姚鵬梅，劉倩倩，金 婷，唐富天，劉 義

(錦州醫(yī)科大學(xué) 1. 附屬第一醫(yī)院內(nèi)科，2. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧，錦州 121001；3. 蘭州大學(xué)第二醫(yī)院心血管研究所，甘肅，蘭州 730030)

原花青素屬于多酚類黃烷醇，由兒茶素和(或)表兒茶素組成的單聚物或多聚合物[8-9]。B型原花青素(procyanidins type B，PCB)主要存在于水果和蔬菜中[10]，食用富含PCB的飲食可降低肥胖、2型糖尿病和心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[11]。炎癥反應(yīng)是上述疾病的重要病理特征[12]，PCB對(duì)心血管疾病的保護(hù)作用與其抗炎活性密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，原花青素B2(procyanidins type B2, PCB2)對(duì)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷有明顯的保護(hù)作用[11]，該作用與抑制NLRP3炎性小體活化和氧化應(yīng)激有關(guān)。本研究旨在研究PCB2對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 H9c2心肌細(xì)胞系，購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2試劑 PCB2(批號(hào)：365358)和H2O2(批號(hào)：323381)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。NLRP3(批號(hào)：ab263899)、caspase-1(批號(hào)：ab238979)、IL-1β(批號(hào)：ab9722)和IL-18(批號(hào)：ab71495)以及GAPDH(批號(hào)：ab8245)抗體購(gòu)自Abcam公司。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH，批號(hào)：A020-2-2)活性、丙二醛(malondialdehyde，MDA，批號(hào)：A003-1-2)含量、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC，批號(hào)：A015-1-2)、SOD(批號(hào)：A001-3-2)、CAT(批號(hào)：A007-1-1)和GSH-Px(批號(hào)：A005-1-2)活性測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物技術(shù)公司。二氫乙啶(dihydroethidium，DHE，批號(hào)：D1168)熒光染料購(gòu)自上海浩然生物技術(shù)有限公司。

1.2儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞分組 將H9c2細(xì)胞分為5組：對(duì)照組(Control)、H2O2組、H2O2+PCB2(5 mg·kg-1)組、H2O2+PCB2(15 mg·kg-1)組和H2O2+PCB2(45 mg·kg-1)組。

1.3.2細(xì)胞活力測(cè)定 用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]還原法檢測(cè)細(xì)胞活力。將細(xì)胞接種于96孔板中，密度為50 000個(gè)細(xì)胞/孔。在每個(gè)孔中加入100 μL MTT(2 g·L-1PBS)，37 ℃孵育4 h，加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)后在550 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度。結(jié)果以細(xì)胞存活率百分比表示，對(duì)照細(xì)胞為100%。

1.3.3細(xì)胞毒性測(cè)定 使用試劑盒測(cè)定培養(yǎng)基中LDH的活性。

1.3.4MDA測(cè)定 以硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)反應(yīng)產(chǎn)物表示MDA。

1.3.5細(xì)胞內(nèi)ROS測(cè)定 用DHE評(píng)價(jià)細(xì)胞內(nèi)活性氧生成。用稀釋后的0.01 mol·L-1DHE在PBS中37 ℃孵育30 min，然后用PBS洗滌細(xì)胞2次。在激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm和發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm下，測(cè)量熒光強(qiáng)度。

1.3.6SOD活性測(cè)定 采用Marklund和Marklund(1974)描述的方法測(cè)量SOD活性。反應(yīng)混合物含有Tris-DTPA(pH 8.2)、0.15 mmol·L-1鄰苯三酚和10 mmol·L-1HCl。用分光光度計(jì)在420 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

1.3.7CAT活性測(cè)定 過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定采用Aebi(1984)所述的方法。將總提取物樣品加到50 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)中。用分光光度計(jì)在240 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

1.3.8谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性 GSH-Px活性測(cè)定采用Paglia和Valentine法(1967)。將提取物樣品與50 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)、4 mmol·L-1疊氮化鈉、1 mmol·L-1EDTA、4 mmol·L-1GSH、27 U谷胱甘肽還原酶和0.2 mmol·L-1NADPH孵育4 min。用分光光度計(jì)在340 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

1.3.9蛋白質(zhì)提取和蛋白質(zhì)印跡 用含有50 mmol·L-1HEPES、5 mmol·L-1EDTA、100 mmol·L-1NaCl、1% Triton X-100和蛋白酶抑制劑混合物的裂解緩沖液提取細(xì)胞蛋白。用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。樣品在SDS-PAGE上分離并轉(zhuǎn)移到PVC膜上。用抗NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的抗體在TBS-T緩沖液中于48 ℃孵育過(guò)夜，然后用HRP結(jié)合的抗體孵育1 h。

2 結(jié)果

2.1 PCB2對(duì)H2O2所致H9c2細(xì)胞損傷的影響與Control組相比，H2O2處理的H9c2細(xì)胞活力降低(Fig A)，而培養(yǎng)基中的LDH活性增加(Fig B)。而與H2O2組相比，PCB2劑量依賴性地提高細(xì)胞活力，降低LDH活性，表明PCB2對(duì)H9c2所致的細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。

2.2 PCB2對(duì)H2O2所致H9c2細(xì)胞中炎性小體蛋白表達(dá)的影響與Control組相比，用H2O2處理的H9c2細(xì)胞中NLRP3，caspase-1，IL-1β和IL-18(Fig 2A，2B)蛋白表達(dá)增加。與H2O2組相比，PCB2能夠下調(diào)細(xì)胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)，且該作用有劑量依賴性。

2.3 PCB2對(duì)H2O2所致H9c2細(xì)胞中ROS和MDA含量的影響與Control組相比，用H2O2處理的H9c2細(xì)胞中ROS(Fig 3A, 3B)和MDA的產(chǎn)生增加(Fig 3C)。與H2O2組相比，PCB2能夠降低細(xì)胞中ROS和MDA含量，且該作用有劑量依賴性。

2.4 PCB2對(duì)H2O2所致H9c2細(xì)胞中抗氧化酶活性的影響結(jié)果顯示，與Control組相比，H2O2處理的細(xì)胞中T-AOC(Fig 4A)、SOD(Fig 4B)、CAT(Fig 4C)和GSH-PX(Fig 4D)的活性均降低。 而與H2O2組相比，PCB2能夠劑量依賴性地增加H9c2中T-AOC、SOD、CAT和GSH-PX的活性。

Fig 4 Effect of PCB2 on activities of T-AOC, SOD, CAT and GSH-PX in H9c2 cells treated with **P<0.01 vs control group; #P<0.05, ##P<0.01 vs H2O2 group

Fig 3 Effect of PCB2 on ROS and MDA content in H9c2 cells treated with **P<0.01 vs control group; #P<0.05, ##P<0.01 vs H2O2 group

Fig 1 Effect of PCB2 on cell viability and medium LDH activity of H9c2 treated with **P<0.01 vs control group; #P<0.05, ##P<0.01 vs H2O2 group

Fig 2 Effect of PCB2 on protein expression of NLRP3, caspase-1, IL-1β and IL-18 in H9c2 cells treated with **P<0.01 vs control group; #P<0.05, ##P<0.01 vs H2O2 group

3 討論

本研究結(jié)果顯示，PCB2能夠減輕H2O2引起的H9c2細(xì)胞損傷，降低細(xì)胞NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)，降低細(xì)胞MDA含量和ROS產(chǎn)生，增加T-AOC、SOD、CAT和GSH-Px活性。結(jié)果表明，PCB2通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和NLRP3炎性小體激活來(lái)保護(hù)H9c2細(xì)胞免受H2O2引起的損傷。這一發(fā)現(xiàn)揭示了PCB2保護(hù)心肌細(xì)胞損傷的新機(jī)制。

炎癥小體在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和心臟病方面起重要作用[13]。NLRP3炎性小體是一種包含胞內(nèi)受體(主要是NOD樣受體)、半胱天冬氨酸(caspase-1)前體和ASC蛋白的蛋白質(zhì)復(fù)合體[14]。本研究表明，與對(duì)照組細(xì)胞相比，H2O2處理的細(xì)胞NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)增加。而PCB2劑量依賴性地降低這些蛋白的表達(dá)。這些結(jié)果表明，PCB2能夠降低H9c2細(xì)胞中NLRP3炎性小體的活化。這些結(jié)果可以解釋為什么PCB2保護(hù)H9c2細(xì)胞免受H2O2造成的損害。與上述研究結(jié)果一致的是，有文獻(xiàn)報(bào)道，葡萄籽來(lái)源的原花青素通過(guò)抑制NLRP3炎性體而減輕痛風(fēng)癥狀[15]，PCB2通過(guò)抑制LPS誘導(dǎo)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞中NLRP3炎性體激活而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[8]。然而，PCB2抑制炎性小體的作用機(jī)制還不十分清楚。

有研究報(bào)道， H2O2通過(guò)增加ROS引起人血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥小體的活化，因?yàn)镈PI(ROS清除劑)能夠降低NLRP3炎性體激活，并且PCB2可以減少內(nèi)皮細(xì)胞中ROS的積累[7-8]。這一發(fā)現(xiàn)與ROS在其他類型細(xì)胞炎癥小體激活信號(hào)中的作用一致[7, 16]。ROS是細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)的正常代謝產(chǎn)物，而過(guò)量的ROS會(huì)引發(fā)促炎過(guò)程。PCB2具有很強(qiáng)的抗氧化性能，主要由于芳環(huán)含有豐富的羥基。另一方面，本研究和其他研究表明，PCB2還能夠增加抗氧化酶(包括SOD，CAT，GSH-GPx)活性[15, 17]。據(jù)報(bào)道，PCB2具有潛在的抗氧化活性，可用于預(yù)防、治療糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化等炎癥性疾病[8, 10, 11]。

總之，該研究表明PCB2通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和NLRP3炎性體激活來(lái)減弱H2O2引起的H9c2細(xì)胞損傷。