劉 悅，曲 浩，尚衛(wèi)瓊，孫云南，田易萍，仝佳音，陳林波

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，云南省茶學(xué)重點實驗室，云南勐海666201）

茶樹在葉片顏色上具有很大的多樣性，不同程度積累花青素[1]。紫娟茶樹（Camellia sinensis cv.Zijuan）的特色之一就是葉片在不同發(fā)育階段的顏色由紫色變?yōu)榫G色，一部分因素是因為花青素等內(nèi)含物質(zhì)發(fā)生變化。目前，消費者對食品質(zhì)量具有較高的要求，茶葉中的花青素含量對消費者的選擇有著較強的影響。有研究顯示[2]，調(diào)控因子決定結(jié)構(gòu)基因表達(dá)與否及強弱，影響花青素合成水平。目前，對擬南芥、玉米、牽牛花等模式植物和農(nóng)作物在黃酮類化合物的生物合成方面有著廣泛的研究，并已發(fā)現(xiàn)一些轉(zhuǎn)錄因子對花青素生物合成途徑的基因具有調(diào)節(jié)作用[3]。MicroRNAs（miRNAs）作為一種重要的內(nèi)源性非編碼小RNA，在植物基因表達(dá)過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用[4]。miR828a 的靶基因WER 是最大的轉(zhuǎn)錄因子家族MYB 的成員之一，MYB 家族在植物發(fā)育、代謝、生物和非生物脅迫的反應(yīng)中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，但茶樹中有關(guān)miRNAs 及靶基因的作用目前報道還較少。

miRNAs 最重要的功能是能夠啟動具有多個mRNA 靶標(biāo)的調(diào)控級聯(lián)反應(yīng)，在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮作用，通過RNA 切割或翻譯抑制目標(biāo)基因的表達(dá)[5]。有研究表明，植物組織的花青素含量受miRNAs 的影響[6]，例如，擬南芥中miR828 的過表達(dá)導(dǎo)致MYB轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平降低，從而降低花青素水平[7]；在番茄中，miR828 被認(rèn)為是花青素生物合成的負(fù)調(diào)控因子，調(diào)控MYB 轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)[8-9]；在蘋果中，miR828 可靶向 19 個 MYB 轉(zhuǎn)錄因子，這些MYB 基因大部分都參與調(diào)控花青素合成相關(guān)的初級和次級代謝[10]；在荔枝中，miR156a 在果實成熟過程中產(chǎn)生差異表達(dá)，并通過SPL1 的調(diào)控影響花青素的積累[11]。miR828 是近年來通過深度測序發(fā)現(xiàn)的一種新的miRNA， 而茶樹miR828 靶基因功能研究還不太詳盡。

本研究在前期對不同葉色茶樹 （紫娟為紫色、云抗10 號為黃綠色、 福鼎大白茶為綠色） 進(jìn)行miRNA 測序分析時， 在紫娟茶樹葉片中發(fā)現(xiàn)了一條miR828a 片段具有顯著差異， 該片段與擬南芥miR828a 高度同源；通過對miR828a 的靶基因預(yù)測發(fā)現(xiàn) 12 個靶基因， 其中包含 MYB 家族基因WER。 本研究對WER 基因進(jìn)行克隆，獲得了一條長度為885 bp 的WER 序列， 通過生物信息學(xué)軟件構(gòu)建了WER 的系統(tǒng)發(fā)育樹，并對其疏水性、結(jié)構(gòu)域、 三維結(jié)構(gòu)等進(jìn)行預(yù)測， 旨在為進(jìn)一步研究miR828a 及靶基因WER 在紫娟茶樹花青素合成中的功能機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選用云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所試驗基地的紫娟茶樹一芽二葉為材料；樣品采集后液氮速凍保存于-80 ℃冰箱，備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA 提取及cDNA 的合成 樣品經(jīng)液氮研磨后， 總RNA 的提取選用通用型超純RNA 提取試劑盒（GR2011）；用于基因驗證的cDNA 采用第1鏈 cDNA 合成試劑盒（Thermo k1621）。

1.2.2 WER 基因的克隆 根據(jù)獲得的miR828a 靶基因 WER 片段序列信息， 利用Primer 5.0 軟 件 設(shè) 計 3′ RACE 接 頭 引 物3RACEP1 和 3RACEP2，5′ RACE 接 頭 引 物5RACEP1 和 5RACEP2，3′端特異引物 3′-inner 和 3′-outer，5′端特異引物 5′-inner 和5′-outer（表 1）。 用 RACE 方法對 WER 基因片段3′端和5′端進(jìn)行克隆， 拼接驗證后獲得全長cD-NA，由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行基因測序。

表1 引物序列

1.2.3 WER 基因的生物信息學(xué)分析 生物信息學(xué)分析參照文獻(xiàn)[12-13]進(jìn)行，在 NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/） 上完成核苷酸和蛋白序列比對分析；利用Protparam 工具進(jìn)行基因編碼蛋白理化性質(zhì)分析； 采用SignalP 預(yù)測氨基酸序列信號肽； 采用ProtScale 進(jìn)行親水性分析；采用ProtCompv. 9.0 進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析；并采用MEGA 7.0 軟件進(jìn)行WER 及相關(guān)蛋白進(jìn)化樹的構(gòu)建；利用SWISS-MoDEL 預(yù)測蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)。

以紫娟茶樹葉片的基因組DNA 為模板，利用引物進(jìn)行 PCR 擴增，5′RACE 和 3′RACE 分別擴增得到643、282 bp 的片段，拼接后得到一條長度為885 bp 的序列，其中，A 堿基 263 個，占 29.72%；G堿基 203 個，占 22.94%；C 堿基 175 個，占 19.77%；T 堿基 244 個，占 27.57%，分子量為 272 911（圖 1）。有55 個常見酶切位點，其中包含一條長度為276 bp的完整開放閱讀框，編碼92 個氨基酸。蛋白質(zhì)理論分子質(zhì)量為10.7 ku，理論等電點為10.92。正電荷殘基總數(shù)（Arg＋Lys）為12 個，負(fù)電荷殘基總數(shù)（Asp＋Glu）為 6 個。分子式為 C495H790N134O128S1。估計半衰期為20 h，不穩(wěn)定指數(shù)64.31（不穩(wěn)定蛋白質(zhì)），脂溶系數(shù)111.2，親水性平均值-0.034。

2.2 WER 系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了解茶樹WER 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化，將拼接得到的WER 序列通過MEGA 6.0 進(jìn)行多重序列比對分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，19 種植物分為2 個大的分支，茶樹WER 與麻風(fēng)樹JcMYB114、蒲桃 SoMYB114、桃樹 PoMYB7、碧桃 PpWER、青梅PmTT2、櫻桃 PaMYB114、白梨 LOC103958466、蘋果MdMYB5、錦葵 HuMYB114、可可 LOC1860-6229、核桃JrMYB114、白櫟QiMYB114、栓皮櫧QsMYB-114 歸為同一個分支，其中，茶樹WER 與蒲桃SoMYB114 親緣關(guān)系較近（圖 2）。

2.3 WER 蛋白疏水性分析

通過推測的氨基酸序列利用ProtScale 工具進(jìn)行蛋白一級結(jié)構(gòu)的親/疏水性預(yù)測，使用默認(rèn)的Hphob./Kyte&Doolittle 標(biāo)度打分。平均疏水性系數(shù)為-0.034，從親水性分析可得，WER 屬于不穩(wěn)定親水蛋白（負(fù)值為親水，正值為疏水）。其中，最高正值1.844出現(xiàn)在第40 位氨基酸，疏水性最強；最小負(fù)值-1.822 出現(xiàn)在第81 位氨基酸，親水性最強（圖3-A）。信號肽預(yù)測結(jié)果顯示（圖3-B），信號肽預(yù)測值為0.287 5，其他預(yù)測值為0.712 5。因此，MYC1 蛋白不含有信號肽，沒有信號識別功能，為非分泌蛋白。

2.4 WER 蛋白跨膜區(qū)預(yù)測

通過SMART 程序預(yù)測發(fā)現(xiàn)，WER 氨基酸序列上有一個跨膜螺旋區(qū)域（圖4-A）；利用TMHMMv2.0在線工具進(jìn)行預(yù)測分析，得到WER 第25—47 位氨基酸為跨膜螺旋區(qū)，第1—24 位氨基酸在膜內(nèi)側(cè)，第48—92 位氨基酸在膜外側(cè)（圖4-B）。

2.5 WER 蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測

通過ProtComp v9.0 在線工具對WER 的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測分析可知，WER 可能定位在質(zhì)膜和線粒體上，綜合得分分別為3.22、3.59 分（表2）。

表2 WER 亞細(xì)胞定位預(yù)測 分

2.6 WER 蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用SWISS-MODEL 在線工具構(gòu)建紫娟茶樹WER 蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型（圖 5-A），WER 蛋白三維結(jié)構(gòu)與模板結(jié)構(gòu)相似度為25%。圖5-B 中，深色區(qū)域為完全允許區(qū)域，散點大多集中在深色區(qū)域，表明WER 蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果較為可靠。

3 結(jié)論與討論

許多富含次生代謝物的植物中，MYB 基因的表達(dá)量較高，同時也有大量的miRNA 表達(dá)；并且許多以MYB 為靶點的miRNA 都與其靶點非常接近，這種相關(guān)性可能是共同進(jìn)化的結(jié)果[14]。在進(jìn)化過程中，部分植物會產(chǎn)生特有的顏色，研究表明，含有豐富花青素的植物具有更多的MYB 基因[10]。紫娟茶樹的嫩葉為紫色，其花青素含量比綠色葉片高。研究miR828a 靶基因WER 能夠為紫娟茶樹葉片顏色變化提供理論基礎(chǔ)。另外，WER、GL1 和MYB23 基因密切相關(guān)，在擬南芥中參與調(diào)控植物表皮細(xì)胞[15]，并且WER 基因?qū)Ω?xì)胞分化有著促進(jìn)作用[16]。有報道顯示[17]，WER 和GL1 基因在功能上是相同的，其順式調(diào)控序列的變化完全是由于這2 個基因功能存在差異。

本研究在紫娟茶樹中克隆得到WER 基因，長度為885 bp，包含一條長度為276 bp 的完整開放閱讀框，編碼92 個氨基酸；預(yù)測其編碼的蛋白屬于非分泌蛋白，信號肽分析則說明其不具有信號識別功能。另外，WER 預(yù)測蛋白序列含有1 個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域，這個功能域或許決定了WER 在紫娟茶樹中的功能。一般來說，跨膜結(jié)構(gòu)域發(fā)揮著信息傳遞的作用，對細(xì)胞內(nèi)的激活機制具有重要貢獻(xiàn)[18]。通過蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測，發(fā)現(xiàn)WER 大概率分布于質(zhì)膜和線粒體上。因此，推測紫娟茶樹WER 蛋白在質(zhì)膜與線粒體上通過跨膜結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。本研究結(jié)果將為進(jìn)一步探明miR828a 靶基因WER 在花青素合成方面的作用提供理論基礎(chǔ)。