花青素,單位(mg/mL);V1:試樣定容體積,單位(mL);f:稀釋倍數(shù);m:試樣的體積,單位(mL);V2:提取液體積,單位(mL);M:去脂后啤酒花殘?jiān)|(zhì)量，單位(g)。
1.3 數(shù)據(jù)處理
2 結(jié)果與分析
2.1 原花青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線
以不同濃度的原花青素標(biāo)準(zhǔn)品繪制的原花青素含量與峰面積之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示,原花青素濃度在200～1000 μg/mL時(shí),峰面積與原花青素濃度之間呈很好的線性關(guān)系,線性方程為y=0.2703x-9.3506(R2=0.9997,n=5),因此,在測(cè)定原花青素濃度時(shí),將待測(cè)樣品稀釋到一定的濃度,用此方法在相同條件下測(cè)定原花青素的出峰面積,通過(guò)出峰面積計(jì)算原花青素的含量。
圖1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Procyanidins standard curve
圖2 微波功率對(duì)原花青素提取量的影響Fig.2 Effect of microwave power on the yield of procyanidins注:不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05);圖3～圖7同。
2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.2.1 微波功率對(duì)原花青素提取量的影響 圖2反映的是微波功率對(duì)啤酒花殘?jiān)性ㄇ嗨靥崛×康挠绊?從圖2中可以看出,微波功率在400～600 W之間時(shí),隨著功率的增加,酒花殘?jiān)性ㄇ嗨氐奶崛×恐饾u增大,在功率為600 W時(shí),提取量最大14.22 mg/g。之后隨著功率的增大,原花青素提取量趨于平穩(wěn),當(dāng)功率增大到800 W時(shí),原花青素含量出現(xiàn)了下降的趨勢(shì),這可能是由于微波功率增大,微波產(chǎn)生的熱效應(yīng)增大,破壞了原花青素的穩(wěn)定性。
2.2.2 微波時(shí)間對(duì)原花青素提取量的影響 由圖3可知,當(dāng)微波時(shí)間在10～70 s時(shí),隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)從啤酒花殘?jiān)刑崛〉脑ㄇ嗨睾匡@著增大(P<0.05),在微波處理70 s時(shí),提取液中原花青素含量最大14.66 mg/g,之后當(dāng)時(shí)間延長(zhǎng)到90 s時(shí)原花青素含量略有下降,但差異不顯著(P>0.05)。這是由于微波對(duì)啤酒花殘?jiān)M織不斷的破壞,使的酒花殘?jiān)械脑ㄇ嗨乇会尫懦鰜?lái),故提取液中原花青素的含量逐漸增加,當(dāng)微波工作一定的時(shí)間后,原花青素的溶解量已經(jīng)達(dá)到了最大,微波持續(xù)工作引起溶液局部溫度升高,破壞了原花青素的結(jié)構(gòu),含量下降[20]。
圖3 微波時(shí)間對(duì)原花青素提取量的影響Fig.3 Effect of microwave time on the yield of procyanidins
2.2.3 乙醇濃度對(duì)原花青素提取量的影響 不同乙醇濃度對(duì)原花青素提取量的影響如圖4所示,隨著乙醇濃度的增加,啤酒花殘?jiān)性ㄇ嗨氐奶崛×砍氏壬吆笙陆档内厔?shì),當(dāng)乙醇濃度在60%時(shí),提取液中原花青素的含量最高14.59 mg/g,之后繼續(xù)增大乙醇濃度,原花青素含量反而下降,這是由于原花青素含有酚羥基,具有一定的極性[21]。在提取過(guò)程中乙醇溶液作為提取劑,隨著濃度的不同乙醇溶液的極性不同,進(jìn)而影響對(duì)原花青素的溶解性及選擇性。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇乙醇濃度為60%,在該濃度下原花青素的溶出量最大。
圖4 乙醇濃度對(duì)原花青素提取量的影響Fig.4 Effect of ethanol concentrationon the yield of procyanidins
2.2.4 料液比對(duì)原花青素提取量的影響 料液比對(duì)原花青素提取量的影響如圖5所示。隨著料液比的增加,原花青素的提取量逐漸增大,當(dāng)料液比達(dá)到1∶15 g/mL后,持續(xù)加大料液比,原花青素提取量變化不再顯著(P>0.05)。這是由于提取劑用量是提取過(guò)程中一個(gè)很好的推動(dòng)力,在提取過(guò)程中,適宜的濃度差,能夠起到很好的提取效果。一般而言,提取劑用量越大,能夠被提出來(lái)的物質(zhì)越多,啤酒花殘?jiān)刑崛≡ㄇ嗨貙?shí)際上是一個(gè)溶質(zhì)被溶劑化的過(guò)程,當(dāng)擴(kuò)散達(dá)到平衡點(diǎn)之后,如果繼續(xù)增加溶劑的量,溶質(zhì)的溶出量不會(huì)發(fā)生太大的變化[22]。同時(shí),如果一味的增大溶劑的用量,對(duì)后續(xù)的過(guò)濾、濃縮和溶劑的回收會(huì)造成很大的困難,提取成本增大。由圖5結(jié)果顯示,當(dāng)料液比達(dá)1∶15 g/mL以后,原花青素的提取量相差不大,但是料液比的增加會(huì)給后續(xù)處理帶來(lái)麻煩,且過(guò)高的料液比造成了溶劑的極大浪費(fèi),因而選擇料液比為1∶15 g/mL較為合適。
圖5 料液比對(duì)原花青素提取量的影響Fig.5 Effect of material/liquid ratioon the yield of procyanidins
2.2.5 浸提溫度對(duì)原花青素提取量的影響 當(dāng)浸提溫度在25～55 ℃的范圍時(shí),隨著浸提溫度的升高,啤酒花殘?jiān)性ㄇ嗨乇惶岢龅牧吭酱?當(dāng)浸提溫度55 ℃時(shí),原花青素提取量達(dá)到最大12.48 mg/g,之后隨溫度的升高,原花青素的提取量顯著下降(P<0.05)(圖6)。這是由于溫度的升高增大了溶劑分子的布朗運(yùn)動(dòng),使得溶劑擴(kuò)散速度增大,從而更多的原花青素被帶出來(lái),溫度55 ℃時(shí),原花青素的溶出達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡,提取量最大,繼續(xù)升高浸提溫度,高溫使得原花青素遭到破壞,溫度越高破壞越嚴(yán)重[23],該研究結(jié)果與鄭洪亮從紅皮云杉中提取原花青素的結(jié)果一致[24]。因此,在后續(xù)的提取過(guò)程中選取55 ℃為浸提溫度。
表4 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 4 Analysis of variance of Plackett-Burman test
圖6 浸提溫度對(duì)原花青素提取量的影響Fig.6 Effect of extraction temperatureon the yield of procyanidins
2.2.6 浸提時(shí)間對(duì)原花青素提取量的影響 如圖7所示,在浸提時(shí)間0.5～1.0 h時(shí),浸提時(shí)間對(duì)啤酒花殘?jiān)性ㄇ嗨氐奶崛∮绊戯@著(P<0.05),當(dāng)浸提時(shí)間超過(guò)1.5 h時(shí)原花青素含量變化不再顯著(P>0.05),這可能是由于浸提時(shí)間較短,部分與蛋白質(zhì)和纖維素結(jié)合的原花青素類(lèi)物質(zhì)來(lái)不及溶出[25],但是浸提時(shí)間過(guò)長(zhǎng),原花青素類(lèi)物質(zhì)穩(wěn)定性較差,容易發(fā)生氧化聚合等反應(yīng),同時(shí),啤酒花殘?jiān)械脑ㄇ嗨亟^大部分已經(jīng)溶出。繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間只會(huì)增加提取成本,同時(shí)使得原花青素發(fā)生氧化反應(yīng)而分解。故認(rèn)為浸提時(shí)間為1.0 h較好。
圖7 浸提時(shí)間對(duì)原花青素提取量的影響Fig.7 Effect of extraction time on the yield of procyanidins
2.3 Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果
通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響啤酒花殘?jiān)刑崛≡ㄇ嗨氐囊蛩剡M(jìn)行顯著性分析,Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3,試驗(yàn)結(jié)果方差分析見(jiàn)表4。
表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Experimental design and resultsof Plackett-Burman test
由表4 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果方差分析可知,試驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆O顯著(P<0.01)。同時(shí)結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)及Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果可知,微波功率(A)、微波時(shí)間(B)、乙醇濃度(C)和浸提溫度(E)四個(gè)因素對(duì)啤酒花殘?jiān)性ㄇ嗨氐奶崛∮绊戯@著(P<0.05),所以選擇微波功率、微波時(shí)間、乙醇濃度和浸提溫度進(jìn)行響應(yīng)面的優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)。料液比(D)和浸提時(shí)間(F)兩個(gè)因素對(duì)原花青素提取量影響不顯著(P>0.05),所以在后續(xù)試驗(yàn)中將其固定為1∶15 g/mL和1.0 h。
表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Experimental design and results of Box-Behnken test
表6 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 6 Analysis of variance of Box-Behnken test
2.4 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果
2.4.1 原花青素得率試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 利用Design-Expert 8.0對(duì)表5中的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和回歸分析,對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合。以微波功率(A)、微波時(shí)間(B)乙醇濃度(C)和浸提時(shí)間(D)為自變量,擬合得到回歸方程:
原花青素含量(mg/g)=14.38+0.25A+0.59B+0.28C+0.15D+0.36AB-0.065AC-0.070AD-0.66BC-0.23BD+0.085CD-0.50A2-1.13B2-0.70C2-1.21D2。
圖8 交互作用對(duì)原花青素含量影響的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface of the effect of interaction terms on the yield of procyanidins
2.4.2 響應(yīng)面交互作用分析 響應(yīng)面3D曲面圖反映的是兩兩因素之間對(duì)響應(yīng)值的影響作用,其中3D曲面圖越陡峭,說(shuō)明兩因素之間交互作用越明顯。從圖8可以看出微波時(shí)間和乙醇濃度、微波功率和微波時(shí)間、微波時(shí)間和浸提溫度之間交互作用顯著(P<0.05),其余兩兩因素之間交互作用不顯著(P>0.05)。該結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。
2.4.3 最優(yōu)提取工藝參數(shù)及驗(yàn)證 通過(guò)利用Design-Expert 8.0設(shè)計(jì)分析得到的超聲-微波協(xié)同提取原花青素最佳工藝為微波功率535.70 W、微波時(shí)間76.07 s、乙醇濃度60.43%、浸提溫度55.35 ℃,預(yù)測(cè)原花青素含量為14.53 mg/g?？紤]到實(shí)際操作,驗(yàn)證試驗(yàn)取超聲波功率50 W、超聲-微波處理溫度55 ℃、微波功率540 W、微波時(shí)間76 s、乙醇濃度60%、浸提溫度55 ℃、浸提時(shí)間1.0 h、料液比1∶15 g/mL的條件下進(jìn)行。在此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn),得到的啤酒花殘?jiān)性ㄇ嗨睾繛?4.68±0.33 mg/g,與預(yù)測(cè)值相差1.03%,說(shuō)明模型有效。這一研究與李玉妹[26]研究的利用有機(jī)溶劑提取不同種類(lèi)啤酒花中原花青素含量有所差異,這是由于啤酒花經(jīng)過(guò)超臨界CO2提取酒花浸膏后部分原花青素也被帶走,導(dǎo)致了酒花殘?jiān)性ㄇ嗨睾科?同時(shí)在原花青素的測(cè)定方法,本研究與李玉妹[26]的研究也有所不同。
2.5 啤酒花殘?jiān)暡?、微波及超?微波協(xié)同提取原花青素的比較
通過(guò)對(duì)超聲波輔助提取、微波輔助提取及超聲-微波協(xié)同提取的結(jié)果比較發(fā)現(xiàn),超聲-微波協(xié)同提取原花青素含量顯著(P<0.05)高于單一輔助提取法提取的原花青素含量。同時(shí)還可以看出微波輔助提取效果優(yōu)于超聲波輔助提取,且差異顯著(P<0.05),這可能是由于在該研究中所用的超聲波功率較低,使得超聲波沒(méi)有起到很好的輔助效果,原花青素沒(méi)有完全溶出,提取出的含量較低。從三種輔助提取方法的結(jié)果比較可以看出,超聲-微波協(xié)同提取能夠起到很好的提取效果,該輔助提取法具有一定的推廣應(yīng)用價(jià)值。
表7 不同輔助提取方法提取原花青素的比較Table 7 Comparison of procyanidins extractedby different extraction methods
3 結(jié)論
通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)及Plackett-Burman試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),利用超聲-微波協(xié)同輔助提取原花青素時(shí),當(dāng)料液比和浸提時(shí)間達(dá)到一定的大小后,其對(duì)原花青素含量的影響差異不再顯著,但在萃取過(guò)程中原花青素的含量隨著微波功率、微波時(shí)間、乙醇濃度、浸提溫度的增大呈先增大后降低的趨勢(shì)。因此,在此基礎(chǔ)上利用Design-Expert 8.0中的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)一步對(duì)超聲-微波協(xié)同提取原花青素的工藝進(jìn)行研究,得到了超聲-微波協(xié)同儀輔助提取原花青素的最佳工藝:超聲波功率50 W、超聲-微波處理溫度55 ℃、微波功率540 W、微波時(shí)間76 s、乙醇濃度60%、浸提溫度55 ℃、浸提時(shí)間1.0 h、料液比1∶15 g/mL,在此條件下,原花青素的提取量可達(dá)到14.68 mg/g。且顯著高于單另一種超聲波提取或微波提取(P<0.05)。該研究可以為啤酒花殘?jiān)刑崛≡ㄇ嗨氐难芯刻峁┮欢ǖ睦碚搮⒖肌?/p>
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