張永福，莫麗玲，徐金會，徐仕琴，裴徐梨

（昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明 650214）

【研究意義】地殼中含量最豐富的金屬元素是鋁，在pH值<5.0的酸性土壤中，大量Al3+進入土壤溶液而使作物遭受鋁毒害，嚴(yán)重抑制其生長[1]。全世界約有35%的可耕作土地為酸性（pH<5.0）土壤，而潛在的可耕種土地中約70%為酸性土壤[2]。酸性土壤占我國耕地總面積的21%，廣泛分布于南方各?。▍^(qū)）[3]。葡萄（Vitisspp.）為世界大宗果樹，因其漿果營養(yǎng)豐富、口感極佳而深受市場歡迎，取得較好的經(jīng)濟效益，因此近年來我國南方酸性土壤地區(qū)葡萄栽培面積迅速增加[4]。但葡萄耐鋁毒能力弱，鋁毒脅迫下，植株生長受抑，丙二醛含量、氧自由基產(chǎn)生速率、及SOD 和POD 活性均上升，根系活力下降[5]。可見，挖掘并克隆葡萄自身的耐鋁毒基因，獲得耐鋁性強的種質(zhì)資源勢在必行?！厩叭搜芯窟M展】植物在長期進化中產(chǎn)生了多種解除鋁毒的途徑[6-8]，其中，通過分泌蘋果酸[9]、檸檬酸[10-12]和草酸[13]等有機酸與Al3+螯合來緩解鋁毒是一條重要的途徑，相對而言檸檬酸螯合鋁的能力最強[14]。分泌檸檬酸的檸檬酸通道蛋白即次級主動運輸?shù)鞍准易逯械亩嗨幖岸拘詮?fù)合物排出蛋白MATE（multidrug and toxic compound extrusion）[15]，該蛋白與植物次生代謝產(chǎn)物的解毒機制密切相關(guān)[10,16]。鋁毒脅迫下，MATE基因的表達(dá)能夠促進檸檬酸分泌和根尖生長，表明該基因的表達(dá)量與作物的耐鋁性呈正相關(guān)[17-18]。自從在高粱（Sorghum bicolor）中發(fā)現(xiàn)了第一個鋁誘導(dǎo)編碼的檸檬酸轉(zhuǎn)運蛋白基因即SbMATE基因[17]后，相距發(fā)現(xiàn)了擬南芥（Arabidopsis thali?ana）AtMATE基因[19]、玉米（Zea mays）ZmMATE基因[16]、飯豆（Vigna unguiculata）VuMATE基因[20]、紫花苜蓿（Medicago sativa）MsMATE基因[21]及香橙（Citrus junos）CjMATE基因[22]等，這些MATE基因通過介導(dǎo)檸檬酸的分泌來增強其耐鋁毒能力?！狙芯壳腥朦c】目前，雖然在上述植物中都克隆得到了MATE基因，且已知該基因編碼的MATE蛋白具有降低鋁毒對植物危害的功能，但在葡萄上還未見有MATE基因克隆與表達(dá)方面的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究在前期對葡萄種質(zhì)資源耐鋁性評價的基礎(chǔ)上，挑選耐鋁性強的歐亞種品種‘紅地球’和耐鋁性弱的美洲種間雜種品種‘貝達(dá)’為試材，通過克隆分別獲得了VvMATE和VrlMATE兩個轉(zhuǎn)錄因子，并對其進行生物信息學(xué)分析和鋁脅迫下的基因表達(dá)、丙二醛含量和抗氧化酶活性分析，為進一步探明葡萄耐鋁毒的分子調(diào)控機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及鋁脅迫處理

供試的葡萄品種‘紅地球’（Vitis vinifera‘Red Globe’）和‘貝達(dá)’（V.riparia×V.labrusca‘Beta’）均來源于云南省彌勒市東風(fēng)農(nóng)場管理局，為1年生扦插苗。材料收集后用無土栽培的方式保存于昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)實踐園，取其健康、成熟葉片用于MATE基因克隆。采集的葉片立即放入液氮中速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

鋁脅迫處理采用PVC 管道栽培的方式，管道一共兩層，間距80 cm，在兩層管道兩端的上部，用直徑3 cm 的PVC 管連接，并在一端安裝抽水泵，使管中液體在上下兩層管子中循環(huán)流動，調(diào)節(jié)抽水泵的抽水量使上下兩層管中的液體量保持動態(tài)平衡，每天打開泵抽水時間不少于4 h。用于栽培葡萄的管道直徑18 cm、長200 cm，管道的同一面上每隔40 cm 設(shè)置一個直徑為10 cm 的栽培孔。鋁脅迫前，分別把‘紅地球’和‘貝達(dá)’1 年生苗的根系放入栽培孔中并用陶粒固定，在每一層管道內(nèi)加入2/3 管的1/2 Hoagland’s營養(yǎng)液（pH=4.5）。緩苗后，在1/2 Hoagland’s營養(yǎng)液（pH=4.5）中加入5 mmol/L鋁[Al2（SO4）3·18H2O，pH=4.5]進行脅迫處理。在鋁脅迫的第0、7、14、21、28 天時，分別采集兩份試材的健康、成熟葉片，用于MATE基因的表達(dá)分析。采集的葉片立即放入液氮中速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.2 RNA的提取和cDNA的合成

稱取0.1 g 葉樣品，加1 mL TPIzol 提取液后研磨成勻漿，再加0.2 mL 氯仿后室溫放置5 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min。取上清，加入異丙醇0.5 mL，搖勻后室溫放置10 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，倒棄上清，用75%乙醇洗滌沉淀，倒去乙醇后風(fēng)干沉淀，加DEPC 水100 μL 溶解DNA。cDNA 第1 鏈用TaKaRa公司的PrimeScript 1stStrand cDNA Synthesis Kit試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄合成，方法參照說明書。

1.3 MATE全長cDNA的克隆

按照已報道的擬南芥AtMATE 蛋白序列，在Phytozome葡萄基因組數(shù)據(jù)庫中進行BlastP搜索，獲得葡萄同源基因的cDNA 及氨基酸序列。根據(jù)該cDNA 序列，用Premier 5.0 設(shè)計引物（表1）并送生物公司合成。用高保真酶PrimeSRAHS DNA Polymerase 進行基因擴增。擴增程序：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，58 ℃復(fù)性10 s，72 ℃延伸25 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸2 min。擴增結(jié)束后，產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上點樣進行電泳檢測，切膠回收目的條帶（從Axygen 公司購買回收試劑盒），與pMD19-T Vector 連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，把陽性克隆挑出送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序。

1.4 MATE基因生物信息學(xué)分析

MATE基因翻譯成蛋白質(zhì)序列使用NCBI在線分析軟件ORFfinder，預(yù)測蛋白質(zhì)分子量和理論等電位使用ProtParam tool（http://web.expasy.org/protparam/）；預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)使用GOR4（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html）；預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)使用SWISS-MODEL（https://www.swissmodel.expasy.org/interactive）；堿基酸序列分析比對用NCBI的BlastN、BlastP，氨基酸多序列比對和構(gòu)建系統(tǒng)進化樹用DNAMAN 8.0和MEGA 7.0軟件。

1.5 MATE基因的表達(dá)量分析

參照TSE202[2xT5 Fast qPCR Mix（SYBR Green I），擎科]的說明書進行熒光定量PCR 分析，以GAP?DH基因作為內(nèi)參基因，對鋁脅迫不同時期的葡萄葉片MATE基因表達(dá)量進行熒光定量，引物序列見表1。以合成的cDNA 作為模板，按照2×T5 Fast qPCR Mix（SYBR Green I）試劑盒的說明書進行操作，反應(yīng)體系為2×T5 Fast qPCR Mix（SYBR Green I）10μL、上下游引物各0.8μL、cDNA 1.0μL，加Nuclease-free Water至20μL。熒光定量PCR 反應(yīng)程序為：預(yù)變性95 ℃1 min；循環(huán)階段95 ℃10 s，60 ℃5 s，72 ℃10 s，40 個循環(huán)；熔解階段95 ℃15 s，60 ℃1 min、95 ℃15 s、0.3 ℃/20 s。待反應(yīng)結(jié)束后進行熒光值變化曲線和溶解曲線分析。

表1 研究所用引物序列Tab.1 Sequence of primers in this research

1.6 生理指標(biāo)的測定

通過雙組分光光度法測定丙二醛含量，通過氮藍(lán)四唑光還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，通過愈創(chuàng)木酚-H2O2顯色法測定過氧化物酶（POD）活性[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄MATE基因ORF序列的克隆

分別從‘紅地球’和‘貝達(dá)’葉片中提取總RNA后，使用核酸蛋白檢測儀測得濃度分別為561.2μg/mL和603.6μg/mL，A260/A280分別為1.81和1.78，說明所提取的RNA 純度較高，可直接將其保存于-80 ℃冰箱中備用。以逆轉(zhuǎn)錄得到的‘紅地球’和‘貝達(dá)’cDNA為模板，用特異性引物擴增出長度均為1 800 bp 左右的條帶，與目標(biāo)條帶的大小一致（圖1）。將二者的克隆結(jié)果送到北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序，發(fā)現(xiàn)二者的序列長度均為1 794 bp，序列與轉(zhuǎn)錄組獲得的序列一致，通過DNAMAN 8.0分析得出其編碼的氨基酸均為597個和1個終止密碼子（圖2和圖3）。

2.2 MATE氨基酸序列的理化性質(zhì)

用ProtParam tool 在線工具對‘紅地球’和‘貝達(dá)’的MATE 多肽鏈氨基酸數(shù)目、分子式、等電點、相對分子量等進行預(yù)測。在‘紅地球’中，MATE基因共編碼597 個氨基酸，分子式為C3133H4918N838O820S26，分子質(zhì)量為68.28 ku，理論等電點（pI）為10.15，含9 735 個原子；在‘貝達(dá)’中，MATE基因共編碼597 個氨基酸，分子式為C3162H4905N837O848S19，分子量為68.82 ku，理論等電點（pI）為9.92，含9 771個原子。

2.3 MATE蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖1 葡萄MATE基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 The gel electrophoresis PCR product ofMATEin grape

圖2 ‘紅地球’的MATE基因cDNA全長序列及氨基酸序列Fig.2 MATEgene cDNA and amino sequence of‘Red Globe’

蛋白多肽鏈本身的折疊和盤繞方式即蛋白的二級結(jié)構(gòu)。用GOR4對MATE基因編碼的蛋白二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果如圖4所示：在組成‘紅地球’MATE蛋白的597個氨基酸中，無規(guī)則卷曲（Cc）占52.43%、α-螺旋（Hh）占26.97%、折疊延伸鏈（Ee）占20.60%；在組成‘貝達(dá)’MATE 蛋白的597 個氨基酸中，無規(guī)則卷曲（Cc）占49.73%、α-螺旋（Hh）占33.21%、折疊延伸鏈（Ee）占17.06%。兩個品種二級結(jié)構(gòu)中占比由高到低均有無規(guī)則卷曲、α-螺旋和折疊延伸鏈的規(guī)律，α-螺旋（Hh）對蛋白骨架主要起到穩(wěn)定作用，而無規(guī)則卷曲（Cc）結(jié)構(gòu)決定了蛋白質(zhì)的功能，兩個葡萄品種MATE蛋白無規(guī)則卷曲（Cc）和α-螺旋（Hh）所占比例最大，說明MATE基因?qū)ζ咸训慕舛酒鹬匾淖饔谩?/p>

圖3 ‘貝達(dá)’MATE基因全長序列及氨基酸序列Fig.3 MATEgene cDNA and amino sequence of‘Beta’

用SWISS-MODEL 在線工具進行預(yù)測后發(fā)現(xiàn)，葡萄MATE 蛋白的三維結(jié)構(gòu)由α-螺旋、β-折疊片、β-轉(zhuǎn)角等組成。如圖5 所示，‘紅地球’MATE 蛋白的三級結(jié)構(gòu)含有2 個α-螺旋、3 個β-折疊片、4 個β-轉(zhuǎn)角；‘貝達(dá)’MATE蛋白的三級結(jié)構(gòu)含有2個α-螺旋、3個β-折疊片、3個β-轉(zhuǎn)角。

圖4 MATE蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Secondary structure prediction of the MATE protein

2.4 MATE系統(tǒng)進化關(guān)系結(jié)果

利用生物分析軟件MEGA 7.0 構(gòu)建了‘紅地球’、‘貝達(dá)’、甘藍(lán)（Brassica oleracea）、油菜（Brassica na?pus）、擬南芥、紫花苜蓿、大豆（Glycine max）、飯豆、黑麥（Secale cereale）、高粱、水稻（Oryza sativa）、大麥（Hordeum vulgare）、小麥（Triticum aestivum）、棉花（Gossypium arboretum）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）、木豆（Cajanus cajan）、玉米等的MATE 同源蛋白的系統(tǒng)進化樹。發(fā)現(xiàn)‘紅地球’和‘貝達(dá)’的MATE 蛋白在氨基酸序列上具有高度同一性，相似度達(dá)91%。二者與大麥、小麥、高粱、水稻的同源性均在70%以上，與其他幾個種的同源性在40%～60%。此外，從系統(tǒng)進化樹上亦發(fā)現(xiàn)，‘紅地球’與‘貝達(dá)’在同一個分支上，表明二者的MATE基因具有極近的親緣關(guān)系；二者與高粱、水稻、大麥、小麥等的MATE蛋白氨基酸序列親緣關(guān)系較近，與棉花、蒺藜苜蓿、木豆、玉米的MATE蛋白氨基酸序列親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖6）。

圖5 MATE蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型預(yù)測Fig.5 Prediction results of the tertiary structure model of the MATE protein

圖6 葡萄MATE蛋白與其他植物MATE蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建Fig.6 Phylogenetic tree construction results of MATE protein and other plant MATE proteins

2.5 鋁脅迫期間葡萄MATE基因的相對表達(dá)量及MDA含量、抗氧化酶活性

通過qRT-PCR 分析發(fā)現(xiàn)，鋁脅迫前，‘紅地球’和‘貝達(dá)’的MATE基因相對表達(dá)量均在900 以下，但‘紅地球’比‘貝達(dá)’高130.09%；‘紅地球’MATE基因表達(dá)量的峰值在鋁脅迫的第14 天，比鋁脅迫前上升了281.08%，而到鋁脅迫的第28 天則下降了15.14%，此時比‘貝達(dá)’高1868.15%；‘貝達(dá)’MATE基因表達(dá)量的峰值在鋁脅迫的第7 天，比鋁脅迫前上升了83.88%，而到鋁脅迫的第28 天則降至比鋁脅迫前低52.28%（圖7）?？梢?，鋁脅迫下耐鋁性強的葡萄品種‘紅地球’MATE基因表達(dá)量高，上升幅度大，且峰值出現(xiàn)的晚。

丙二醛是細(xì)胞膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量與膜脂受氧化破壞的程度呈正相關(guān)。圖7所示，鋁脅迫前，‘紅地球’與‘貝達(dá)’的丙二醛含量相差不大；從鋁脅迫開始至脅迫的第21天，兩個品種均呈上升趨勢，且‘貝達(dá)’的含量始終高于‘紅地球’，到鋁脅迫的第21 天時，‘貝達(dá)’達(dá)到峰值，比‘紅地球’高18.45%；鋁脅迫的第21 天后，‘紅地球’丙二醛含量繼續(xù)上升，‘貝達(dá)’則開始下降，到鋁脅迫的第28 天時，‘紅地球’比‘貝達(dá)’高44.31%。

SOD和POD可通過分解活性氧來防止膜脂被氧化破壞，其活性與防止膜脂被氧化破壞的能力呈正相關(guān)。從圖7還可看出，鋁脅迫期間，‘紅地球’的SOD活性均不同程度的高于‘貝達(dá)’；從鋁脅迫開始至第7天，兩個品種的SOD活性均上升，且‘貝達(dá)’于鋁脅迫的第7天達(dá)到峰值，此時比鋁脅迫前高33.93%、比‘紅地球’低18.82%；‘紅地球’的峰值在鋁脅迫的第14天出現(xiàn)，此時比鋁脅迫前高61.20%、比‘貝達(dá)’高49.64%；到鋁脅迫的第28天，‘紅地球’比‘貝達(dá)’高97.41%。鋁脅迫前，‘貝達(dá)’的POD活性比‘紅地球’高140.20%，在鋁脅迫的第14天達(dá)到峰值，此時比鋁脅迫前高21.22%；而‘紅地球’從鋁脅迫開始至第28天均在上升，到第28天時共上升了226.47%，此時比‘貝達(dá)’高23.33%。可見，耐鋁性強的‘紅地球’在鋁脅迫下丙二醛含量和抗氧化酶活性的峰值出現(xiàn)較晚，細(xì)胞膜受破壞的程度低，這與MATE基因的表達(dá)量較一致。

圖7 鋁脅迫期間MATE基因的相對表達(dá)量及膜脂過氧化指標(biāo)的變化Fig.7 Relative expression ofMATEgene and changes of membrane lipid peroxidation indices during aluminum stress

3 討論與結(jié)論

全世界的耕地約有35%為酸性土壤[2]，而我國南方地區(qū)幾乎全為酸性土壤[3]。這些地區(qū)起源的植物為適應(yīng)環(huán)境而進化出多種耐鋁機制，如分泌有機酸就是其耐鋁機制之一[10-12]。植物感受到鋁脅迫信號后立即激活細(xì)胞膜上的H+-ATPase酶，然后通過把大量H+泵到細(xì)胞外形成質(zhì)子電化學(xué)梯度，使大量檸檬酸從檸檬酸通道蛋白中排出，從而使其耐鋁性提高[24]。檸檬酸通道蛋白的合成受檸檬酸通道蛋白基因控制，第一個由鋁誘導(dǎo)編碼檸檬酸通道蛋白的基因是在高粱中發(fā)現(xiàn)的SbMATE基因[17]，隨后相距發(fā)現(xiàn)了擬南芥AtMATE基因[19]、小麥TaMATE1基因[25]、玉米ZmMATE基因[16]和丹波黑大豆GmMATE基因[26]。據(jù)報道[27]，把耐鋁性強的大麥品種的MATE基因轉(zhuǎn)入耐鋁性弱的大麥和小麥品種中，轉(zhuǎn)基因植株的檸檬酸分泌量增多，耐鋁性明顯增強。這些為探究葡萄MATE基因提供了研究思路和理論依據(jù)。

在前期研究探明了‘紅地球’的耐鋁毒能力強于‘貝達(dá)’的基礎(chǔ)上，本研究分別克隆出了二者的MATE基因，分別命名為VvMATE和VrlMATE基因。MATE基因在植物的耐鋁性中起著重要作用，這在擬南芥[19]、高粱[17]和玉米[16]等多種作物中均有報道。張寶云[19]發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿由MsMATE基因編碼的MsMATE通道蛋白定位于質(zhì)膜上，鋁脅迫下促進檸檬酸分泌，可推測本研究由VvMATE和VrlMATE基因編碼的VvMATE 蛋白和VrlMATE 蛋白亦定位于質(zhì)膜上且具有響應(yīng)鋁脅迫分泌檸檬酸的功能。進化分析表明，兩個葡萄品種‘紅地球’VvMATE 蛋白與‘貝達(dá)’VrlMATE 蛋白的親緣關(guān)系最近，同源性達(dá)91%，二者與大麥HvMATE、小麥TaMATE、高粱SbMATE 和水稻OsMATE 的同源性均在70%以上，與甘藍(lán)BoMATE、油菜BnMATE、紫花苜蓿MsMATE 和大豆GmMATE 等的同源性僅40%～60%不等?？梢?，不同植物MATE蛋白的氨基酸序列同源性相對較低，這與前人的研究結(jié)果相似[28-29]，且不同物種間MATE 蛋白氨基酸具有較高的保守性。

鋁脅迫可調(diào)控絕大多數(shù)植物MATE基因的表達(dá)，如鋁毒脅迫下高粱SbMATE基因[17]、擬南芥AtMATE基因[19]、玉米ZmMATE基因[16]及丹波黑大豆GmMATE2基因[26]的表達(dá)量均顯著增高，但亦有研究報道[30]，鋁脅迫下，大豆GmMATE基因的表達(dá)量并沒有明顯的變化。本研究中，在整個鋁脅迫期間，耐鋁性強的‘紅地球’的MATE基因表達(dá)量遠(yuǎn)高于耐鋁性弱的‘貝達(dá)’；在鋁脅迫的前14 d，‘紅地球’的VvMATE基因表達(dá)量均大幅度上升，但從脅迫的第14天至第28天，則略有下降趨勢；而‘貝達(dá)’的VrlMATE基因表達(dá)量僅在鋁脅迫前7 d 略有上升。整個鋁脅迫期間，‘紅地球’的丙二醛含量和POD 活性一直上升，SOD 活性則大幅度上升后又緩慢下降，說明該品種耐鋁性強的原因除了VvMATE基因的高表達(dá)量使其分泌大量檸檬酸外，抗氧化酶活性增強使細(xì)胞膜受氧化破壞程度較輕也是一個重要的原因。

綜上，本研究克隆了兩個葡萄品種‘紅地球’和‘貝達(dá)’的VvMATE和VrlMATE基因，二者的序列長度均為1 794 bp，編碼597 個氨基酸；二者的分子質(zhì)量分別為68.28 ku 和68.82 ku，理論等電點（pI）分別為10.15 和9.92?！t地球’和‘貝達(dá)’的二級結(jié)構(gòu)各組分占比由高到低均為無規(guī)則卷曲、α-螺旋>折疊延伸鏈，三級空間結(jié)構(gòu)由α-螺旋、β-折疊片和β-轉(zhuǎn)角等組成。系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，VvMATE和VrlMATE的同源性為91%，二者與大麥HvMATE、小麥TaMATE、高粱SbMATE 和水稻OsMATE 的同源性均在70%以上。此外，鋁脅迫下，兩個葡萄品種的MATE基因表達(dá)量均先上升后下降，其中耐鋁性強的‘紅地球’MATE基因表達(dá)量與抗氧化酶的上升幅度均大于耐鋁性弱的‘貝達(dá)’。