楊慧珍

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太原030031）

甘薯（Ipomoea batatas）又稱白薯、紅薯、地瓜、番薯等，屬旋花科番薯屬植物，其塊莖富含淀粉，在世界主要糧食作物產(chǎn)量中排名第7 位；在我國則僅次于水稻、小麥和玉米，居第4 位[1]?；ㄇ嗨貙兕慄S酮化合物，作為一種很強的抗氧化劑，其具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗衰老、降血糖、增強記憶力以及抵抗病毒等醫(yī)療保健價值[2-4]。甘薯塊莖的顏色是由花青素及次生代謝產(chǎn)物的含量不同而決定的，表現(xiàn)為白色、黃色、橙色和紫色等多種顏色。在花青素代謝中，關(guān)鍵酶的基因及表達(dá)量起主導(dǎo)性作用，影響花青素積累的關(guān)鍵酶主要有F3H、DFR、ANS、GT 等[5-6]。

花青素合成酶（Anthocyanidin synthase，ANS）是生物合成花青素后期的關(guān)鍵酶，其作用是催化無色花青素脫水氧化后形成有色的花青素[7]。迄今為止，花青素合成酶基因已經(jīng)從金蕎麥（Fagopyrum dibotrys）[8]、銀杏（Ginkgo biloba）[9]、擬南芥（Arabidopsis thaliana）[10]和芥菜（Brassica juncea（L.）Czernajew）[11]等植物中克隆得到。

本研究室前期對白心甘薯（徐薯18 號）和紫心甘薯（徐紫薯3 號）移栽后90 d 不同組織樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，獲得差異表達(dá)基因，結(jié)合NCBI 中甘薯ANS 基因序列，通過PCR 擴(kuò)增獲得徐紫薯3 號的花青素合成酶基因IbANS，對其基因編碼序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析；并用real-time PCR 法分析該基因在不同甘薯品種及不同組織中的表達(dá)差異，旨在為紫心甘薯花青素形成的分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 紫心甘薯徐紫薯3 號和白心甘薯徐薯18 號于2018 年5 月種植于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院東陽試驗田，移栽后90 d，分別取塊根、莖和葉新鮮材料，裝入滅過菌的離心管中，立即加液氮，然后置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.1.2 儀器 瓊脂糖水平電泳儀（DYCP32A，北京），實時熒光定量 PCR 儀（ABI 7500Fast，美國）。

1.1.3 試劑 RNA 提取試劑Trizol Reagent、反轉(zhuǎn)錄試 劑 盒 Prime ScriptTMRT reagent Kit、pMD18-T 載體、實時熒光定量試劑盒SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ、pMD19-T，均購自中國Takara 公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購于北京天根生化科技有限公司；PCR引物合成、PCR 產(chǎn)物測序均由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 的提取和cDNA 的反轉(zhuǎn)錄 使用Trizol 法提取紫心甘薯徐紫薯3 號葉片的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime ScriptTMRT reagent Kit 說明書中的步驟合成cDNA，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 甘薯ANS 基因cDNA 的獲得 利用NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）Gene 數(shù)據(jù)庫檢索甘薯ANS，然后在前期測序的甘薯轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中BLAST搜素ANS 同源序列，利用Primer 5.0 設(shè)計特異引物（上游引物：5′-IbANS-PF AATGGTGACTACTATTA CTGTTCCG-3′下游引物：5′-IbANS-PR CAACCAT AATAATACCAAACGG-3′），以紫心甘薯葉片 cDNA為模板，PCR 產(chǎn)物跑膠檢測，割膠回收目標(biāo)條帶，連接到pMD18-T 載體上，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取單克隆培養(yǎng)，菌液PCR 篩選后送上海生工生物工程公司進(jìn)行測序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 用ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）對ANS 的一級結(jié)構(gòu)及其理化性質(zhì)進(jìn)行分析；用SOPMA 預(yù)測ANS 蛋白的二級結(jié)構(gòu)；用TMH MMServerv.2.0 預(yù)測ANS 蛋白質(zhì)跨膜方向和跨膜區(qū)；用ProtScale 對ANS 的疏水性/親水性進(jìn)行分析；用expasy 預(yù)測蛋白功能結(jié)構(gòu)域；用Sigalp 對ANS 蛋白信號肽進(jìn)行預(yù)測；用ProtComp預(yù)測蛋白的亞細(xì)胞定位；用SWISS-MODEL 對ANS蛋白三維結(jié)構(gòu)圖建模；用DNAMAN 6.0 軟件對氨基酸序列進(jìn)行同源性比對；使用MEGA 7.0 軟件用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 實時熒光定量PCR 檢測 根據(jù)獲得的甘薯ANS 基因的核酸序列，利用Primer 5.0 在線軟件設(shè)計熒光定量引物（IbANS-real-F：5′-CCTCCAAGTC CTCCGAGTTGAT-3′；IbANS-real-R：5′- TACATA AGGCCGGAGGAAGAGC-3′）。以白心甘薯和紫心甘薯塊根、莖、葉的cDNA 為模板，選取IbARF 基因（F：5′- CTTTGCCAAGAAGGAGATGC-3′，R：5′-TC TTGTCCTGACCACCAACA-3′）作為內(nèi)參基因，參照TaKaRa 公司的SYBRRPremix Ex TaqTMII 說明書，進(jìn)行實時熒光定量分析。反應(yīng)體系為：cDNA 模板1 μL，10 μmol/L PF/PR 0.4 μL，SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ5.0 μL，RNase free H2O3.2 μL。反應(yīng)程序設(shè)置為：95 ℃預(yù)變性 30 s；95 ℃變性 10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 20 s，共 40 個循環(huán)。每個樣品設(shè)有3 次重復(fù)，使用 2-ΔΔCT法計算出目的基因的表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理和作圖采用Excel 軟件，組織間基因表達(dá)量采用SPSS v23 one-way ANOVA 法進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘薯IbANS 基因克隆與電泳檢測

用設(shè)計的基因特異引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴(kuò)增出大小約1 200 bp的預(yù)期條帶（圖1）。

2.2 理化性質(zhì)分析結(jié)果

經(jīng)ProtParam 對甘薯的ANS 蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果表明，蛋白的分子質(zhì)量為40531.27ku，分子式為C1813H2855N487O542S12，總原子數(shù)為5 709，氨基酸為362 個。在該基因編碼的氨基酸中，不含Sec（U）和Pyl（O），Trp（W）、Cys（C）的含量均為1.4%，含量最高的是Glu（E），占11.0%。總的帶正電殘基（Asp＋Glu）為 56、負(fù)電殘基（Arg＋Lys）為 43。等電點pI 為5.32，不穩(wěn)定系數(shù)為43.33，屬不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。脂肪指數(shù)為84.81，親水性評估分值為-0.141，因此，該蛋白預(yù)測為親水性蛋白質(zhì)。

2.3 親/疏水性分析結(jié)果

通過ProtScale 軟件進(jìn)行疏水性/親水性預(yù)測，結(jié)果如圖2 所示，表明ANS 蛋白為親水性蛋白，與2.1 理化性質(zhì)分析結(jié)果一致。

2.4 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域及保守結(jié)構(gòu)域分析

經(jīng)TM H M M 軟件預(yù)測蛋白質(zhì)跨膜區(qū)和跨膜方向，結(jié)果顯示，沒有跨膜螺旋模型（概率均小于0.5），沒有明顯跨膜現(xiàn)象（圖3）。說明蛋白中沒有跨膜區(qū)。

利用expasy 預(yù)測蛋白功能結(jié)構(gòu)域，結(jié)果如圖4所示，該基因編碼的蛋白具有典型的Fe2+- 依賴的雙加氧酶家族（2OG-FeII_Oxy）和2-O- 酮戊二酸的保守結(jié)構(gòu)域，位于第212—311 個氨基酸。

2.5 蛋白信號肽預(yù)測

用Sigalp 4.1 對ANS 蛋白進(jìn)行信號肽及切割位點預(yù)測，采用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（NN）算法。其中，Y-score 是綜合剪切位點的分值，S-score 是信號肽的分值，C-score 是原始剪切位點的分值。由圖5 可知，蛋白質(zhì)中無信號肽存在的可能，屬于非分泌蛋白。

2.6 亞細(xì)胞定位預(yù)測

使用PSORT II 數(shù)據(jù)庫對ANS 蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果表明，甘薯ANS 蛋白質(zhì)定位在細(xì)胞質(zhì)上的比率為45%，定位在微體（過氧化物酶體）上的比率為30%，定位在線粒體基質(zhì)上的比率為10%，定位在葉綠體類囊體膜上的比率為10%。

2.7 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用SOPMA 軟件對ANS 蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測，結(jié)果如圖6 所示，甘薯ANS 蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由 α- 螺旋（占35.36%）、β- 折疊（16.85%）、無規(guī)則卷曲（41.44%）和延伸鏈（6.35%）構(gòu)成。其中，α- 螺旋和β- 折疊是維持蛋白質(zhì)分子相對穩(wěn)定性的重要結(jié)構(gòu)，而在甘薯ANS 蛋白質(zhì)中，α- 螺旋與β-折疊所占比例不高，且無規(guī)則卷曲很多，說明這種蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性較弱，這與2.1 理化性質(zhì)的分析結(jié)果一致。

2.8 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用SWISS-MODEL 對甘薯ANS 蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)建模，結(jié)果表明（圖7），ANS 蛋白三維結(jié)構(gòu)主要包括α- 螺旋和無規(guī)則卷曲，與2.6 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符。在模板結(jié)果頁面（Template Results）中，模型匹配到的最佳模板為2brt.1.A，相似度達(dá)到78.11%，可以該模板的三維結(jié)構(gòu)作為參考。

2.9 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

從NCBI 上搜索到其他物種的ANS 序列，使用DNAMAN 軟件進(jìn)行氨基酸序列比對，結(jié)果如圖8所示，紫心甘薯ANS 蛋白同其他植物的ANS 蛋白具有較高的序列相似度，用DNAMAN 軟件計算其相似度為88.15%，且各ANS 蛋白序列中均具有Fe2+- 依賴的雙加氧酶家族（2OG-FeII_Oxy）的保守結(jié)構(gòu)域，說明ANS 蛋白在不同植物間高度保守。

使用MEGA 7.0 軟件，構(gòu)建甘薯和其他植物氨基酸序列進(jìn)化樹如圖9 所示。結(jié)果表明，甘薯與三淺裂野牽牛（Ipomoea trifida）親緣關(guān)系最近，與同屬（Ipomoea）的植物聚為一簇，與陸地棉、黃牡丹、楓香的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹逐級分支，具有較多層級，說明ANS 蛋白的進(jìn)化兼具保守性和物種特異性。

2.10 實時熒光定量 PCR 檢測ANS 基因的組織表達(dá)結(jié)果

利用qRT-PCR 檢測IbANS 基因在紫心甘薯（徐紫薯3 號）和白心甘薯（徐薯18 號）的塊根、莖、葉組織中的表達(dá)水平，結(jié)果表明（圖10），IbANS 基因在紫心甘薯（徐紫薯3 號）中表達(dá)水平大小表現(xiàn)為根＞莖＞葉，在白心甘薯（徐薯18 號）中的表達(dá)水平大小表現(xiàn)為莖＞葉＞根；紫心甘薯（徐紫薯3 號）根、莖、葉中的ANS 表達(dá)水平顯著高于白心甘薯（徐薯 18 號）（P＜0.05）。

3 結(jié)論與討論

植物花青素的代謝和調(diào)控已成為當(dāng)前科學(xué)研究的熱點，ANS基因在許多植物中已被克隆，并已證明其是花青素生物合成的重要結(jié)構(gòu)基因。花青素合成酶是花色素苷合成末端的酶，影響花青素的累積，決定花色的形成及果實的著色[4]。ANS 是鐵離子和2-O- 酮戊二酸依賴的雙加氧酶家族，在保守結(jié)構(gòu)域中的鐵離子和2-O- 酮戊二酸的結(jié)合位點是細(xì)胞色素P450 家族基因中存在的活性中心結(jié)構(gòu)[8]。本研究通過序列比對結(jié)合PCR 技術(shù)從實驗室前期獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中得到紫心甘薯徐紫薯3 號的ANS的全長cDNA 序列，對編碼的蛋白質(zhì)生物信息學(xué)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，該基因編碼的蛋白具有典型的Fe2+- 依賴的雙加氧酶家族（2OG-FeII_Oxy）的保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，甘薯與三淺裂野牽牛親緣關(guān)系最近，與陸地棉、黃牡丹、楓香的同源性較低，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，基本符合植物分類學(xué)的進(jìn)化規(guī)律。

ANS基因的表達(dá)具有組織特異性，如金蕎麥（Fagopyrum dibotrys）FdANS 在花期不同組織中的表達(dá)量大小表現(xiàn)為花＞葉＞莖＞根[8]；LIU 等[12]對甘薯（Ipomoea batatas）IbANS 的組織表達(dá)分析表明，IbANS 在所有組織中均有表達(dá)，但在塊根及周皮中表達(dá)量較高。本研究利用實時熒光定量PCR 技術(shù)檢測了紫心甘薯和白心甘薯不同組織中IbANS 的表達(dá)模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ANS基因的表達(dá)具有明顯的組織特異性，在白心甘薯莖、葉中的表達(dá)量高于塊根中，而在紫心甘薯塊根中的表達(dá)量高于莖和葉。相關(guān)研究表明，ANS表達(dá)具有品種特異性，表達(dá)水平為深色＞淺色＞白色/無色品種，如水母雪蓮花（Saussurea medusa）中，ANS 在紅色系愈傷組織中的表達(dá)量高于白色系和綠色系[13]；紫甘藍(lán)（Brassica oleracea var. capitata）ANS的表達(dá)水平明顯高于青甘藍(lán)[14]。本研究中，紫心甘薯塊根、莖、葉中的ANS表達(dá)水平顯著高于白心甘薯（P＜0.05），尤其在塊根中的相對表達(dá)量是白心甘薯的37 倍，證實顏色較深的組織部位ANS基因的表達(dá)量較高，說明ANS可能參與紫心甘薯塊根中花青素的積累。

ANS 是影響花青素合成的關(guān)鍵酶，在作物育種中，通過上調(diào)ANS 基因的表達(dá)，提高花青素的含量，培育花青素含量豐富的植物品種。REDDY 等[15]在水稻育種中通過過量表達(dá)ANS基因，增加轉(zhuǎn)基因植株中花青素的含量，使水稻的種皮呈現(xiàn)紫紅色。本研究結(jié)果進(jìn)一步闡明IbANS 基因在紫心甘薯塊根中的形成及累積機(jī)制，最終為培育富含花青素的甘薯新品種奠定一定的理論基礎(chǔ)。