烏仁格格 高子舒 余靖冉(河套學(xué)院,內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000)
沙芥又名沙蘿卜、沙蓋,蒙名額樂(lè)森·老邦,是沙區(qū)人民喜愛(ài)的野菜之一,其根、莖、葉均可食用,風(fēng)味獨(dú)特,營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值高,有“沙漠人參”之稱[1]。此外沙芥也是天然的中藥、蒙藥,主要含有礦物質(zhì)、糖類、維生素、氨基酸、黃酮、生物堿等化學(xué)成分[2]。沙芥的莖和幼葉富含水,幼苗時(shí)的沙芥、沙芥籽含有大量油脂,可飼養(yǎng)生活在沙區(qū)的野生動(dòng)物,牛羊等畜類也喜食,可作為牛羊等動(dòng)物春冬兩季的好飼料,同時(shí)對(duì)維護(hù)沙區(qū)生態(tài)平衡也起到了不可磨滅的作用[3]。本實(shí)驗(yàn)是對(duì)巴彥淖爾市烏拉特前旗地區(qū)沙芥總黃酮的提取方法進(jìn)行對(duì)比研究,確定適于提取烏前旗沙芥總黃酮的可行性方法,為烏前旗沙芥開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。
將已清洗并自然風(fēng)干的野生沙芥全草放入粉碎機(jī)至2/3 處粉碎;再過(guò)60 目篩得試樣。樣品于2017 年8 月從內(nèi)蒙古巴彥淖爾市烏拉特前旗沙地采集得。電子分析天平(FA10048 型上海市安亭電子儀器廠)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮儀器有限公司)、數(shù)顯恒溫水域鍋(HH-2 國(guó)華電器有限公司)、紫外分光光度計(jì)(SP-1920UV 型上海光譜儀器有限公司)、循環(huán)水式多用真空泵(SHB-III 型鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)、各類玻璃儀器。蘆丁(合肥博美藥劑有限公司)為生化試劑,其他試劑為分析純。
稱取蘆丁標(biāo)樣10.00mg 加入80%乙醇溶液溶解,并定容至50mL。分別精確移取0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于25mL 容量瓶,加入1.0mL5% NaNO2溶液,搖勻靜置8min;再加入1.0mL10% Al(NO3)3溶液,搖勻靜置8min;最后加4.0mL 2mol/L NaOH 溶液,用80%乙醇溶液定容至25mL 容量瓶中,搖勻靜置15min,備用。通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在510nm 處有最大吸收峰,將上述六份溶液于510nm下測(cè)OD 值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程[4]。
精確移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液2mL,平行六份,測(cè)其吸光度,按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)定蘆丁含量[4]。
準(zhǔn)確稱取沙芥全草粉末0.5g,平行三份,分別加入適量蘆丁對(duì)照品,按2.1 中方法處理,測(cè)其OD 值,計(jì)算回收率[4]。
2.4.1 堿提酸沉法
準(zhǔn)確稱取1.000 g 沙芥全草粗粉加100mL 蒸餾水煮沸。邊攪拌邊緩慢加入石灰石水溶液將體系pH 調(diào)節(jié)至8~9,微沸20~30min,趁熱過(guò)濾。收集濾渣于250mL 錐形瓶中,重復(fù)上述操作,趁熱過(guò)濾。合并兩次濾液于250mL 錐形瓶中在60~70℃下用HCl 溶液調(diào)節(jié)pH 至5.0,靜置24h,抽濾。沉淀物連同濾紙放在燒杯中,加入30mL 80%乙醇溶液放置3h[5]。抽濾后將濾液濃縮,用80%乙醇定容至25mL 容量瓶中,得提取液。
2.4.2 乙醇熱回流法
準(zhǔn)確稱取1.000g 沙芥全草粗粉加80%的乙醇30mL,在80℃溫度條件下回流提取1h,抽濾。重復(fù)本操作3 次,合并濾液蒸餾濃縮,用80%乙醇溶液定容至25mL 容量瓶中,得提取液。
2.4.3 甲醇熱回流法
操作同乙醇熱回流法,溶劑為80%的甲醇。
2.4.4 超聲波提取法
準(zhǔn)確稱取沙芥全草粗粉1.000g 加30mL 80%的甲醇;在超聲波震蕩器中震蕩1h,抽濾[6]。濾渣重復(fù)上述步驟2 次,合并濾液,蒸餾濃縮,用80%乙醇定容至25mL 容量瓶中,得提取液。
2.4.5 熱水浸提法
準(zhǔn)確稱取沙芥全草粗粉1.000g 于250mL 錐形瓶中,加100mL蒸餾水,在95℃溫度條件下用恒溫水浴鍋保溫浸提6h,然后加熱蒸餾濃縮,用80%乙醇溶液定容至25mL 容量瓶中,得提取液[5]。
每個(gè)方法平行提取四組,分別精密移取1mL 提取液,按照2.1 方法顯色測(cè)定OD 值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮提取含量。
式中:C 為待測(cè)樣內(nèi)總黃酮濃度(mg/mL);V 為總體積(mL);m 為沙芥原料質(zhì)量(g)。
以吸光度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),在波長(zhǎng)510nm 下測(cè)定吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程為:A=10.5685C-0.0024,R 值為0.9994。
精密度測(cè)定結(jié)果如表1 所示,計(jì)算得RSD 為0.79%,說(shuō)明精密度良好、重復(fù)性良好。加樣回收率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2,計(jì)算得平均回收率為98.4%,RSD 為1.11%,說(shuō)明準(zhǔn)確度良好,方法可靠。
表1 精密度測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果
表2 加樣回收率測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果
采用甲醇熱回流法、乙醇熱回流法、堿提酸沉法、超聲波提取法、熱水浸提法等5 種方法對(duì)沙芥全草中總黃酮進(jìn)行了提取,提取效果如表3 所示。
表3 不同提取方法得沙芥全草總黃酮提取含量
由表3 中數(shù)據(jù)可知,不同提取方法提取沙芥全草總黃酮含量排序?yàn)椋簤A提酸沉法>乙醇熱回流法>超聲波提取法>甲醇熱回流法>熱水浸提法;且RSD 值表明重復(fù)性均良好。
五種方法中堿提酸沉法提取含量最高,能有效的提取沙芥中總黃酮,但其實(shí)驗(yàn)步驟較為復(fù)雜,試劑藥品消耗量大,實(shí)驗(yàn)條件苛刻且用到的溶劑具有強(qiáng)烈腐蝕性,實(shí)驗(yàn)重復(fù)偏差相對(duì)較高,因此不適宜作為最佳提取方法。熱水浸提法具有操作簡(jiǎn)單,溶劑易得的優(yōu)點(diǎn);但實(shí)驗(yàn)溫度要求高,平均提取含量為3.29mg/g,與堿提酸沉法比提取含量低了16.9%,且實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間長(zhǎng),一般不常用于總黃酮的提取。超聲波提取法、甲醇熱回流法和乙醇熱回流法相對(duì)于堿提酸沉法來(lái)說(shuō)操作簡(jiǎn)單,實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好;其中超聲波提取法提取時(shí)間最短,但對(duì)儀器有要求,實(shí)驗(yàn)成本高;甲醇熱回流法操作與乙醇熱回流法相同,但其提取劑甲醇有一定毒性;而乙醇熱回流法提取含量較高,且還具有實(shí)驗(yàn)原理易懂,使用后的乙醇可回收再利用等優(yōu)點(diǎn)。因此提取沙芥全草總黃酮可將乙醇熱回流法作為最佳提取方法。
結(jié)果表明:在烏拉特前旗地區(qū)沙芥總黃酮的提取方法對(duì)比實(shí)驗(yàn)中,乙醇熱回流法是最佳提取方法,平均提取含量為3.58mg/g。該方法具有操作簡(jiǎn)單,原理易懂,提取含量高,儀器簡(jiǎn)易,用時(shí)較短,溶劑乙醇無(wú)毒無(wú)害,方便回收等優(yōu)點(diǎn)。賈彥峰等[6]測(cè)定沙芥葉片總黃酮含量的研究得結(jié)果為;堿提酸沉法>超聲波提取法>乙醇(甲醇)回流提取法>熱水浸提法,其結(jié)果與本研究有較大差異,原因可能是試樣產(chǎn)地、采集時(shí)間不同,賈彥峰[6]等采用的是沙芥葉片,本研究采用沙芥全草為試樣。
通過(guò)本研究可知,巴彥淖爾市烏拉特前旗地區(qū)沙芥全草中總黃酮含量較可觀,建議在今后研究中對(duì)本地區(qū)沙芥總黃酮乙醇回流提取法作進(jìn)一步工藝優(yōu)化以提高總黃酮的提取含量;為進(jìn)一步分離、鑒定黃酮單體成分和其生物活性成分提供最優(yōu)提取方案??傮w來(lái)看,沙芥是一種值得去開(kāi)發(fā)利用的藥用和食用植物資源。