譚嘉安，劉英華，張根水，宜 全

(廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，廣東 廣州 511436)

心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF)是指在心肌缺血性損傷、部分外來(lái)性異物或全身性疾病的刺激下導(dǎo)致心肌組織發(fā)生嚴(yán)重炎癥反應(yīng)甚至壞死后出現(xiàn)心臟修復(fù)反應(yīng)。在心臟受到損傷后傷口愈合時(shí)，心肌成纖維細(xì)胞及其活化后的肌成纖維細(xì)胞起著關(guān)鍵作用：它們產(chǎn)生的纖維化瘢痕取代了受損組織。而纖維化瘢痕組織表現(xiàn)為堅(jiān)韌缺乏彈性，硬度明顯增加，順應(yīng)性明顯降低。因此可導(dǎo)致心臟的病理變化，例如心律失常、心力衰竭等[1]。受損心肌中細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)成分的積累是心肌纖維化過(guò)程的特點(diǎn)，正常情況下CFs合成與分泌少量纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、Ⅰ-型膠原蛋白(collagen-1，COL-1)，維護(hù)ECM的穩(wěn)態(tài)。然而，在心臟損傷和應(yīng)激刺激下，受損心肌會(huì)募集免疫細(xì)胞并釋放大量轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β (transcription growth factor-β，TGF-β)[2]。TGF-β1在多種器官和組織的纖維化中表達(dá)增加，并在調(diào)控細(xì)胞進(jìn)程以及ECM包括膠原、FN等起著重要作用[3-4]。在接受TGF-β信號(hào)后，靜止的CFs活化并且轉(zhuǎn)變?yōu)镸Fs，表現(xiàn)出加劇的增殖，遷移和收縮能力，以及過(guò)度分泌FN和COL-1的能力[5]?；罨腃Fs還通過(guò)產(chǎn)生粘著相關(guān)蛋白促使ECM重塑及在胞外堆積[6]。這些變化共同導(dǎo)致了纖維化心臟的病理變化。因此，靶向受損心肌中的ECM成分蛋白的積累有益于緩解或治療心臟纖維化疾病。

和厚樸酚(honokiol，HKL)提取自中草藥厚樸，具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒的作用，且還具有抗炎抗氧化等藥理作用，能夠用于治療心律失常、心腦缺血/再灌注損傷[7]，因此和厚樸酚在治療心腦血管疾病方面表現(xiàn)出巨大的潛力。

本實(shí)驗(yàn)使用TGF-β1處理誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞活化遷移，構(gòu)建體外的心肌纖維化模型[8]。研究和厚樸酚對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠乳鼠心肌成纖維細(xì)胞遷移的作用，檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白FN、COL-1表達(dá)的影響。為心肌纖維化疾病的藥物治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新生d 1～3的SD大鼠乳鼠，雌雄不限，購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(粵)2016-0168。

1.1.2試劑 和厚樸酚(批號(hào)：F1904059，純度≥98%)購(gòu)于阿拉丁試劑有限公司；DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清(Gibco)；DMSO 、MTT、TGF-β1(批號(hào)：0331323)購(gòu)于Novoprotein公司；Vimentin的一抗購(gòu)于Santa Crus； GAPDH一抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)于中杉金橋；FN的一抗、COL-1的一抗的一抗均購(gòu)于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；ECL發(fā)光液(CST)；

1.1.3儀器 三氣培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo)；超凈工作臺(tái)(蘇州儀器廠)；電子天平(德國(guó)BP2215)；-80 ℃低溫冰箱(美國(guó)Thermo)；酶標(biāo)儀(德國(guó)Beckmen)；熒光正置顯微鏡(日本Nikon公司)；低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Hettic)；垂直電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Red公司)；自動(dòng)洗片機(jī)(美國(guó)Kodak)。

1.2 方法

1.2.1SD乳鼠CFs的提取與培養(yǎng) 全程在無(wú)菌操作臺(tái)中進(jìn)行，所有器材提前30 min照射紫外消毒。取新生d 1～2的SD乳鼠，酒精清洗3遍移至超凈臺(tái)，倒“T”形打開(kāi)胸腔，輕輕擠壓乳鼠背部令心臟從開(kāi)口處露出，使用鑷子快速取下心臟，使用預(yù)冷 HBSS緩沖液清洗干凈，然后移至100 mm 培養(yǎng)皿中修剪，并收集心室組織，繼續(xù)使用HBSS緩沖液沖洗，剪碎直到所有大的心臟組織碎片被分散為止；加入8 mL的HBSS、2 mL的0.25胰酶(控制HBSS ∶胰酶=4 ∶1) ，封口膜封口至4 ℃冰箱消化14～16 h后取出。吸取所有組織液體混合物至15 mL離心管中，加入2 mL血清終止消化；37 ℃水浴復(fù)溫后，加入25XⅡ型膠原酶置于 37 ℃水浴搖床搖晃45 min；取出，吸取離心管中的混合液到200 目濾網(wǎng)中過(guò)濾到50 mL 離心管中，加入適量 L-15 細(xì)胞培養(yǎng)液到剩余組織中吹打取上清過(guò)濾，確保多數(shù)細(xì)胞從消化后的組織中解離至細(xì)胞懸液。離心(1 000 r·min-1，室溫，5 min)，棄去上清，加入5 mL 10% FBS的高糖培養(yǎng)基，使用移液槍輕輕吹打混勻，然后均勻接種至100 mm 直徑的培養(yǎng)皿中，置 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 45 min，小心吸棄皿中液體，更換為10% FBS。此時(shí)培養(yǎng)皿中貼壁細(xì)胞為心肌成纖維細(xì)胞，這個(gè)過(guò)程為差速貼壁分離。通過(guò)傳代再差速純化心肌成纖維細(xì)胞。

1.2.2CFs的形態(tài)以及純度鑒定 將差速貼壁分離分離的CFs培養(yǎng)至90%以上進(jìn)行傳代，然后以1.0×104個(gè)/皿接種至共聚焦小皿中，24 h后更換10%FBS。在細(xì)胞匯合度達(dá)到60%時(shí)，使用預(yù)熱的PBS緩沖液洗去培養(yǎng)基，再用4%的多聚甲醛固定20 min。用PBS緩沖液輕輕晃洗4次吸干。1%的曲通破膜30 min，處理然后用PBS緩沖液洗去殘余曲通；100 mmol甘氨酸封閉，PBS緩沖液清洗5 min×3次；5% BSA封閉1 h后加入心肌成纖維細(xì)胞骨架成分Vimentin(1 ∶500)一抗，4 ℃過(guò)夜。d 2取出后使用PBST清洗5 min×4次，室溫孵育相應(yīng)的熒光二抗1 h，后面過(guò)程均避光操作。然后用PBST清洗5 min×3次；加入細(xì)胞核染液DAPI室溫孵育10 min，先用PBST清洗5 min×3次，再用超純水輕輕晃洗2次；往共聚焦小皿中加入適量的抗淬滅劑，于正置熒光顯微鏡下分析樣本，拍照記錄。

1.2.3MTT檢測(cè)不同濃度的TGF-β1對(duì)CFs活力的影響 將處于指數(shù)增長(zhǎng)期的CFs進(jìn)行消化傳代處理，然后以7×103/孔進(jìn)行接種至96孔板，放置三氣培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。設(shè)置對(duì)照組(正常成纖維細(xì)胞)，TGF-β1組(2.5、5、10、20、40 pg·L-1)，培養(yǎng)24 h。每孔加入100 μL用PBS稀釋的0.5 g·L-1的MTT溶液，在三氣培養(yǎng)箱中孵育3～4 h。從培養(yǎng)箱中取出，可使用0.5 mL規(guī)格的注射器小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加150 μL DMSO，震蕩10 min，使孔內(nèi)紫色結(jié)晶物充分溶解。于490 nm處測(cè)定吸光度(OD)值。

1.2.4劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)和厚樸酚對(duì)CFs遷移的影響 所有器材均經(jīng)過(guò)紫外消毒30 min。在6孔板背部橫著用marker筆畫(huà)5道直線(xiàn)，大約每道間隔0.5 cm。將處于指數(shù)增長(zhǎng)期的心肌成纖維進(jìn)行消化傳代處理，然后以5×105/孔均勻接種于6孔板中，放置三氣培養(yǎng)箱培養(yǎng)。設(shè)置對(duì)照組(正常成纖維細(xì)胞)，模型組(僅加入10 pg·L-1的TGF-β1)，給藥組(含10 pg·L-1TGF-β1并依次加入1、2.5、5 μmol·L-1的和厚樸酚)，對(duì)照藥組(小檗堿10 μmol·L-1)，在0.1%FBS條件下培養(yǎng)，24 h后在正置顯微鏡下拍照記錄。通過(guò)比較0 h刮擦面積百分比之間的差異來(lái)分析數(shù)據(jù)。

1.2.5激光共聚焦檢測(cè)纖連蛋白FN的表達(dá) 將差速貼壁分離分離的CFs培養(yǎng)至90%以上進(jìn)行傳代，然后以1.0×104個(gè)/皿接種至共聚焦小皿中，培養(yǎng)24 h。設(shè)置對(duì)照組，模型組(10 pg·L-1的TGF-β1)，給藥組(TGF-β1+HKL5 μmol·L-1),給藥處理24 h后取出。按照“1.2.2”項(xiàng)所述的免疫熒光步驟操作，孵育Vimentin(1 ∶500)、FN(1 ∶400)一抗4 ℃過(guò)夜。d 2取出后使用PBST清洗5 min×4次，熒光二抗室溫避光孵育45 min，后面步驟參見(jiàn)“1.2.2”。最后加入抗淬滅劑，于正置熒光顯微鏡下分析樣本，拍照記錄。

1.2.6Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá) 將差速貼壁分離的CFs培養(yǎng)至90%以上進(jìn)行傳代，然后以4.5×105個(gè)/皿接種至60 mm培養(yǎng)皿中，24 h后更換10% FBS。待細(xì)胞匯合度為75%時(shí)進(jìn)行給藥處理，設(shè)置分組對(duì)照組、模型組(10 pg·L-1TGF-β1)、給藥處理組(1、2.5、5 μmol·L-1的和厚樸酚)。放置三氣培養(yǎng)箱24 h后取出，預(yù)冷的PBS輕輕晃洗3次，使用濾紙吸干殘余水分，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解30 min，刮下離心收集上清。使用蛋白定量試劑盒測(cè)定待測(cè)樣品總蛋白濃度，制備蛋白上樣液。經(jīng)過(guò)上樣-電泳-轉(zhuǎn)膜的過(guò)程將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，使用體積分?jǐn)?shù)為3的BSA室溫封閉2 h。孵育一抗，F(xiàn)N(1 ∶500)、COL-1(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶5 000), 4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜5 min×3次。室溫孵育二抗1 h，TBST洗膜10 min×4次，ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 CFs的形態(tài)以及純度從Fig 1可以觀察到，大鼠乳鼠心肌成纖維細(xì)胞為扁平狀不規(guī)則的多邊形細(xì)胞，對(duì)多個(gè)視野下的細(xì)胞使用ImageJ進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)得到使用差速貼壁分離的得到的細(xì)胞中心肌成纖維占0.954 6±0.017 0。

2.2 TGF-β1對(duì)CFs增殖的影響如Fig 2所示，與Control組比較，使用不同TGF-β1處理成纖維細(xì)胞24 h時(shí)，在10 pg·L-1時(shí)能夠明顯促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，我們采用TGF-β1為10 pg·L-1作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。

Fig 1 Morphology identification of CFs

Fig 2 Effect of different concentrations of TGF-β1 on cell activity n=3)*P<0.05 vs control

2.3 HKL對(duì)TGF-β1刺激后CFs遷移能力的影響劃痕實(shí)驗(yàn)中將所有組對(duì)應(yīng)同一個(gè)視野下的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)劃痕面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，采用TGF-β1處理的成纖維細(xì)胞傷口愈合更快(P<0.05)；與模型組(TGF-β1)組相比，和厚樸酚能夠抑制TGF-β1處理后的傷口愈合速率(P<0.01)，即和厚樸酚能夠抑制TGF-β1刺激后成纖維細(xì)胞遷移能力。

2.4 HKL對(duì)TGF-β1刺激后成FN蛋白分泌的影響Fig 4的免疫熒光結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，TGF-β1(10 pg·L-1)處理組FN蛋白熒光強(qiáng)度增加，而與TGF-β1組相比，HKL(5 μmol·L-1)組FN蛋白熒光強(qiáng)度減弱，提示和厚樸酚能夠抑制TGF-β1刺激后成纖維FN分泌。

Fig 3 Effect of different concentrations of HKL on CFs migration induced by TGF-β1 n=3)*P<0.05 vs control; #P<0.05, ##P<0.01 vs TGF-β1

Fig 4 Effect of HKL on FN secretion after TGF-β1 stimulation

2.5 CFs對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的CFs中FN、COL-1蛋白表達(dá)的影響如Fig 5所示，與空白對(duì)照組相比，使用TGF-β1處理后FN蛋白表達(dá)水平明顯增高(P<0.01)，給予和厚樸酚處理后，F(xiàn)N蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)。經(jīng)TGF-β1處理24 h后COL-1蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，給予和厚樸酚處理后能夠明顯降低COL-1蛋白表達(dá)(P<0.01)。

Fig 5 Effect of HKL on expression of FN and COL-1 induced by TGF-β1 n=3 )*P<0.05, **P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs TGF-β1

3 討論

活化的纖維細(xì)胞介導(dǎo)的纖維化組織重塑發(fā)生在大多數(shù)器官中，特別是在硬皮病、動(dòng)脈粥樣硬化、心力衰竭、肝硬化、腎纖維化和許多癌癥等主要疾病的末期。當(dāng)心臟在各種因素誘導(dǎo)下發(fā)生纖維化時(shí)能夠?qū)е滦穆墒С?、心功能紊亂、心力衰竭等不良后果。在纖維化過(guò)程中，成纖維細(xì)胞受到多種細(xì)胞因子的刺激后活化，而活化的成纖維細(xì)胞是主要的效應(yīng)細(xì)胞?；罨某衫w維細(xì)胞也稱(chēng)為肌成纖維細(xì)胞，是一類(lèi)高度收縮的細(xì)胞類(lèi)型，其特征是過(guò)多的沉積細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白，這也是纖維化發(fā)生的特點(diǎn)和標(biāo)志。纖維化是一個(gè)多種信號(hào)通路并存的過(guò)程，它與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)/Smad信號(hào)傳導(dǎo)，炎癥和氧化應(yīng)激信號(hào)傳導(dǎo)，腎素-血管緊張素系統(tǒng)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路和脂質(zhì)代謝都有關(guān)。其中最經(jīng)典的是TGF-β/Smad途徑，TGF-β/Smad級(jí)聯(lián)反應(yīng)由三元信號(hào)復(fù)合物組成，當(dāng)TGF-β1與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 受體Ⅱ(TGFβRⅡ)相互作用時(shí)，TGF-β1受體I被激活，繼而磷酸化細(xì)胞質(zhì)介體Smad2和Smad3，并與Smad4形成異源三聚體復(fù)合物，然后移位進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合共有序列，并調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，TGF-β1可以經(jīng)TGF-β/Smads信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)心肌成纖維細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)化、遷移和ECM的產(chǎn)生, TGF-β1是促M(fèi)F的最主要因素[9]。本研究通過(guò)使用TGF-β1刺激心肌成纖維細(xì)胞建立心肌纖維化的體外模型，在10 pg·L-1時(shí)能夠刺激成纖維增殖，同時(shí)劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在該濃度下成纖維細(xì)胞遷移速度增加，當(dāng)給予和厚樸酚處理后，能夠以濃度依賴(lài)的抑制成纖維的遷移[10]。在心臟纖維化過(guò)程中，心肌梗死等原因誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞大量增殖，隨后遷移到受損部位活化為肌成纖維[11]。當(dāng)心肌成纖維活化后會(huì)分泌FN及COL-1等細(xì)胞外基質(zhì)并沉積在細(xì)胞周?chē)?，并以此改變肌成纖維的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)微環(huán)境，從而影響心臟功能，最終導(dǎo)致心臟纖維化[12]。故抑制受損心臟中的成纖維的遷移和活化，可以改善細(xì)胞外基質(zhì)ECM的分泌沉積。

在我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，使用TGF-β1刺激成纖維細(xì)胞后，對(duì)FN蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記并通過(guò)共聚焦顯微成像技術(shù)觀察到，與空白對(duì)照組相比，成纖維細(xì)胞內(nèi)外的熒光更強(qiáng)烈，而在使用TGF-β1刺激的同時(shí)給予和厚樸酚處理，能夠減弱成纖維細(xì)胞內(nèi)外的熒光強(qiáng)度，該結(jié)果表明，和厚樸酚能夠抑制TGF-β1刺激后FN蛋白的分泌。盡管膠原蛋白是心臟中最豐富的ECM蛋白，但細(xì)胞纖連蛋白在心臟纖維化中起關(guān)鍵作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，纖連蛋白能夠與整合素、纖維蛋白等細(xì)胞表面受體相互作用，在基質(zhì)組織和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用中充當(dāng)橋接分子，當(dāng)FN蛋白聚合到細(xì)胞外基質(zhì)中才能使I型膠原蛋白沉積共同介導(dǎo)纖維化過(guò)程[13]。最近研究報(bào)道，在心力衰竭的體內(nèi)模型中，抑制FN聚合或心臟成纖維細(xì)胞基因表達(dá)可減弱MF的病理學(xué)特性，并改善不良的心臟重塑和纖維化[6]。同時(shí)還有研究表明，二甲雙胍能夠抑制博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化，機(jī)制是抑制胰島素樣生長(zhǎng)因子-1介導(dǎo)的FN蛋白、α-SMA、I型和III型膠原的產(chǎn)生進(jìn)而抑制小鼠肺纖維化[14]。因此，干預(yù)細(xì)胞FN蛋白的生成和沉積，能夠減輕心臟纖維化，改善心臟功能。

為量化和厚樸酚對(duì)TGF-β1刺激的成纖維細(xì)胞中FN蛋白以及COL-1蛋白表達(dá)變化，隨后我們使用TGF-β1刺激原代成纖維，并用高中低濃度的和厚樸酚給予治療。Western blot結(jié)果表明，與模型組相比，和厚樸酚能夠降低FN、COL-1蛋白的表達(dá)水平，這提示和厚樸酚可以減少TGF-β1誘導(dǎo)的CFs細(xì)胞外基質(zhì)蛋白FN和COL-1的分泌與沉積。多項(xiàng)研究表明，和厚樸酚能夠抑制多種器官纖維化，他們共同機(jī)制可能是通過(guò)TGF-β1/SMAD2/3信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)[15]。

綜上，我們發(fā)現(xiàn)HKL能夠減輕TGF-β1誘導(dǎo)的CFs的遷移，抑制成纖維在受損心肌部位的聚集和活化，從而影響FN蛋白、COL-1蛋白的分泌和沉積，最終改善心臟纖維化。因此，和厚樸酚對(duì)心肌纖維化過(guò)程中抑制FN、COL-1蛋白的沉積作用的發(fā)現(xiàn)，將為開(kāi)發(fā)新的抗心肌纖維化藥物提供實(shí)驗(yàn)參考。