肖 蓉，鄧 舒，張春芬，曹秋芬

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹研究所，山西太原030031；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030031）

假單胞菌在自然界分布廣泛，其繁殖快、營養(yǎng)要求簡單、定殖能力強，是重要的生防微生物類群[1]。其中，綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis）在植物病害生物防治中應(yīng)用廣泛[2-4]。張瑩瑩[5]研究表明，綠針假單胞菌HL5-4 對番茄灰霉病有抑制作用，同時還能促進番茄的生長。何延靜等[2]在對甜椒疫霉的防治過程中，分離得到1 株綠針假單胞幽株GP72，其能強烈拮抗辣椒疫霉，對于瓜果腐霉、水稻紋枯病菌、終極腐霉等也具有良好的拮抗功能，同時，還能促進甜椒生長。楊藝煒[6]分離獲得1 株P(guān)seudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca XF10，其菌懸液與發(fā)酵上清液均能抑制煙草黑脛病菌。MOROHOSHI 等[7]研究表明，從番茄根部獲得的Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca 能夠抑制番茄根腐病。JIAO 等[8]研究表明，從小麥根際分離得到1 株P(guān)seudomonas chlororaphis subsp. auran－tiaca Pa40，其能夠抑制10 種植物性病原真菌和6 種植物性病原細菌。陳亞汶等[9]研究表明，從水稻根際分離得到能夠高產(chǎn)吩嗪-1- 甲酰胺的Pseudomonas chlororaphis HT66，其具有抑菌活性。申順善等[10]從小麥根系中篩選到1 株綠針假單胞菌HG28-5，其對辣椒疫病具有較高的抑制活性。另外，研究表明，綠針假單胞菌還具有降解芳香化合物的功能。張子間[11]首次分離到1 株可降解石油烴的綠針假單胞菌。

因為綠針假單胞菌在病害生物防治、促生及芳香化合物降解方面的突出表現(xiàn)，越來越多的綠針假單胞菌完成全基因組測序。目前，從NCBI 及Ezbiocloud 數(shù)據(jù)庫中能查詢到的綠針假單胞菌全基因組序列分別有82 條和73 條。大量基因組數(shù)據(jù)的存在為全面了解綠針假單胞菌菌株特征提供了支撐。TETTELIN 等[12]在 2005 年提出泛基因組（pangenome）的概念，指出所有菌株都攜帶的基因叫核心基因（core gene），只有某些菌株（至少 2 株）攜帶的基因叫非必需基因（dispensable gene），只有一株菌株攜帶的基因叫特有基因（strain-specific gene），核心基因、非必需基因和特有基因共同構(gòu)成了該物種的泛基因組。通過分析核心基因，即可了解該物種的基本生物學(xué)特征；而分析非必需基因和特有基因，則可以了解該物種的各種特定功能，比如與抗病性相關(guān)的次級代謝產(chǎn)物合成基因，與菌株定殖相關(guān)的編碼菌毛結(jié)構(gòu)的基因等。因此，泛基因組分析能夠幫助快速了解一個物種的基本特征，并理解菌株表型及功能多樣性。

本研究從NCBI 和Ezbiocloud 數(shù)據(jù)庫中找到46 株有詳細分類學(xué)信息且有完整基因組測序信息的綠針假單胞菌，對這46 株菌進行了泛基因組分析，確定其泛基因組特征；利用antiSMASH 軟件對46 株綠針假單胞菌的次級代謝基因簇進行預(yù)測，挖掘其可能產(chǎn)生的活性物質(zhì)，旨在對綠針假單胞菌的基因組信息進行探索，為全面描述綠針假單胞菌的特征及菌株應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

從 NCBI 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）及Ezbiocloud 數(shù)據(jù)庫[13]（https：//www.ezbiocloud.net/）中查找并下載46 株綠針假單胞菌的基因組信息，所有信息均來自2020 年5 月25 日之前的版本。

1.2 方法

1.2.1 基因組平均遺傳相似度（Average Nucleotide Identity，ANI）分析 使用在線軟件（http：//enve-omics.ce.gatech. edu/g-matrix/）中 的 ANI/AAI matrix[14]對46 株綠針假單胞菌進行基因組平均遺傳相似度分析，研究基因組之間的進化距離。

1.2.2 基因組系統(tǒng)發(fā)育分析 將表1 中菌株對應(yīng)的fasta 格式基因組數(shù)據(jù)上傳至REALPHY（http：//realphy.unibas.ch/realphy）進行全基因組比對[15]，以Pseudomonas chlororaphis subsp. chlororaphis DSM_50083 為參考基因組，采用最大似然（ML）算法，使用默認參數(shù)運行。運行結(jié)果使用FigTree v1.4.4 軟件（http：//tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/）重構(gòu)進化樹。

1.2.3 泛基因組和核心基因組分析 下載并安裝BPGA 軟件包（https：//sourceforge.net/projects/bpgatool/）[16]，從 NCBI 上獲取 46 株綠針假單胞菌的蛋白質(zhì)序列，輸入蛋白質(zhì)序列，采用默認參數(shù)設(shè)置對46個基因組進行泛基因組和核心基因組分析。

1.2.4 次級代謝產(chǎn)物合成基因簇分析 利用在線軟件antiSMASH 5.0[1（7]https：//antismash.secondarym etabolites.org）的細菌分析模塊，選擇relaxed 預(yù)測模式進行次級代謝產(chǎn)物合成基因簇分析，參數(shù)選用網(wǎng)站默認值。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠針假單胞菌基因組基本數(shù)據(jù)分析

從NCBI 和Ezbiocloud 數(shù)據(jù)庫中獲得的 46 株組裝到完整基因組水平的綠針假單胞菌基本特征如表1 所示，可以看出，46 株綠針假單胞菌共分為4 個亞種，分別為Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca、Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens、Pseudomonas chlororaphis subsp. chlororaphis和Pseudomonas chlororaphis subsp. piscium；基因組大小在6.61～7.23 Mb，GC 含量為62.0%～63.2%，預(yù)測的基因范圍是5 915～6 432 個。

2.2 基因組平均遺傳相似度（ANI）分析

ANI 分析是在全基因組水平評估物種間親緣關(guān)系的有力工具，尤其適合區(qū)分近緣物種?；谌蚪M序列的ANI 比較矩陣圖1 可以看出，除Pseudomonas chlororaphis subsp.chlororaphis TAMO-ak81 外，其余45 株參考菌株兩兩比較的ANI 值都在95%以上，而95%是大家公認的界定同種的閾值。各個亞種內(nèi)部ANI 值更是高達100%，這與已知的菌株基本信息相符。Pseudomonas chlororaphis subsp.chlororaphis TAMOak81 與Pseudomonas chlororaphis subsp. piscium 的 6 株菌（ATCC17809、ATCC17411、ZJU60、DTR133、PCL1391 和 DSM21509）ANI 值僅為94%，說明TAMOak81 與這6 株菌親緣關(guān)系稍遠。

表1 46 株綠針假單胞菌基因組信息

2.3 基因組系統(tǒng)發(fā)育分析

在REALPHY 在線網(wǎng)站上將46 株綠針假單胞菌基因組進行了比對，去除由重組引起的SNP，然后以Pseudomonas chlororaphis subsp.chlororaphis DSM_50083 為參考基因組，將剩余的SNP 選擇最大似然法，構(gòu)建進化樹（圖2），可見這46 株綠針假單胞菌由4 個相對獨立的亞群演化而成，Pseudomonas chlororaphis subsp. piscium ATCC 17809 和ATCC 17411 這2 株菌與其他同亞種菌株親緣關(guān)系較遠。

2.4 核心基因組和泛基因組分析

對46 株綠針假單胞菌進行泛基因組分析，結(jié)果表明，46 株菌共有271 910 個功能基因，共鑒定出13 296 個基因家族。從圖3 可以看出，46 株菌共有的核心基因家族有3 653 個，占綠針假單胞菌泛基因組的27.5%；非必需基因家族有5 675 個，占綠針假單胞菌泛基因組的42.7%；只有1 株菌株含有的特有基因家族有3 968 個，占綠針假單胞菌泛基因組的29.8%。Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca B25 的特有基因家族最多，有 484 個；Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca 464 的特有基因家族最少，只有1 個。

BPGA 分析計算了綠針假單胞菌基因組數(shù)目、核心基因組和泛基因組之間的關(guān)系（圖4），可以看出，泛基因組大?。╢（x））與基因組數(shù)目（x）關(guān)系的擬合方程為f（x）＝5 171.77x0.2388；核心基因個數(shù)（f1（x））與基因組數(shù)（x）關(guān)系的擬合方程為 f1（x）＝5 035.38e-0.0073x。根據(jù)擬合方程可以看出，隨著綠針假單胞菌基因組測序數(shù)量的增加泛基因組增加，而核心基因組則逐漸減少。因此，可以推測綠針假單胞菌的泛基因組目前仍然是開放的。

2.5 次級代謝產(chǎn)物合成基因簇預(yù)測

用AntiSMASH 在線工具識別和預(yù)測具有編碼次生代謝產(chǎn)物功能的基因簇，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，綠針假單胞菌合成次級代謝產(chǎn)物能力較強，每株菌均能預(yù)測到12～17 個次級代謝基因簇，基因簇多少與基因組大小無直接相關(guān)性。46 株菌總共預(yù)測到643 個基因簇，共注釋到27 類，按被注釋到的頻次多少排序可知（圖5），非核糖體肽合成酶（NRPS）出現(xiàn)頻次最高，為120 次；然后依次為細菌素（bacteriocin，90次），高絲氨酸內(nèi)酯（hserlactone，60 次），芳基多烯（arylpolyene，48 次），NRPS-like（45 次），β 內(nèi)酯（betalactone，43 次），鐵載體（siderophore，42 次）。說明已經(jīng)測序的46 株綠針假單胞菌的主要次級代謝產(chǎn)物可能是細菌素、高絲氨酸內(nèi)酯、芳基多烯和鐵載體類化合物。在全部預(yù)測到的基因簇中，有408 個與已知基因簇存在一定同源性，其中，同源性大于70%的有35 個（表2）；同源性為100%的有32 個，主要是吡咯菌素（pyrrolnitrin）和綠膿菌素（pyocyanine），說明綠針假單胞菌4 個亞種普遍具有產(chǎn)生吡咯菌素和綠膿菌素的能力。而大量同源性較低的基因簇預(yù)示著綠針假單胞菌中存在大量新的次級代謝產(chǎn)物。

按亞種分類統(tǒng)計，綠針假單胞菌4 個亞種預(yù)測到的次級代謝基因簇類型數(shù)量分別為Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca 22 類 ，Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens 16 類，Pseudomonas chlororaphis subsp. chlororaphis 16 類，Pseudomonas chlororaphis subsp. piscium 15 類。4 個亞種共同擁有的次級代謝基因簇類型有10 種，分別為高絲氨酸內(nèi)酯、非核糖體肽合成酶、丁內(nèi)酯（butyrolactone）、細菌素、鐵載體、β 內(nèi)酯、NRPS-like、芳基多烯、NAGGN 以及吩嗪與高絲氨酸內(nèi)酯雜合基因簇。說明綠針假單胞菌的4 個亞種均能夠分泌細菌素、吩嗪、鐵載體、丁內(nèi)酯等。Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca 擁有的獨有次級代謝基因簇類型比較豐富，有6 個，包括 ectoine、T1PKS、丁內(nèi)酯等幾個雜合基因簇。預(yù)示該亞種能夠分泌更多的其他潛在生物活性物質(zhì)。

表2 相似度大于70%的獲注釋已知次級代謝產(chǎn)物基因簇

3 結(jié)論與討論

本研究在NCBI 數(shù)據(jù)庫獲得46 株進行了全基因組測序并組裝到完整基因組水平的綠針假單胞菌菌株，泛基因組分析發(fā)現(xiàn)，這46 株綠針假單胞菌泛基因組中包含271 910 個功能基因，共鑒定出13 296 個基因家族，其中，核心基因家族有3 653 個、非必需基因家族有5675 個、特有基因家族有3968 個。通過計算發(fā)現(xiàn)，隨綠針假單胞菌基因組測序數(shù)量增加泛基因組增加，而核心基因組逐漸減少，說明綠針假單胞菌泛基因組目前仍是開放的。

通過對46 株綠針假單胞菌的次級代謝產(chǎn)物合成基因簇預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，綠針假單胞菌合成次級代謝產(chǎn)物能力較強，每株菌均能預(yù)測到12～17 個次級代謝基因簇。46 株菌總共預(yù)測到643 個基因簇，共注釋到27 類，其中，4 個亞種都共同擁有的次級代謝基因簇類型有10 種，分別為高絲氨酸內(nèi)酯、非核糖體肽合成酶、丁內(nèi)酯（butyrolactone）、細菌素、鐵載體、β 內(nèi)酯、NRPS-like、芳基多烯、NAGGN 以及吩嗪與高絲氨酸內(nèi)酯雜合基因簇。說明綠針假單胞菌的4 個亞種均能分泌細菌素、吩嗪、鐵載體、丁內(nèi)酯等。

目前，已經(jīng)證實，在假單胞菌中存在的抗生素主要有吩嗪類、藤黃綠菌素（Pyoluteorin）、2，4- 二乙酰基間苯三酚（2，4-diacetylphloroglucinol）、氫氰酸（HCN）、粘質(zhì)酰胺（Viscosinamide）和硝吡咯菌素（Pyrrolnitrin）等[18]。黃玲[19]研究指出，綠針假單胞菌GP72 產(chǎn)生的主要抗菌活性物質(zhì)為吩嗪-1- 羧酸（phenazine-1-carboxilic acid，PCA） 和 2- 羥基吩嗪（2-hydroxyphenazine，2-OH-PHZ）。其中，PCA 有效防治甜椒疫病和西瓜炭疽病的作用已經(jīng)得到了國際上的廣泛認可，并且其作為新型農(nóng)藥申嗪霉素的主要成分，已經(jīng)申請了專利。PIERETTI 等[20]從番茄根分離到Pseudomonas chlororaphis subsp.aureofaciens M71，能夠產(chǎn)生 2 種吩嗪類物質(zhì)。CARLIER 等[21]從大豆根際分離到Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca SR1 能產(chǎn)生鐵載體、HCN 和激素類物質(zhì)；JIAO 等[8]研究表明，從小麥根際分離得到Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca Pa40 能夠產(chǎn)生HCN、蛋白酶、鐵載體；張瑩瑩等[5]研究表明，綠針假單胞菌HL5-4 能產(chǎn)生蛋白酶、纖維素酶和嗜鐵素；楊藝煒[6]研究發(fā)現(xiàn)，綠針假單胞菌XF10 能產(chǎn)生蛋白酶、纖維素酶和5 種有抑菌作用的揮發(fā)性酮類產(chǎn)物（2- 壬酮、2- 壬醇、2- 癸酮、2- 十一烷酮、2-十三烷酮）；熊欣等[22]、CHEN 等[23]研究表明，生防綠針假單胞菌HT66 的主要代謝產(chǎn)物為吩嗪-1- 甲酰胺，此外，HT66 還可合成鐵載體、殺蟲蛋白Fit D（Pseudomonas fluorescens insecticidal toxin D）、HCN、Achromobactin（Acr）和脂肽類產(chǎn)物黏液菌素等產(chǎn)物。大量研究已證實，綠針假單胞菌確實有產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物的功能，這些次生代謝產(chǎn)物在抑制病原菌、促進植物生長、幫助菌株定殖、菌株的運動性、生物膜形成和代謝等方面發(fā)揮著重要作用。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，46 株綠針假單胞菌中存在大量同源性較低的基因簇，預(yù)示著綠針假單胞菌中有大量新的次級代謝產(chǎn)物，其還有待進一步深入挖掘。

本研究對46 株綠針假單胞菌完整基因組分析發(fā)現(xiàn)，其泛基因組含有271 910 個功能基因，13 296 個基因家族，其中，核心基因家族有3 653 個，特有基因家族有3 968 個。次級代謝產(chǎn)物合成基因簇預(yù)測顯示，共挖掘到27 類、643 個基因簇，其中，4 個亞種都共同擁有的次級代謝基因簇類型有10 種；綠針假單胞菌中還有大量未開發(fā)的次級代謝產(chǎn)物，在植物抗病、促生等方面有巨大的應(yīng)用潛力。