景晨茜，馬 玲

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷030801）

硒是人體所必需的微量元素之一，在自然環(huán)境中以無(wú)機(jī)硒和有機(jī)硒的形式存在，其中，無(wú)機(jī)硒主要為單質(zhì)硒、硒化物、亞硒酸鹽等，有機(jī)硒主要為硒代半胱氨酸、硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸、二甲基硒等[1]。大多數(shù)無(wú)機(jī)硒的毒性比有機(jī)硒大，難以被機(jī)體所吸收利用，而有機(jī)硒及單質(zhì)硒的吸收利用率較高[2-3]。硒作為生物體內(nèi)酶的活性組分，參與清除自由基和過(guò)氧化物，具有抗氧化性；還可增強(qiáng)機(jī)體免疫力，能拮抗多種有毒重金屬元素和一些物質(zhì)[4]。缺硒易患克山病和大骨節(jié)?。坏珯C(jī)體攝入過(guò)量的硒則會(huì)引起硒中毒，出現(xiàn)脫發(fā)、脫甲等。

中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)推薦人體對(duì)硒的攝入量為55～400 μg/d，但在普通食物中的硒含量較低，無(wú)法滿足人體所需，可通過(guò)硒的生物轉(zhuǎn)化得到利用率較高的含硒物質(zhì)。硒轉(zhuǎn)化載體中的微生物具有繁殖快、適應(yīng)性強(qiáng)、代謝能力強(qiáng)等特點(diǎn)。有研究表明，乳酸菌可通過(guò)自身的理化作用，對(duì)絕大多數(shù)微量元素進(jìn)行富集及有機(jī)態(tài)的轉(zhuǎn)化。1995 年，CALOMME 等[5]首次發(fā)現(xiàn)，乳酸菌對(duì)無(wú)機(jī)硒具有一定的富集作用。

本試驗(yàn)通過(guò)研究一種嗜熱鏈球菌在富硒24 h后的酸度、菌落數(shù)、黏度的變化及抗氧化活性，旨在為進(jìn)一步研發(fā)新的補(bǔ)硒制劑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與培養(yǎng)基 供試菌種為唾液鏈球菌嗜熱亞種（Strptococcus salivarius）CH 9，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)畜產(chǎn)品加工實(shí)驗(yàn)室提供；供試脫脂乳培養(yǎng)基為10%脫脂乳，115 ℃滅菌15 min。

1.1.2 試劑 亞硒酸鈉，成都麥卡?；び邢薰荆涣姿岫溻?，天津申泰化學(xué)試劑有限公司；過(guò)硫酸鉀、ABTS、DPPH，北京索萊寶科技有限公司；所有分析用有機(jī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；脫脂乳粉，恒天然集團(tuán)安佳有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 FE28-Standard pH 計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；NDJ-1 指針式黏度計(jì)，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；7200 型可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化及富硒條件的確定

1.2.1.1 菌種的活化 實(shí)驗(yàn)室保存的嗜熱鏈球菌選用脫脂乳培養(yǎng)基，以接菌量3%、42 ℃培養(yǎng)24 h進(jìn)行活化，連續(xù)活化3 代。

1.2.1.2 亞硒酸鈉濃度的確定 將已滅菌的脫脂乳培養(yǎng)基加入已滅菌的亞硒酸鈉溶液，配制培養(yǎng)基中的亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為 0、1、2、3、4、5、6、7、8 μg/mL，以接菌量為3%、在42 ℃下培養(yǎng)24 h，觀察培養(yǎng)基的顏色。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為5～8 μg/mL 的培養(yǎng)基底部呈紅色，且顏色隨其質(zhì)量濃度的增大逐漸變深，表明這種嗜熱鏈球菌隨著亞硒酸鈉濃度的增加，轉(zhuǎn)化出的單質(zhì)硒逐漸增多，有機(jī)硒則逐漸減少[6]，不宜作為最適加硒質(zhì)量濃度。在適宜的硒質(zhì)量濃度下，乳酸菌的生長(zhǎng)代謝受到的影響程度較小[7]。因此，先選用前5 個(gè)培養(yǎng)基紅色不明顯的梯度（0、1、2、3、4 μg/mL，其中，0 為空白組）作為研究對(duì)象，初步研究乳酸菌富硒后的理化性質(zhì)及抗氧化活性的變化。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 滴定酸度測(cè)定 其按照GB 5009.239—2016標(biāo)準(zhǔn)[8]進(jìn)行，采用酚酞指示劑法測(cè)定滴定酸度，單位以°T 表示（為每 100 mL 樣品消耗 0.1 mol/L 的NaOH 溶液毫升數(shù)）。

1.3.2 pH 值測(cè)定 采用FE28-Standard pH 計(jì)測(cè)定pH 值。

1.3.3 黏度測(cè)定 采用黏度計(jì)測(cè)定黏度（測(cè)定條件為2 號(hào)轉(zhuǎn)子，轉(zhuǎn)速為6 r/min）。

式中，η 表示黏度，K 為系數(shù)，α 為轉(zhuǎn)子的偏轉(zhuǎn)量。

1.3.4 菌落數(shù)測(cè)定 按照GB 4789.2—2016 標(biāo)準(zhǔn)[9]測(cè)定菌落數(shù)（以M17 為培養(yǎng)基）。

1.3.5 抗氧化性測(cè)定

1.3.5.1 樣品處理 將10 mL 待測(cè)樣品與90 mL蒸餾水混勻，得到待測(cè)發(fā)酵乳。

1.3.5.2 對(duì)ABTS+的清除能力 將2.45 mmol/L 過(guò)硫酸鉀溶液與7 mmol/L 的ABTS 溶液以1∶1（V∶V）混勻，避光靜置 16 h，備用，用 pH 值 6.6、10 mol/L的PBS 稀釋混勻液體，使其在734 nm 下的吸光度值為0.70±0.02。取0.5 mL 樣品稀釋液，分別與5 mL 的ABTS 稀釋液和 pH 值為 6.6、10 mol/L 的 PBS 5 mL混勻，作為樣品組（A）s和對(duì)照組（A）c，同時(shí)以0.5 mL蒸餾水與5 mL 的ABTS 稀釋液混勻作為空白組（A0）。各組振蕩 30 s、暗反應(yīng) 6 min、4 000 r/min 離心10 min，取上清液在734 nm處測(cè)定各組的吸光度值。

1.3.5.3 對(duì)DPPH·的清除能力 取3 mL 稀釋液，分別與 3 mL 蒸餾水和 3 mL 1.0×10-4mol/L 的DPPH 混勻，作為空白組（Ab）和樣品組（Ad），同時(shí)以稀釋液和 3 mL 無(wú)水乙醇混合作為對(duì)照組（An）。25 ℃避光條件反應(yīng) 30 min，4 000 r/min 離心 10 min，測(cè)定上清液在517 nm 處的吸光度值。

1.3.5.4 總還原能力的測(cè)定 取稀釋發(fā)酵乳樣品的上清液，與 pH 值 6.6、0.2 mol/L的 PBS 2 mL 和 2 mL的1%鐵氰化鉀混合，50 ℃水浴20 min，加入2 mL的10%TCA，混勻離心后取上清液，加入0.5 mL 的0.1%FeCl3暗處反應(yīng)至溶液澄清透明，測(cè)定樣品在700 nm 下的吸光度值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2019 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；采用Origin 9.0 軟件進(jìn)行制圖；采用Statistix 8.1軟件進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加不同質(zhì)量濃度亞硒酸鈉對(duì)發(fā)酵乳酸度的影響

由圖1 可知，隨著亞硒酸鈉質(zhì)量濃度的增加，發(fā)酵乳的滴定酸度呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)；當(dāng)添加亞硒酸鈉為 4 μg/mL 時(shí)，滴定酸度最小，為 93.77°T；添加1、2 μg/mL 亞硒酸鈉與空白組間差異不顯著；添加亞硒酸鈉3、4 μg/mL 與空白組間差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）。嗜熱鏈球菌產(chǎn)酸能力下降可能是由于加硒時(shí)間過(guò)早，一定程度抑制了菌體的代謝活動(dòng)。宋照軍等[10]研究發(fā)現(xiàn)，嗜熱鏈球菌在對(duì)數(shù)期菌體代謝旺盛，對(duì)硒的轉(zhuǎn)化率較高，且加硒時(shí)間越早對(duì)菌體代謝活動(dòng)抑制越強(qiáng)，選擇菌體對(duì)數(shù)期作為加硒時(shí)間段。

由圖2 可知，添加亞硒酸鈉質(zhì)量濃度越大，嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳的pH 值越高，這與滴定酸度的結(jié)果相符;發(fā)酵24 h 后，各組pH 值均低于4.2，嗜熱鏈球菌的產(chǎn)酸能力有所下降，基本停止產(chǎn)酸；當(dāng)亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為 1、2、3 μg/mL 時(shí)，與 0、4 μg/mL 亞硒酸鈉間差異均達(dá)顯著水平（P＜0.05）。添加少量亞硒酸鈉使得發(fā)酵乳的pH 值略高于未添加組，說(shuō)明亞硒酸鈉一定程度上可能影響了菌體的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)。郜洪濤等[11]研究表明，嗜熱鏈球菌在發(fā)酵初期的產(chǎn)酸能力強(qiáng)，利用脫脂乳培養(yǎng)基中的乳糖使酸度積累，這與本研究結(jié)果一致。

2.2 不同質(zhì)量濃度亞硒酸鈉對(duì)發(fā)酵乳黏度的影響

從圖3 可以看出，當(dāng)添加亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為1、2 μg/mL 時(shí)，發(fā)酵乳的黏度低于空白組，但差異不顯著；其余2 組黏度顯著大于空白組（P＜0.05）。嗜熱鏈球菌在發(fā)酵過(guò)程中黏度的變化與胞外多糖的產(chǎn)量和酪蛋白的結(jié)構(gòu)變化有關(guān)，嗜熱鏈球菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的胞外多糖會(huì)與蛋白質(zhì)形成膠體結(jié)構(gòu)，包裹乳清，進(jìn)而增加發(fā)酵乳的黏度[12]。此外，pH 值的下降會(huì)使發(fā)酵乳中酪蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性發(fā)生改變，粒子發(fā)生凝聚，分子團(tuán)變大，從而使發(fā)酵乳的黏度增大[13]。

2.3 不同質(zhì)量濃度亞硒酸鈉對(duì)發(fā)酵乳菌落數(shù)的影響

從圖4 可以看出，隨著亞硒酸鈉質(zhì)量濃度的不斷增大，發(fā)酵乳中的菌落數(shù)逐漸減少，但不同質(zhì)量濃度間差異不顯著；在發(fā)酵24 h 后，添加亞硒酸鈉的發(fā)酵乳菌落數(shù)均低于空白組，可能是由于發(fā)酵初期加硒時(shí)間過(guò)早，亞硒酸鈉的存在使菌株處于毒性環(huán)境中，同時(shí)培養(yǎng)基中亞硒酸鈉濃度的增加，使得發(fā)酵乳中無(wú)機(jī)硒的含量變高，菌株生長(zhǎng)過(guò)程減緩[14]。PALOMO-SIGUERO 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)硒質(zhì)量濃度增加到一定量時(shí)，乳酸菌的生長(zhǎng)速度會(huì)下降，當(dāng)補(bǔ)硒物質(zhì)為亞硒酸鹽時(shí)，這種現(xiàn)象會(huì)更為明顯，這與本研究結(jié)果一致。

2.4 不同質(zhì)量濃度亞硒酸鈉對(duì)發(fā)酵乳抗氧化性的影響

2.4.1 對(duì)ABTS 自由基清除率的影響 ABTS 自由基是一種水溶性陽(yáng)離子自由基，而ABTS 可被ABAP、MnO2、H2O2等試劑氧化，生成藍(lán)綠色的自由基陽(yáng)離子ABTS+，其在734 nm 處有最大吸收峰，在有供氫能力的抗氧化劑存在下，ABTS+與其反應(yīng)，會(huì)變成沒(méi)有顏色的ABTS[16]，其可廣泛應(yīng)用于食品抗氧化性的檢測(cè)。從圖5 可以看出，當(dāng)添加亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為2 μg/mL 時(shí)，發(fā)酵乳的ABTS 自由基清除率達(dá)到98.31%，高于其余各組，但差異不顯著。在發(fā)酵乳中加入低濃度的亞硒酸鈉，可提高ABTS 自由基清除率?？赡苁怯捎谑葻徭溓蚓鷮⒁徊糠謥單徕c轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒，中和或轉(zhuǎn)化了自由基物質(zhì)，提高了抗氧化性；另外，隨著亞硒酸鈉濃度的增加，發(fā)酵乳中菌落數(shù)逐漸減少，菌體結(jié)合自由基物質(zhì)能力下降，使ABTS 自由基清除率降低。

2.4.2 對(duì)DPPH 自由基清除率的影響 DPPH 自由基是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的有機(jī)自由基，其孤對(duì)電子在517 nm 波長(zhǎng)附近有強(qiáng)吸收；當(dāng)有抗氧化劑存在時(shí)，孤對(duì)電子被配對(duì)，吸收消失或減弱，溶液由紫色變?yōu)闇\黃色，可通過(guò)測(cè)定反應(yīng)后吸光度值評(píng)價(jià)物質(zhì)抗氧化活性[17]。從圖6 可以看出，當(dāng)亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為2 μg/mL 時(shí)，對(duì)DPPH 自由基清除率最大，為65.89%，但與其余各組間差異不顯著。發(fā)酵乳中菌落數(shù)的減少，使亞硒酸鈉轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒的含量降低，使得DPPH 自由基清除率降低；另外，嗜熱鏈球菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的胞外多糖也可作為供氫物質(zhì)與自由基反應(yīng)，影響DPPH 自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使清除率降低[18]。

2.4.3 對(duì)發(fā)酵乳總還原力的影響 還原力是反映物質(zhì)抗氧化活性的一種重要指標(biāo)，還原劑的存在可以提供氫電子，從而破壞自由基鏈發(fā)揮抗氧化作用[19]。同時(shí)，抗氧化活性與還原力呈正相關(guān)，還原能力大，則抗氧化活性就強(qiáng)。SHEN 等[20]研究表明，動(dòng)物芽孢桿菌01 蛋白質(zhì)的總還原力隨著亞硒酸鈉質(zhì)量濃度的增加而增大，蛋白質(zhì)中硒的含量越大，則其總還原力越大。由圖7 可知，隨著亞硒酸鈉質(zhì)量濃度的增大，發(fā)酵乳的總還原力也逐漸增大；當(dāng)亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為4 μg/mL 時(shí)，其總還原力達(dá)最大，吸光度值為0.06，但與其余各組間差異不顯著。

3 結(jié)論與討論

本研究將不同質(zhì)量濃度的亞硒酸鈉添加到脫脂乳培養(yǎng)基中，嗜熱鏈球菌發(fā)酵24 h 后，結(jié)果顯示，隨著亞硒酸鈉質(zhì)量濃度的增大，發(fā)酵乳的滴定酸度和菌落數(shù)均有所下降，pH 值則逐漸增大；當(dāng)亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為 2 μg/mL 時(shí)，黏度最低，但對(duì) ABTS 自由基清除率和DPPH 自由基清除率最大；總還原力則與亞硒酸鈉質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，即質(zhì)量濃度越大，發(fā)酵乳的總還原力越大。添加一定量的亞硒酸鈉，發(fā)酵乳的理化性質(zhì)會(huì)有所改變；但發(fā)酵乳富硒后可以為機(jī)體補(bǔ)硒，保證硒的攝入量，同時(shí)發(fā)酵乳本身也具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。有關(guān)富硒發(fā)酵乳的安全性等仍需進(jìn)一步研究。