劉彬果 葉盛英

解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八三醫(yī)院，天津 300142

排石顆粒為第九八三醫(yī)院多年的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由金錢草、海金砂、車前草等9味藥材組成的復(fù)方制劑，方中金錢草甘咸微寒，清熱解毒，祛濕熱，退黃疸，利膽排石，為君藥。石韋、海金沙利水通淋，排石；車前草利水并能清下焦?jié)駸?；均為治療淋病的常用藥，為臣藥，其有效成分為槲皮素和山奈素。白茅根涼血止血，清熱利尿；川楝子苦寒性降，行氣止痛；厚樸味辛行散，行氣燥濕；枳殼行氣寬中，化痰除痞，以上四味共為佐藥[1-2]。甘草調(diào)和諸藥，以為佐使。其現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)只有中藥定性鑒別的方法，沒有主要藥味的含量測定方法，為了更好的控制排石顆粒的質(zhì)量，采用高效液相色譜(HPLC)法以槲皮素和山奈素作為指標(biāo)成分進(jìn)行含量測定，經(jīng)方法學(xué)考察，認(rèn)為本法簡便，準(zhǔn)確，無干擾，可用于排石顆粒制劑的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀，OpenLAB CDS色譜工作站，ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；槲皮素對照品(含量:99.6%,批號(hào)：120821-201212);山奈素對照品(含量: 99.8%,批號(hào)：120821-201212)購自中國食品藥品生物制品檢定所；水為超純水(自制)，甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。排石顆粒(14430137,15260137,15040115,第九八三醫(yī)院制劑室)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；甲醇-0.4%磷酸(55∶45)為流動(dòng)相；檢測波長為360 nm，進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 對照品溶液的制備 對照品溶液的制備 取槲皮素對照品、山奈素對照品各適量，精密稱定，加80%甲醇溶解，定容，搖勻，制成每1 mL含槲皮素50 μg、山奈素30 μg的混溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取排石顆粒(15040115)約7 g，研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 80%甲醇，稱定重量，超聲處理60 min(功率250 W，頻率40 kHz)，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。精密量取續(xù)濾液25 mL，置50 mL量瓶中，加入鹽酸(10%)5 mL，置90 ℃水浴中，水解1 h，取出，迅速冷卻，用80%甲醇定容，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 空白溶液的制備 按處方比例及工藝制備不含金錢草的陰性對照樣品，按2.1項(xiàng)下制備方法得空白溶液。

2.5 專屬性試驗(yàn) 依據(jù)2.1項(xiàng)下色譜條件，分別精密吸取供試品溶液、對照品溶液及空白溶液各10 μL，測定。結(jié)果表明，在與對照品溶液色譜圖相應(yīng)保留時(shí)間處，供試品溶液有槲皮素和山奈素特征吸收峰，而陰性對照液無相應(yīng)吸收峰，表明專屬性良好。見圖1。

2.6 線性關(guān)系的考察 分別精密稱取山奈素10.2 mg(純度：93.2%)、槲皮素對照品15.8 mg(純度：98.0%)，置50 mL容量瓶中， 80%甲醇溶解,定容至刻度，即得對照品儲(chǔ)備液。精密吸取對照品儲(chǔ)備液2 mL，置25 mL容量瓶中，制備對照品溶液(槲皮素：24.77 μg/mL；山奈素：15.21 μg/mL)。分別精密吸取1 μL、2 μL、4 μL、5 μL、6 μL、8 μL、10 μL、20 μL，依次進(jìn)樣，測定峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，

得：槲皮素:Y=4263.5X-5.4208，r=0.999 9(n=8);

山奈素：Y=5942.8X-2.8272，r=0.999 9(n=8)。

結(jié)果表明，槲皮素在0.025～0.495 μg的范圍內(nèi)，山奈素在0.015～0.304 μg的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一對照品溶液，按2.1項(xiàng)下各色譜條件分別測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，槲皮素和山奈素的RSD值分別為1.1% 和0.6%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 同一供試品溶液(15040115)，分別于0、2、4、6、8、9 h和10 h測定，得槲皮素和山奈素峰面積RSD分別為2.1%和1.5%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 同一批樣品(15040115)6份，按2.3項(xiàng)下方法制備，依法測定。記錄峰面積，計(jì)算槲皮素和山奈素的含量的RSD分別為1.7%和1.8%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品(15040115)6份，每份約4.0g，精密稱定，精密加入槲皮素(0.196 mg/mL)和山奈素(0.041 mg/mL)對照品溶液各2 mL，按2.3項(xiàng)下方法制備，按2.1項(xiàng)下條件測定，記錄峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果槲皮素的加樣回收率為97.1%，RSD為2.5%(n=6)；山奈素的加樣回收率為100.2%，RSD為1.2%(n=6)。見表1、2。

表1 槲皮素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

表2 山奈素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.11 樣品測定 取樣品3批(14430137,15260137,15040115)，按2.2項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，照2.1項(xiàng)下色譜條件測定，外標(biāo)法定量。計(jì)算三個(gè)批次的樣品中槲皮素和山奈素的含量，結(jié)果見表3。

表3 三批樣品含量測定結(jié)果 (n=2)

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的選擇 排石顆粒中金錢草為君藥,主要功效成分為黃酮類[1-3],可作為中成藥的質(zhì)量控制指標(biāo),在本研究中,選用黃酮類水解產(chǎn)物槲皮素和山奈素作為指標(biāo)成分測定，以其含量作為質(zhì)量控制的考察指標(biāo)。

3.2 測定波長的選擇 參照中國藥典中金錢草的含量測定方法[4],經(jīng)光譜掃描,槲皮素和山奈素在360 nm處均有較大吸收，故選取360 nm作為檢測波長。

3.3 提取條件的選擇 在供試品的制備過程中, 采用超聲提取的方法,該方法簡單，便于操作。同時(shí)對于提取時(shí)間進(jìn)行考察，考察了超聲處理40 min、60 min、80 min，研究發(fā)現(xiàn)，60 min超聲處理樣品可達(dá)到提取完全的目的，采用超聲提取60 min的方法制備供試溶液。

黃酮類化合物在植物體內(nèi)常與糖結(jié)合成苷類或碳糖基的形式存在，為了準(zhǔn)確測定其苷元的的含量，需進(jìn)行水解去糖。參考相關(guān)文獻(xiàn)及藥典方法[5-7]，采用酸水解法，考察了糖水解時(shí)的溫度、鹽酸含量、水解時(shí)間等，采用90 ℃水浴中加熱水解1小時(shí)，甲醇與10%鹽酸體積比為5∶1時(shí)，峰面積之和達(dá)到最大。因而，確定采用超聲60 min，90 ℃水浴中加熱水解1 h制備供試品溶液。

3.4 流動(dòng)相的選擇 因黃酮類成分含有酚羥基,呈弱酸性,故選擇酸性緩沖系統(tǒng),參照藥典及相關(guān)文獻(xiàn)[8-11]報(bào)道,采用甲醇-0.4%磷酸(55：45)為流動(dòng)相；檢測波長：360 nm；流速：1.0 mL.min-1；柱溫：室溫?？蛇_(dá)到很好分離效果。

經(jīng)方法學(xué)考察，本方法簡單,結(jié)果準(zhǔn)確,重復(fù)性好,無干擾,可用于排石顆粒的質(zhì)量控制。

A：對照品溶液圖譜；B：樣品溶液圖譜；C：陰性對照溶液圖譜；1.槲皮素 2.山奈素圖1 槲皮素和山奈素HPLC圖譜