李燦東，王志新，鄭 偉，趙海紅，張振宇，徐杰飛，郭美玲，郭 泰

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院佳木斯分院/國(guó)家大豆區(qū)域技術(shù)創(chuàng)新中心/ 國(guó)家大豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系佳木斯綜合試驗(yàn)站，黑龍江 佳木斯 154007)

大豆是重要的油料作物之一，產(chǎn)品主要用于榨油。大豆油在眾多植物油中占有重要地位，含有豐富全面的油脂營(yíng)養(yǎng)成分[1]。全世界大豆油的生產(chǎn)量?jī)H次于棕櫚油，位居所有油脂產(chǎn)品第二位，消費(fèi)量占食用油總量的51.7%，且保持逐年穩(wěn)定增長(zhǎng)趨勢(shì)[2]。預(yù)計(jì)到2022年全球大豆油消費(fèi)量將突破7 000萬(wàn)t。中國(guó)是大豆油生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，2017年大豆油消費(fèi)量為1 655萬(wàn)t，占全球大豆油總消費(fèi)量的30.35%，中國(guó)大豆油主要來(lái)源于國(guó)內(nèi)壓榨和直接進(jìn)口，2018年全國(guó)大豆壓榨總量8 860.2萬(wàn)t，其中進(jìn)口大豆8 803.0萬(wàn)t，國(guó)產(chǎn)大豆57.2萬(wàn)t，因此國(guó)產(chǎn)大豆壓榨量比重極低[3]。原因主要有兩方面，一是國(guó)產(chǎn)大豆種植面積小、油用大豆生產(chǎn)總量不足，供需矛盾突出；二是國(guó)產(chǎn)大豆品種出油率低，一般在16%～17%之間(濕基)，較進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆出油率(19%～20%)低2～3個(gè)百分點(diǎn)。因此，選育及種植高油大豆品種是在有限大豆產(chǎn)量基礎(chǔ)上提高產(chǎn)油率的有效途徑[4]。

我國(guó)高油大豆品種及種植主要集中在北方，生產(chǎn)上油分含量突出、豐產(chǎn)性及適應(yīng)性好的品種較少。合農(nóng)75是黑龍江省高油主栽大豆品種，該品種是國(guó)家及黑龍江省兩級(jí)審定大豆品種，經(jīng)農(nóng)業(yè)部谷物及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心檢測(cè)分析，該品種國(guó)審油分平均含量23.40%，省審油分平均含量22.92%。油分含量較農(nóng)業(yè)部規(guī)定的高油大豆(21.5%)標(biāo)準(zhǔn)高1.42～1.90個(gè)百分點(diǎn)，較進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆高2.0～2.5個(gè)百分點(diǎn)，較國(guó)產(chǎn)普通大豆高3～4個(gè)百分點(diǎn)[5]。此外，該品種省級(jí)生產(chǎn)試驗(yàn)平均產(chǎn)量200.0 kg，較國(guó)內(nèi)同類(lèi)品種合豐25、合豐35、合豐50、合豐55、墾豐16、黑農(nóng)48、綏農(nóng)26等產(chǎn)量提高21.1～62.0 kg，較世界大豆平均產(chǎn)量提高35.3 kg；抗生產(chǎn)上3種主要病害(灰斑病、疫霉病和病毒病SMVⅠ號(hào)株系)，抗病性突出[6]。該品種屬于典型的高油、高產(chǎn)、多抗大豆品種，品種選育對(duì)我國(guó)油用大豆生產(chǎn)及大豆油生產(chǎn)加工具有重要意義[7]。合農(nóng)75采用傳統(tǒng)雜交與分子設(shè)計(jì)育種相結(jié)合的方法，在親本綜合性狀聚合與油分含量特性精準(zhǔn)選擇的基礎(chǔ)上，既遺傳了雙親的優(yōu)良綜合性狀，又超親了油分含量。充分利用了母本合豐50油分含量突出的優(yōu)勢(shì)及父本抗線4號(hào)抗病性突出的優(yōu)異特性，創(chuàng)造出油分含量超過(guò)雙親的優(yōu)良品種[8-10]。

近年來(lái)，關(guān)于大豆油分含量分子標(biāo)記及基因定位研究報(bào)道逐漸增多，研究發(fā)現(xiàn)了大量的油分含量分子標(biāo)記及QTL位點(diǎn)。姚丹等[11]利用F2群體對(duì)大豆油分含量進(jìn)行QTL分析，共檢測(cè)到2個(gè)主效QTLs和2個(gè)微效QTLs；王囡囡[12]利用重組自交系群體確定6個(gè)QTL位點(diǎn)位于3條連鎖群上；寧海龍等[13]利用大豆四向重組自交系群體對(duì)油分含量進(jìn)行QTL分析，共定位了39個(gè)油分含量QTLs，對(duì)表型效應(yīng)的貢獻(xiàn)率為7.3%～25.68%。本研究選用的油分含量SSR分子標(biāo)記來(lái)自何月鵬[14]、于志遠(yuǎn)等[15]、葛振宇[16]、任君等[17]、姜振峰[18]、Leite[19]等關(guān)于大豆油分含量QTL定位研究，這些SSR分子標(biāo)記穩(wěn)定性好、重復(fù)率高、遺傳貢獻(xiàn)率較大，是重要的大豆油分含量分子標(biāo)記。雖然大量油分含量分子標(biāo)記被相繼報(bào)道，但目前仍然缺乏功能型分子標(biāo)記，隨著功能基因組學(xué)的發(fā)展，期待大豆油分含量功能型分子標(biāo)記被挖掘出來(lái)，實(shí)現(xiàn)分子輔助選擇及設(shè)計(jì)育種。本研究對(duì)已報(bào)道的高油分子標(biāo)記，結(jié)合高油大豆品種合農(nóng)75的分子標(biāo)記遺傳解析，分離出高油基礎(chǔ)性分子標(biāo)記、高油分子標(biāo)記及高油潛力分子標(biāo)記，為高油大豆品種或材料選育及資源鑒定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大豆品種合農(nóng)75及其2個(gè)親本(母本合豐50和父本抗線4號(hào))，均由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院佳木斯分院大豆育種研究所提供。大豆油分含量相關(guān)SSR分子標(biāo)記39個(gè)詳見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)方法

將合農(nóng)75及其2個(gè)親本分別種植于盆栽中，每品種3盆，每盆15株。待植株長(zhǎng)到1～2片三出復(fù)葉時(shí)取葉片，每品種每盆取2～3片嫩綠新葉，液氮速凍置于-80 ℃低溫冰箱中，以備提取品種DNA，DNA提取采用CTAB法[20](表2)。以合農(nóng)75及其2個(gè)親本品種的DNA為樣本，采用毛細(xì)管電泳方法檢測(cè)39個(gè)油分含量SSR分子標(biāo)記的PCR片段長(zhǎng)度。檢測(cè)由上海生工進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及計(jì)算，利用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析。

表1 大豆油分含量SSR分子標(biāo)記及文獻(xiàn)

表2 CTAB法提取DNA方法及步驟

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆油分含量SSR分子標(biāo)記PCR片段長(zhǎng)度分析

對(duì)大豆39個(gè)油分含量SSR分子標(biāo)記在合農(nóng)75及其2個(gè)親本中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用毛細(xì)管電泳技術(shù)檢測(cè)PCR片段長(zhǎng)度情況。結(jié)果表明，在39個(gè)SSR分子標(biāo)記中，合農(nóng)75擴(kuò)增片段長(zhǎng)度與母本合豐50一致的分子標(biāo)記有15個(gè)，其中有5個(gè)SSR標(biāo)記在父本抗線4號(hào)中無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，其余10個(gè)SSR標(biāo)記在抗線4號(hào)中有擴(kuò)增產(chǎn)物，Satt 468和Satt 192兩個(gè)標(biāo)記在抗線4號(hào)中PCR片段長(zhǎng)度較低，在合豐50和合農(nóng)75中PCR片段長(zhǎng)度較高，片段長(zhǎng)度差異達(dá)到顯著水平，Satt 179、Satt 510、Sat_194、Satt 353、Satt 358、Satt 364、Satt 396和Satt 442等10個(gè)分子標(biāo)記在抗線4號(hào)中PCR片段長(zhǎng)度較高，在合豐50和合農(nóng)75中PCR片段長(zhǎng)度較低，片段長(zhǎng)度差異達(dá)到顯著水平；合農(nóng)75擴(kuò)增片段長(zhǎng)度與父本抗線4號(hào)一致的分子標(biāo)記有4個(gè)，且這些標(biāo)記在合豐50中無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物；有18個(gè)油分含量SSR分子標(biāo)記在合農(nóng)75及其2個(gè)親本中具有一致的PCR片段長(zhǎng)度，有2個(gè)SSR分子標(biāo)記僅在合豐50和抗線4號(hào)中具有PCR片段長(zhǎng)度，在合農(nóng)75中無(wú)片段長(zhǎng)度(表3)。

2.2 油分含量SSR分子標(biāo)記遺傳分析

如圖1所示，有15個(gè)油分含量SSR分子標(biāo)記在合農(nóng)75和合豐50間具有一致的PCR片段長(zhǎng)度，表明這些標(biāo)記是合農(nóng)75和母本合豐50共同存在的，是合農(nóng)75遺傳于母本的油分含量分子標(biāo)記，遺傳貢獻(xiàn)率為38.46%；有4個(gè)油分含量SSR分子標(biāo)記在合農(nóng)75和抗線4號(hào)間具有一致的PCR片段長(zhǎng)度，表明這些標(biāo)記是合農(nóng)75和父本抗線4號(hào)共同存在的，是合農(nóng)75遺傳于父本的油分含量分子標(biāo)記，遺傳貢獻(xiàn)率為10.26%；有18個(gè)SSR分子標(biāo)記在合農(nóng)75及其親本間均具有一致的PCR片段長(zhǎng)度，表明這些標(biāo)記是合農(nóng)75共同遺傳于雙親的油分含量分子標(biāo)記，遺傳貢獻(xiàn)率為46.15%；另有2個(gè)分子標(biāo)記僅在2個(gè)親本中具有PCR片段長(zhǎng)度，在合農(nóng)75中無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，比率為5.13%。因此，在本研究39個(gè)油分含量SSR分子標(biāo)記中，合農(nóng)75遺傳于母本合豐50的標(biāo)記數(shù)量為33個(gè)，遺傳貢獻(xiàn)率為84.62%；合農(nóng)75遺傳于父本抗線4號(hào)的標(biāo)記數(shù)量為22個(gè)，遺傳貢獻(xiàn)率為56.41%；合農(nóng)75共同遺傳于雙親標(biāo)記數(shù)量為18個(gè)，遺傳貢獻(xiàn)率為46.15%(表4)。

表3 油分含量SSR分子標(biāo)記在合農(nóng)75及親本中PCR片段長(zhǎng)度及遺傳情況

圖1 合農(nóng)75及親本間油分含量SSR分子 標(biāo)記一致性分析

表4 油分含量SSR分子標(biāo)記在合農(nóng)75及親本中的累計(jì)遺傳貢獻(xiàn)率

3 討 論

研究結(jié)果表明，同時(shí)遺傳自2個(gè)親本的高油SSR分子標(biāo)記有18個(gè)，這些標(biāo)記在親本和子代中同時(shí)存在，屬于油分含量基礎(chǔ)性分子標(biāo)記。品種或材料含有這些標(biāo)記不代表油分含量一定高，但油分含量高的品種或材料普遍含有這些基礎(chǔ)性標(biāo)記，含有這些分子標(biāo)記是具備高油特性必要條件。研究結(jié)果中，合農(nóng)75僅遺傳于母本合豐50的SSR分子標(biāo)記有15個(gè)，這些分子標(biāo)記在父本抗線4號(hào)中不存在，是合農(nóng)75定向遺傳于母本的高油分子標(biāo)記，由于合豐50具有高油特性(22.57%)，因此合農(nóng)75遺傳于母本的高油分子標(biāo)記屬于高油分子標(biāo)記，是大豆品種或材料高油特性應(yīng)具備的分子標(biāo)記。另外，合農(nóng)75僅遺傳于父本抗線4號(hào)的SSR分子標(biāo)記有4個(gè)，這些分子標(biāo)記在母本中不存在，是合農(nóng)75定向遺傳于父本的分子標(biāo)記，雖然父本油分含量并不突出，但這些標(biāo)記與母本合豐50高油標(biāo)記具有基因累加與聚合的作用，從而使得子代合農(nóng)75油分含量超親(23.40%)。因此，雙親油分含量分子標(biāo)記及基因的聚合是合農(nóng)75油分含量突出的主要原因。

本研究對(duì)高油大豆品種或材料創(chuàng)新及親本選擇具有一定的理論指導(dǎo)意義。在配制雜交組合方面，母本應(yīng)具備高油特性及含有高油分子標(biāo)記，可以利用本研究獲得的15個(gè)高油分子標(biāo)記進(jìn)行篩選鑒定，保證親本具有高油特性，父本不要求油分含量突出，但要包含具有高油潛力的分子標(biāo)記，利用本研究獲得的4個(gè)高油標(biāo)記進(jìn)行篩選鑒定，與母本高油分子標(biāo)記產(chǎn)生基因累加與聚合效應(yīng)，從而使后代群體分離出具有高油特性的材料，利用分子標(biāo)記輔助選擇對(duì)后代材料進(jìn)行篩選及鑒定，在低世代對(duì)群體龐大的材料進(jìn)行提前鑒定，規(guī)避了常規(guī)選擇的盲目性及漏掉高油優(yōu)異材料，使得選擇更有針對(duì)性，大大提高選擇效率及選擇準(zhǔn)確性，實(shí)現(xiàn)了分子標(biāo)記選擇育種。在高油材料分子鑒定中，本研究結(jié)果具有一定理論依據(jù)。利用15個(gè)高油SSR分子標(biāo)記可實(shí)現(xiàn)資源材料高油特性鑒定，利用4個(gè)高油潛力SSR分子標(biāo)記可實(shí)現(xiàn)對(duì)具有高油潛力資源材料的篩選及鑒定。本研究針對(duì)已報(bào)道的高油分子標(biāo)記，結(jié)合高油大豆品種合農(nóng)75的分子標(biāo)記遺傳解析，分離出高油基礎(chǔ)性分子標(biāo)記、高油分子標(biāo)記及高油潛力分子標(biāo)記，為高油大豆品種或材料選育及資源鑒定提供理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

有15個(gè)SSR標(biāo)記在合農(nóng)75與母本合豐50間具有一致PCR片段長(zhǎng)度，遺傳率為38.46%，這些標(biāo)記屬于高油分子標(biāo)記；有4個(gè)SSR標(biāo)記在合農(nóng)75與父本抗線4號(hào)間具有一致PCR片段長(zhǎng)度，遺傳率為10.26%，這些標(biāo)記屬于高油潛力分子標(biāo)記；有18個(gè)SSR標(biāo)記在子代與雙親間共同存在，遺傳率為46.15%，這些標(biāo)記屬于高油基礎(chǔ)性分子標(biāo)記。合農(nóng)75遺傳于母本合豐50的標(biāo)記數(shù)量為33個(gè)，遺傳貢獻(xiàn)率為84.62%；合農(nóng)75遺傳于父本抗線4號(hào)的標(biāo)記數(shù)量為22個(gè)，遺傳貢獻(xiàn)率為56.41%；合農(nóng)75共同遺傳于雙親標(biāo)記數(shù)量為18個(gè)，遺傳貢獻(xiàn)率為46.15%。