楊 珺，陳 鵠，吳國平，舒 梅，李盛艷，鐘 嬋

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/南昌市農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點實驗室，江西南昌 330045）

【研究意義】副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是一種嗜鹽革蘭氏陰性食源性致病菌，廣泛分布于沿海、河口環(huán)境和魚、蝦、貝類等海產(chǎn)品中[1-3]。該菌最適生長溫度為30～37 ℃，因此夏秋季是VP 中毒事件的高發(fā)期。VP 可引起食物中毒、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎和心臟疾病等，且發(fā)病呈世界性分布[4]。對全國43 個城市的2 531 份水產(chǎn)品和熟食樣品進行污染水平調(diào)查，發(fā)現(xiàn)VP 的整體污染率高達24.26%[5]。特別在沿海城市，由該菌引起的食物中毒占細菌性食物中毒的60%以上，其引發(fā)的食源性疾病爆發(fā)是當前面臨的重要的公共衛(wèi)生安全問題之一[6]。因此，如何快速地檢測篩查水產(chǎn)品中VP，防止被污染的食品進入市場，是有效防控VP 食源性疾病暴發(fā)的前提條件。【前人研究進展】目前，常用于檢測VP 的方法有細菌培養(yǎng)檢測法、免疫學(xué)方法、聚合酶鏈式反應(yīng)等[7]。細菌培養(yǎng)法是“金標準”，不需要復(fù)雜的實驗儀器并且實驗結(jié)果可靠，但是其檢測周期較長，5～7 d，而且程序繁瑣、費時費力[8]。免疫學(xué)方法雖然快速，但在檢測時間、靈敏度和特異性等方面略顯不足。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種較PCR 更新穎的核酸擴增技術(shù)，它依賴于能夠識別靶DNA 上6 個特定區(qū)域的4 條引物和一種具有鏈置換活性的DNA 聚合酶，在恒溫條件下高效擴增核酸[9-10]。相比PCR 而言，LAMP 一般對模板中干擾因子的抵抗力更強。實時熒光定量LAMP（Rti-LAMP）更是具備即時監(jiān)測、靈敏和無污染的優(yōu)點，具有高特異性、靈敏、高效、操作簡便等快速檢測特點[11]。【本研究切入點】魚肉等食品中存在許多可溶性DNA 聚合酶抑制劑，提取樣品中細菌用于核酸檢測時，因難以去除，將干擾阻礙LAMP、PCR 擴增反應(yīng)，從而降低其檢測靈敏性?；钚蕴渴且环N具有較大表面積、復(fù)雜孔隙結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，具有良好的吸附性能[12]。但由于活性炭一般也能吸附細菌，因而有文獻報道用蒙脫石[12]、環(huán)糊精[13]、牛奶蛋白[14]等物質(zhì)對活性炭進行封閉，使其吸附食品可溶性雜質(zhì)而不吸附細菌，從而精制目標細菌用于核酸檢測。此外，基于核酸擴增的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增，一般難以區(qū)分死、活目標細菌，容易高估活細菌污染的陽性結(jié)果。疊氮溴化乙錠（EMA）是一種具光親和標記特性的熒光核酸染料[15]。死細胞相對來說細胞膜的通透性更高，與EMA 混合后，經(jīng)高強度的曝光，EMA 與細胞DNA 共價結(jié)合，可抑制死菌DNA 的擴增，從而起到了區(qū)分死、活細胞的目的?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于此，本研究以VP 特異性tlh基因為檢測目標，采用Midori Green 熒光染料，聯(lián)合優(yōu)化蒙脫石封閉的活性炭、疊氮溴化乙錠前處理技術(shù)，建立了一種BCAC-EMA-Rti-LAMP 快速靈敏檢測魚肉污染VP 活菌的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

副溶血弧菌（VP）CICC 21617購買自中國菌種網(wǎng)。2019年11—12月，從南昌市水產(chǎn)市場上購買新鮮海水魚樣品，立即用于實驗檢測。

胰蛋白酶大豆肉湯（TSB），美國Difco公司生產(chǎn)；Whirl-Pak均質(zhì)過濾袋，美國Nasco公司生產(chǎn)；活性炭為河南祥源水處理材料有限公司生產(chǎn)；蒙脫石，美國Fisher公司生產(chǎn)；疊氮溴化乙錠（EMA），美國Sigma-Aldrich公司生產(chǎn)；BstDNA polymerse，新西蘭Biolabs公司生產(chǎn)；Midori Green，美國Bulldog Bio公司生產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

熒光PCR 儀，CFX Connect Real-time System，美國BIO-RAD 公司。GL-21M 高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。T18 數(shù)顯型高速分散器ULTRA-TURRAX，德國IKA 公司。拍擊式均質(zhì)機，AES chemuex公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)、計數(shù)及細菌DNA提取 將活化的VP接種于3 mL 3%NaCl TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，150 r/min過夜培養(yǎng)16～18 h，以3%菌液量轉(zhuǎn)接于10 mL 3%NaCl TSB 液體培養(yǎng)基，37 ℃，150 r/min培養(yǎng)1.5 h 左右至對數(shù)期細菌（OD600≈0.5）。將菌液用滅菌的3%鹽水按10 倍梯度依次稀釋，取100 μL 涂于平板，培養(yǎng)18～24 h細菌計數(shù)，測定OD600的數(shù)值，建立OD600值與細菌濃度的標準曲線。細菌于95 ℃水浴加熱5 min，即為死菌樣品。

細菌總DNA 制備，3%鹽水稀釋的細菌500μL加入500μL 2×TZ 裂解液，于99.5 ℃下加熱10 min，冰上冷卻后高速離心5 min，取上清即為細菌DNA模板。

實際樣品細菌DNA 的制備，取細菌懸液12 000 g 離心10 min，沉淀用50 μL 1×TZ 裂解液重懸，于99.5 ℃水浴加熱10 min，冰上冷卻后12 000 g 離心5 min，取上清即為細菌DNA 模板。如無特殊說明，均用此方法制備魚肉樣品的DNA模板。

1.3.2 Rti-LAMP反應(yīng) 研究發(fā)現(xiàn)tlh基因具有種屬特異性，廣泛分布于VP的環(huán)境與臨床分離株中，可作為VP 的一種常規(guī)檢驗方法。參照Zhong 等[16]設(shè)計合成的6 條特異性引物用于Rti-LAMP，包括兩條內(nèi)引物（FIP：ACATCGCTTGTGCCTTGATGAACTCAACACAAGAAGAGATCG，BIP:GCGCAAGGTTACAACAT?CACGGCAGAAGTTAGCGTCTCG），兩條外引物（F3：GTGCGAAGAACTTCATGTTG，B3：GATGAGCGGTT?GATGTCC），兩條環(huán)引物（Loop F：ACTCGTTCATCTCAAGCACTT，Loop B：TGTTTGATACTCACGCCTT?GT）。引物及緩沖液、dNTPs、Mg2+等反應(yīng)液Mix由廈門飛朔生物科技有限公司合成。

Rti-LAMP 反應(yīng)體系總體積為25 μL：21 μL Mix 引物，1 μL 1∶500 稀釋的熒光染料Midori Green，1μLBst 聚合酶，2μL 細菌DNA 模板。制備好的反應(yīng)管放入BIO-RAD CFX Connect Real-time System 內(nèi)65 ℃擴增反應(yīng)60 min。每分鐘讀取熒光數(shù)值，設(shè)定樣品熒光值出現(xiàn)指數(shù)增加的時間為Tt值，測定Tt值與細菌濃度之間關(guān)系函數(shù)。

1.3.3 預(yù)增菌的Rti-LAMP 方法（E-Rti-LAMP） 預(yù)增菌培養(yǎng)對模擬污染的魚肉樣品處理的Rti-LAMP檢測方法。每份25 g 魚肉，加175 mL 3%NaCl BPW 緩沖液于均質(zhì)袋中，加入稀釋至適宜濃度的VP 懸液1 mL，分別制備終濃度為10，30，100，300，1 000，3 000 CFU/g的模擬污染魚肉樣品，37 ℃水浴增菌4 h后，樣品轉(zhuǎn)移至離心杯800 r/min 4 ℃離心5 min，用4層玻璃棉進行過濾，取上清12 000 r/min 4 ℃離心5 min，沉淀用于細菌DNA的提取和Rti-LAMP擴增。

1.3.4 EMA-Rti-LAMP 檢測活的VP 方法建立 將EMA 用去離子水稀釋為0.5μg/μL，-20 ℃避光保存。取兩組不同濃度活的VP（0.2 mL，1.0×106CFU/mL 和0.2 mL，1.0×104CFU/mL）樣品，分別加入EMA 混勻，使EMA 終濃度分別為0，2.0，4.0，8.0，10.0μg/mL，避光處理5 min 后在500 W 鹵素?zé)粽障缕毓?5 min，樣品經(jīng)12 000 g 離心10 min，取細菌沉淀用0.2 mL 1×TZ 裂解液重懸，99.5 ℃水浴加熱10 min，高速離心后，上清即為DNA 模板用于Rti-LAMP 反應(yīng)。采用相似方法，對95 ℃水浴加熱5 min 殺死的VP 進行EMA 處理，然后進行Rti-LAMP反應(yīng)。

1.3.5 BCAC-EMA-Rti-LAMP 檢測魚肉中活的VP 方法建立 蒙脫石封閉活性炭（BCAC）的制備：參照趙遠洋等[17]方法制備，即選用顆粒直徑為1.25～2 mm 的活性炭16 g，用蒸餾水流洗至無色，烘干待用。取蒙脫石4 g 加蒸餾水200 mL，均質(zhì)2 min 后低速離心2 min，將上清液加入上述活性炭混合，37 ℃下150 r/min，震蕩3 h，55 ℃烘箱中烘干備用。

BCAC-Rti-LAMP 方法：取1 g 的魚肉，分別加入稀釋至適宜濃度的VP 1 mL 至終濃度分別為10，30，100，300，1 000，3 000 CFU/g 模擬污染魚肉樣品，靜置1 h，然后加入9 mL 3% NaCl，10 000 r/min 均質(zhì)1 min，800 r/min 離心5 min，用4 層玻璃棉進行過濾，取上清12 000 r/min 4 ℃離心5 min，沉淀用30 mL 0.85%NaCl重懸，加入4 g BCAC 于搖床150 rpm 吸附15 min后，玻璃棉過濾液12 000 rpm 離心10 min，沉淀用于后續(xù)細菌DNA的提取和Rti-LAMP擴增。

BCAC-EMA-Rti-LAMP 方法：人工模擬污染魚肉樣品見上，設(shè)置活細胞（V）和死細胞（D）比例（V∶D）為：0∶1 000，3∶997，10∶990，30∶970，100∶900，300∶700 和1 000∶0，其中活菌終濃度分別為0，6，20，60，200，600 和2 000 CFU/g。樣品經(jīng)BCAC 處理后，沉淀用0.2 mL 0.85%的生理鹽水重懸，加EMA 至終濃度為6.0μg/mL，暗處理5 min 后用500 W 鹵素?zé)艄庹?5 min，然后12 000 r/min離心10 min，沉淀用于細菌DNA的提取和Rti-LAMP擴增。

1.3.6 市售新鮮魚肉樣品中的VP 檢測 用BCAC-EMA-Rti-LAMP 檢測市售新鮮海水魚肉樣品33 份，使用國標法（GB 4789.7—2013食品微生物學(xué)檢驗VP檢驗）和BCAC-Rti-LAMP進行對比檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 VP的Rti-LAMP檢測方法的建立

本研究設(shè)置了0，1，10，100，1 000，10 000 CFU/反應(yīng)共6 個不同的梯度反應(yīng)來建立VP 的Rti-LAMP定量檢測方法，結(jié)果顯示該方法可穩(wěn)定檢測低至1 CFU/反應(yīng)。

圖1 VP的Rti-LAMP擴增曲線及Tt值與Log CFU/反應(yīng)的線性回歸方程Fig.1 Rti-LAMP plots and linear detection plot ofVibrio parahaemolyticusderived from various numbers of log phase VP

2.2 E-Rti-LAMP檢測模擬VP污染的魚肉

預(yù)增菌4 h后，建立E-Rti-LAMP 檢測魚肉樣品中VP方法，結(jié)果表明該方法檢測靈敏度為10 CFU/g，檢測過程約7 h（圖2）。以不同的VP 梯度（Log CFU/g）與其對應(yīng)的Tt值，建立回歸方程為y=-7 764x+47.51，R2為0.942 4。

2.3 區(qū)分死、活細胞DNA的EMA濃度優(yōu)化

如圖3A 所示，當EMA 的終濃度為0、2、4、10μg/mL 時，兩組36 CFU/反應(yīng)和3 600 CFU/反應(yīng)的EMARti-LAMP 擴增活VP，各組內(nèi)的Tt值差異均不顯著（P>0.05），說明EMA 處理對Rti-LAMP 擴增活細胞幾乎沒影響。

對熱殺死VP檢測結(jié)果如圖3B所示，終濃度為6μg/mL EMA 能完全抑制兩種含量VP死細胞DNA的擴增（設(shè)定完全抑制擴增的Tt值為60 min），而更低些濃度的EMA 處理，雖不能完全抑制死細胞DNA 的擴增，但可明顯延遲甚至完全抑制DNA的擴增，說明EMA 能夠有效地抑制熱死的VP擴增。選定終濃度為6μg/mLEMA用于后續(xù)區(qū)分檢測活的VP。

圖2 Rti-LAMP增菌檢測人工模擬VP污染的魚肉樣品的擴增曲線及Tt值與Log CFU/g的線性函數(shù)Fig.2 The fluorescence curves of the amplified products by Rti-LAMP with enrichment and linear detection plot ofVibrio parahaemolyticusderived from artificially contaminated marinefish

圖3 EMA處理VP樣品濃度的優(yōu)化。Fig.3 Optimization of EMA concentration

2.4 BCAC-Rti-LAMP檢測模擬污染魚肉中VP

使用4 g BCAC 處理人工模擬污染VP 的魚肉樣品，不經(jīng)過預(yù)增菌步驟，提取樣品DNA 進行檢測。結(jié)果顯示，BCAC-Rti-LAMP 能檢測4 CFU/gVP 污染的魚肉樣品，整個檢測時間約4.5 h（圖4）。以Tt平均值為縱坐標，Log CFU/g 為橫坐標，線性回歸方程為：y=-3.067 6x+19.421，決定系數(shù)R2=0.983 8，顯示該方法具有良好的定量分析檢測特性。

2.5 BCAC-EMA-Rti-LAMP檢測模擬污染魚肉中VP

對魚肉模擬VP 污染后，經(jīng)BCAC 和EMA 前處理后，Rti-LAMP 檢測結(jié)果如圖5 所示，該方法檢測VP活菌的最低檢出限為6 CFU/g，且整個檢測時間約5 h。

圖4 BCAC-Rti-LAMP 法檢測人工模擬VP污染魚肉的擴增曲線及Tt值與Log CFU/g的線性函數(shù)Fig.4 The fluorescence curves of the amplified products by BCAC-Rti-LAMP and linear detection plot of VP derived from artificially contaminated marinefish

圖5 BCAC-EMA-Rti-LAMP 法檢測人工模擬VP污染魚肉的擴增曲線線性函數(shù)Fig.5 The fluorescence curves of the amplified products by BCAC-EMA-Rti-LAMP and linear detection plot ofVibrio parahaemolyticusderived from artificially contaminated marinefish

2.6 市售魚肉樣品VP檢測

從當?shù)厮a(chǎn)市場采集33 份生鮮魚肉樣品，采用BCAC-EMA-Rti-LAMP 和BCAC-Rti-LAMP 進行檢測，同時用VP 國標檢測法（GB 4789.7—2013 食品微生物學(xué)檢驗副溶血弧菌檢驗）作對照檢測。實驗結(jié)果表1 顯示，國標法檢測到2 份VP 陽性樣品，BCAC-EMA-Rti-LAMP 法檢測到3 份陽性樣品，而BCACRti-LAMP法檢測到6份陽性樣品。

表1 3種檢測方法對生鮮魚肉樣品VP的檢測結(jié)果Tab.1 Detection of VP in fresh seafish samples by the three methods

3 討論與結(jié)論

基于活菌濃度建立的線性回歸方程為y=-2.392 8x+27.967，決定系數(shù)為0.971 3，表明BCAC-EMARti-LAMP 檢測方法以活細胞DNA 為模板進行擴增，死細胞DNA（即使其濃度遠高于活菌濃度）對DNA擴增影響很小。Cao 等[18]采用PMAxx-qPCR 方法在純培養(yǎng)的細菌中，能檢測到10.5 CFU/mL 的活VP，在不經(jīng)過預(yù)增菌的蝦樣品中能檢測到28 CFU/g 活的VP。Zhi 等[19]采用PMA（疊氮溴化丙錠）-Rti-LAMP方法檢測活的霍亂弧菌，其檢出限為110 CFU/mL。結(jié)果表明，BCAC-EMA-Rti-LAMP 方法具有較高的靈敏度。

BCAC-Rti-LAMP 和BCAC-EMA-Rti-LAMP 方法檢測到同一份陽性樣品而國標法未檢測到，分析可能是由于超市購買的魚肉樣品中活菌的數(shù)量低，但Rti-LAMP 法更靈敏，也有可能存在活的但不可培養(yǎng)即VBNC 狀態(tài)的VP 菌污染，國標法檢測不出。相比較國標法和BCAC-EMA-Rti-LAMP 方法，BCAC-Rti-LAMP 的方法另外還檢測到3 份陽性樣品，推測是BCAC-Rti-LAMP 方法不能區(qū)分死、活細菌，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。據(jù)牛樂耕[20]報道，海水魚類在打撈后為了保鮮或者防止細菌生長繁殖必須進行保鮮處理，以確保運往市場時的新鮮度。保鮮貯藏方法如冷凍、鹽藏、鹽漬等均導(dǎo)致細菌活力下降進入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)（VBNC 狀態(tài)）甚至死亡。細菌培養(yǎng)法只能檢測活菌，因無法檢出VBNC 狀態(tài)的細菌而導(dǎo)致漏檢。

本實驗建立了一種VP 的Rti-LAMP 快速檢測方法，其靈敏度達1 CFU/反應(yīng)，進一步采用BCAC 和終濃度6μg/mLEMA 前處理后，建立的BCAC-EMA-Rti-LAMP 方法不需要預(yù)增菌培養(yǎng)即可有效區(qū)分死、活VP，在約5 h內(nèi)實現(xiàn)快速檢測食品樣品中活的以及VBNC狀態(tài)的目標細菌，檢測靈敏度低至6 CFU/g相比國標檢測法更快速、靈敏，有可能成為魚肉VP污染的一種快速篩查檢測方法。