盧利平,張 利,李 鈾,*,金偉嘉,丁功濤,高丹丹,陳士恩(.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730030;.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心中國(guó)馬來(lái)西亞國(guó)家聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州 730030)

原花青素(Procyanidins,PC)主要是由不同數(shù)目的兒茶素及其衍生物等縮合而成的多酚化合物,亦是一種生物類黃酮混合物,紅棕色粉末狀,氣味微苦澀,能溶于水和大多數(shù)有機(jī)溶劑[1]。原花青素具有抗氧化活性[2]、抗腫瘤[3]、抗輻射[4]、防治心血管疾病[5]等多種功能,在藥品、食品、化妝品等領(lǐng)域應(yīng)用比較廣泛[6-7]。原花青素的提取方法有多種,最常用的方法有溶劑萃取法[8]、酶法提取法[9-11]、超聲波輔助提取法[12-13]、高效液相色譜法[14]、低濃度香草醛-鹽酸法[15]、紫外分光光度法、鐵鹽催化法等[16]。

目前國(guó)內(nèi)外的研究者大多是針對(duì)茄子[8]、葡萄[17-18]、黑果枸杞[19-20]、山楂[21-22]、香蕉[23]等植物中的原花青素進(jìn)行研究,對(duì)茶中原花青素的研究還相對(duì)較少[24-25],關(guān)于鳳岡綠茶中原花青素提取與檢測(cè)未見(jiàn)報(bào)道,由此可見(jiàn),對(duì)武陵山片區(qū)茶葉中原花青素的測(cè)定與分析很有必要,可以增加片區(qū)茶葉的附加值和山區(qū)茶農(nóng)的經(jīng)濟(jì)來(lái)源,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用茶葉和脫貧攻堅(jiān)工作起到一定推動(dòng)作用。趙春艷等[26]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明超聲輔助法優(yōu)于溶劑提取法。因此,本課題以鳳岡綠茶為原料,在低濃度香草醛—鹽酸法[15]基礎(chǔ)上,考察乙醇濃度、超聲溫度、超聲時(shí)間、料液比等因素對(duì)原花青素得率的影響,響應(yīng)面優(yōu)化超聲波輔助提取原花青素的工藝條件,得出最佳提取工藝,為鳳岡綠茶中原花青素的進(jìn)一步綜合開(kāi)發(fā)與利用提供有利的科學(xué)支撐,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)鳳岡綠茶的產(chǎn)品附加值提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鳳岡綠茶 貴州省鳳岡縣婁山春茶葉專業(yè)合作社;蒸餾水、甲醇、無(wú)水乙醇、香草醛、濃鹽酸、石油醚(均為分析純) 蘭州市奧科生物技術(shù)有限公司;原花青素標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司。

KQ2200DE超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司;H1650-W離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司;Dor Yang DA型電子分析天平 渡揚(yáng)精密儀器(上海)有限公司;BWS-0505型恒溫水槽水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;WJX-200型高速多功能粉碎機(jī) 上海緣沃工貿(mào)有限公司;UV-1800紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鳳岡綠茶原花青素提取工藝流程 鳳岡綠茶→粉碎(過(guò)80目篩)→超聲提取→離心→原花青素提取液

1.2.2 茶樣品溶液前處理 稱取一定質(zhì)量的鳳岡綠茶,用粉碎機(jī)粉碎(過(guò)80目篩),置于比色管中,按一定料液比加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇,蓋好蓋子,在超聲頻率40 kHz,一定溫度條件下,提取一定時(shí)間。提取結(jié)束后,過(guò)濾收集上清液,提取兩次后合并上清液并在12000 r/min離心10 min,取上清液定容至50 mL,作為提取液。

1.2.3 原花青素含量的測(cè)定 原花青素含量的測(cè)定采用改良的濃鹽酸-香草醛法[15],分別配制1%香草醛-甲醇溶液及1 mol/L鹽酸-甲醇溶液,按照體積比1∶1充分混勻得到反應(yīng)工作液。

1.2.3.1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取原花青素標(biāo)準(zhǔn)品25 mg,置于25 mL具塞試管中,加入甲醇混合均勻后定容至刻度線,得到1 mg/mL的原花青素標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL的上述標(biāo)準(zhǔn)溶液,置于10 mL具塞試管中,加入3 mL反應(yīng)工作液,甲醇定容至刻度,混勻后放入30 ℃恒溫水浴鍋中,避光反應(yīng)1 h,取出靜置至室溫,甲醇調(diào)零作為空白對(duì)照,于500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度(A500)值[27]。

1.2.3.2 樣品中原花青素含量的測(cè)定 準(zhǔn)確移取1 mL樣品提取液于10 mL具塞試管中,加入3 mL反應(yīng)工作液,甲醇定容至刻度,混勻后按照上述方法進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后在波長(zhǎng)500 nm處測(cè)定其吸光(A500)值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算鳳崗綠茶中原花青素濃度,并計(jì)算原花青素的得率[20]。

式中:C表示測(cè)得的原花青素濃度,mg/mL;V表示茶樣品定容體積,mL;f表示稀釋倍數(shù);m表示茶樣品質(zhì)量,g。

1.2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4.1 乙醇濃度對(duì)原花青素得率的影響 在控制料液比為1∶20 g/mL,超聲溫度為70 ℃、超聲時(shí)間為50 min,乙醇濃度(乙醇與水的混合溶液)分別為70%、75%、80%、85%、90%、95%的條件下,考察乙醇濃度對(duì)鳳岡綠茶原花青素得率的影響。

1.2.4.2 超聲溫度對(duì)原花青素得率的影響 在料液比為1∶20 g/mL,乙醇濃度為85%,超聲時(shí)間為50 min,超聲溫度分別為20、30、40、50、60、70 ℃的條件下,考察超聲溫度對(duì)鳳岡綠茶原花青素得率的影響。

1.2.4.3 超聲時(shí)間對(duì)原花青素得率的影響 在料液比為1∶20 g/mL,乙醇濃度為85%,超聲溫度分別為50 ℃,浸提時(shí)間分別為30、40、50、60、70、80 min的條件下,考察超聲時(shí)間對(duì)鳳岡綠茶原花青素得率的影響。

1.2.4.4 料液比對(duì)原花青素得率的影響 在乙醇濃度為85%,超聲溫度分別為50 ℃,浸提時(shí)間為40 min,料液比分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 g/mL的條件下,考察料液比對(duì)鳳岡綠茶原花青素得率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理,在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,工藝優(yōu)化選取對(duì)鳳岡綠茶原花青素得率有顯著影響的乙醇濃度(A)、超聲溫度(B)、超聲時(shí)間(C)、料液比(D)4個(gè)因素作為自變量,以鳳岡綠茶原花青素得率為響應(yīng)值,進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn),優(yōu)化原花青素的提取工藝,試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)做3次平行,結(jié)果取平均值;采用Office Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析;采用Origin 8.0制圖;Design-Expert 8.06軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以原花青素標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X),吸光度(A500)值為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖1所示。求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y=1.615X-0.0014,相關(guān)系數(shù)R2=0.9991,且在0.1～0.6 mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of proanthocyanins

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度對(duì)原花青素得率的影響 由圖2可知,隨乙醇濃度的提高,總原花青素得率呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì),當(dāng)乙醇濃度為85%時(shí),原花青素得率最高;乙醇濃度大于85%時(shí),原花青素得率開(kāi)始下降。這是由于不同濃度的乙醇具有不同的極性,對(duì)原花青素的溶出量有一定的影響,這與原花青素本身的極性相關(guān)。同時(shí),隨著乙醇濃度增大,脂溶性成分溶出,同原花青素形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,導(dǎo)致原花青素得率下降[23]。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及曲線變化規(guī)律,在Box-Behnken中心組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中,乙醇濃度選取80%～90%。

圖2 乙醇濃度對(duì)原花青素得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield of proanthocyanins

2.2.2 超聲溫度對(duì)原花青素得率的影響 由圖3可知,在超聲溫度20～50 ℃范圍內(nèi),原花青素得率隨著超聲溫度的升高而增大,溫度繼續(xù)升高超過(guò)50 ℃后,鳳岡綠茶原花青素得率呈下降趨勢(shì)。這是因?yàn)檫m當(dāng)?shù)母邷啬軌虼龠M(jìn)原花青素的溶出,但是溫度過(guò)高使原花青素的結(jié)構(gòu)被破壞,同時(shí)也會(huì)增加其他雜質(zhì)的溶出量,因而原花青素的得率會(huì)降低[27]。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及曲線變化規(guī)律,在Box-Behnken中心組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中,超聲溫度選取50～70 ℃。

圖3 超聲溫度對(duì)原花青素得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the yield of proanthocyanins

2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)原花青素得率的影響 由圖4可知,鳳岡綠茶原花青素得率呈先增加后減少的變化趨勢(shì)。在30～40 min范圍內(nèi),隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng),原花青素得率不斷上升;當(dāng)超聲時(shí)間為40 min時(shí),原花青素得率達(dá)到最大值;超過(guò)40 min后,原花青素得率隨時(shí)間延長(zhǎng)開(kāi)始逐漸下降。這是由于時(shí)間過(guò)短,原花青素提取不夠充分,時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致原花青素酚羥基機(jī)構(gòu)破壞,影響得率[28]。為了提高原花青素得率,根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及曲線變化規(guī)律,在Box-Behnken中心組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中,超聲時(shí)間選取30～50 min。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)原花青素得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the yield of proanthocyanins

2.2.4 料液比對(duì)原花青素得率的影響 由圖5可知,鳳岡綠茶中原花青素得率隨著料液比的增加而升高,當(dāng)料液比超過(guò)1∶30 g/mL后,原花青素得率變化較小。這是由于當(dāng)浸提溶劑量比較小時(shí),鳳岡綠茶中原花青素溶出不徹底;隨著溶劑量增加,原花青素得率先增大后基本趨于平衡狀態(tài),根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及曲線變化規(guī)律,在Box-Behnken中心組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中,料液比選取1∶30～1∶40 g/mL范圍。

圖5 料液比對(duì)原花青素得率的影響Fig.5 Effect of material-liquid ratio on the yield of proanthocyanins

2.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面法優(yōu)化原花青素提取工藝 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,通過(guò)Design-Expert 8.06軟件設(shè)計(jì),以乙醇濃度(A)、超聲溫度(B)、超聲時(shí)間(C)、料液比(D)為自變量,以鳳岡綠茶中原花青素得率為響應(yīng)值,根據(jù)四因素三水平的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面分析,其中5、8、10、11、12是中心試驗(yàn),其余為析因試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果 Table 2 Scheme and results of response surface design

2.3.2 模型的建立與顯著性分析 通過(guò)Design-Expert 8.06軟件進(jìn)行多元回歸分析,得到鳳岡綠茶提取液的乙醇濃度、超聲溫度、超聲時(shí)間、料液比四因子數(shù)學(xué)回歸方程為:

Y=4.73-0.36A-0.15B-0.024C-0.004D-0.042AB-0.018AC+0.15AD+0.025BC-0.035BD-0.037CD-0.56A2-0.32B2-0.16C2-0.073D2。

表3 回歸方程方差分析Table 3 The variance analysis of regression equation

綜上所述,此模型可以用來(lái)分析和預(yù)測(cè)鳳岡綠茶中原花青素得率的真實(shí)情況。由F值可知,各因素對(duì)原花青素得率的影響次序?yàn)锳>B>C>D,即乙醇濃度>超聲溫度>超聲時(shí)間>料液比。

2.3.3 響應(yīng)面交互作用分析 響應(yīng)面曲面圖可以直觀反映乙醇濃度、超聲溫度、超聲時(shí)間和料液比對(duì)原花青素得率的影響,如圖6～圖11所示。對(duì)比圖6～圖11,乙醇濃度對(duì)原花青素得率的影響最大,其次是超聲溫度、超聲時(shí)間,料液比響應(yīng)面相對(duì)平緩,說(shuō)明其對(duì)原花青素得率的影響最小。交互效應(yīng)強(qiáng)弱程度可以從投影面的等高線形狀中觀察,圓形為交互作用不顯著,橢圓則為交互作用顯著[28]。從圖8a中可以看出,曲面傾斜度比較大,而且越是靠近曲面頂端,顏色越深,表示乙醇濃度與料液比的交互作用顯著,其余各因素等高線橢圓形狀不明顯(圖6～圖7、圖9～圖11),表明其交互作用不顯著,這與回歸方程的方差分析結(jié)果一致。

圖6 乙醇濃度與超聲溫度對(duì)原花青素得率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plots of ultrasonic temperature and concentration of ethanol on the proanthocyanin extraction rate

圖7 乙醇濃度與超聲時(shí)間對(duì)原花青素得率影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plots of ultrasonic time and concentration of ethanol on the proanthocyanin extraction rate

圖8 乙醇濃度與料液比對(duì)原花青素得率影響的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface plots of material-liquid ratio and concentration of ethanol on the proanthocyanin extraction rate

圖9 超聲時(shí)間與超聲溫度對(duì)原花青素得率影響的響應(yīng)面圖Fig.9 Response surface plots of ultrasonic time and temperature on the proanthocyanin extraction rate

圖10 超聲溫度與料液比對(duì)原花青素得率影響的響應(yīng)面圖Fig.10 Response surface plots of ultrasonic temperature and material-liquid ratio on the proanthocyanin extraction rate

圖11 超聲時(shí)間與料液比對(duì)原花青素得率影響的響應(yīng)面圖Fig.11 Response surface plots of ultrasonic time and material-liquid ratio on the proanthocyanin extraction rate

2.3.4 最佳提取工藝條件及驗(yàn)證試驗(yàn) 對(duì)回歸方程進(jìn)行求解,即得率達(dá)到最大值時(shí)的提取條件為:乙醇濃度83.2%,提取溫度58.1 ℃,提取時(shí)間 39.7 min,料液比 1∶33.25 g/mL,在此條件下,原花青素得率為4.804%。根據(jù)實(shí)際情況,對(duì)工藝條件進(jìn)行調(diào)整,調(diào)整后的最佳提取條件為:乙醇濃度83%,提取溫度58 ℃,提取時(shí)間40 min。料液比1∶33 g/mL;為進(jìn)一步確定響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果的準(zhǔn)確性,在調(diào)整后的工藝條件下做3次重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證,得到鳳岡綠茶中原花青素得率為4.798%±0.05%。結(jié)果表明,經(jīng)過(guò)回歸方程擬合出的理論值與實(shí)際值的RSD值為1.05%,說(shuō)明用響應(yīng)面法優(yōu)化鳳岡綠茶原花青素的提取工藝條件具有可行性。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面分析法對(duì)鳳岡綠茶中原花青素進(jìn)行超聲輔助提取工藝優(yōu)化,擬合了乙醇濃度、超聲溫度、超聲時(shí)間和料液比四個(gè)因素對(duì)鳳岡綠茶中原花青素得率影響的回歸模型,分析結(jié)果得到四因素對(duì)原花青素得率的影響大小次序?yàn)?乙醇濃度>超聲溫度>超聲時(shí)間>料液比。優(yōu)化后的最佳提取工藝條件為:乙醇濃度83%,提取溫度58 ℃,提取時(shí)間40 min。料液比1∶33 g/mL。在此條件下,鳳岡綠茶中原花青素得率為4.798%±0.05%,高于黑果枸杞中原花青素得率[20],與預(yù)測(cè)值(4.804%)相近,且其相對(duì)誤差為1.05%,說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)化后的工藝條件可行。采用超聲輔助提取鳳岡綠茶中原花青素,操作簡(jiǎn)單,得率高,為鳳岡綠茶中原花青素的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。