王 廣，朱定國，，余愛民，程宏連，程 超

(1.湖北民族大學生物科學與技術學院，湖北恩施 445000；2.恩施硒谷科技股份有限公司，湖北恩施 445000；3.重慶市酒類管理協(xié)會，重慶 404100)

中國除了茶飲之外，大概再沒有一種液體能夠像酒一樣讓人嗜之若命，也再沒有一樣食品能夠像中國酒一樣與中華上下五千年文化一同源遠流長。隨著社會的不斷前進、發(fā)展，中國酒也在不斷地適應新的變化。從發(fā)酵酒到蒸餾酒再到露酒，從液態(tài)法發(fā)酵到固態(tài)法發(fā)酵，從高度化、烈性化、大眾化到低度化、健康化、定制化等等，無不反映著中國酒的發(fā)展歷程。在這一系列變化中尤以露酒最為明顯，露酒作為中國酒里面重要的一種，有著舉足輕重的地位。本文的復合型露酒主要以綿柔型小曲白酒為基酒[1]，桂花、絞股藍、藤茶為主要浸泡物，它不僅具備基酒所含有的酸、酯、醛、醇等多種物質(zhì)[2-3]，并且擁有擴張血管、降低顱內(nèi)壓力、降低膽固醇、預防心血管疾病等藥理功效[4-7]，此外，被浸泡物亦具備舒適的揮發(fā)油香氣[8-10]，富含黃酮、多酚、皂甙、多糖等[11-15]，具有抗氧化[16-18]，降血糖、血脂[19-21]，延緩衰老[22-24]，抗菌、消炎等諸多功效[25-28]，及其他營養(yǎng)功能。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品及耗材：綿柔型小曲白酒，恩施巴王酒業(yè)有限公司；藤茶（優(yōu)級），湖北仙芝堂生物科技有限公司；絞股藍（優(yōu)級），湖北仙芝堂生物科技有限公司；桂花（優(yōu)級），湖北仙芝堂生物科技有限公司；冰糖，上海財源來糖業(yè)有限公司；無水檸檬酸（食品級），濰坊英軒實業(yè)有限公司。

試劑：水楊酸（AR 級），國藥集團化學試劑有限公司；硫酸亞鐵（AR級），天津市福晨化學試劑有限公司；30%過氧化氫（AR級），國藥集團化學試劑有限公司；十二水合磷酸氫二鈉（AR級），國藥集團化學試劑有限公司；二水合磷酸二氫鈉（AR級），國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇（AR級），國藥集團化學試劑有限公司；過二硫酸鉀（AR級），國藥集團化學試劑有限公司；ABTS（色譜級），國藥集團化學試劑有限公司；DPPH（色譜級），國藥集團化學試劑有限公司。

儀器設備：紫外可見分光光度計（UV-9000S），上海元析儀器有限公司；電子天平（d=0.1 mg），賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；酒度計（0～100），德州潤昕實驗儀器有限公司；超純水設備，武漢品冠儀器設備有限公司；恒溫水浴鍋（SG），上海蘇豪智能系統(tǒng)有限公司；超聲波清洗儀（30 L），上海貝凱生物化工設備有限公司；Design-Expert 軟件，8.0.5b版本。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗流程（圖1）

1.2.2 實驗操作關鍵點

（1）實驗的露酒原酒配方主要以前期預實驗結果為依據(jù)，并同時結合浸泡產(chǎn)生的露酒感官品評（為主）而確定的配方。

（2）勾調(diào)時對露酒原酒先進行自然澄清操作；冰糖先配制成30.00%（m/v）溶液后再添加；檸檬酸配制成10.00%（m/v）溶液后添加。

（3）勾調(diào)配方過程中保證露酒原酒和調(diào)味劑比例（冰糖、檸檬酸）均以總體積確定，不足部分用蒸餾水補足100%。

（4）單因素試驗及成品露酒評價標準以感官品評為準（100 分制），為避免誤差將最低分控制在75分以上，最終得分為平均分。

（5）感官品評環(huán)境為：溫度16～26 ℃，濕度40%～70%，噪聲小于40 dB，燈光色溫6500 K，品酒杯容量50～55 mL、最大液面處容量15～20 mL的郁金香杯，品酒時間上午9:00—11:00。

1.2.3 優(yōu)化配方的單因素實驗

1.2.3.1 冰糖用量優(yōu)化試驗

基酒用量為50.00%，檸檬酸用量0.05%，冰糖添加量為2.00%、4.00%、6.00%、8.00%、10.00%。

1.2.3.2 基酒用量單因素試驗

檸檬酸用量為0.05 %、冰糖用量為6.00 %，基酒用量為30.00 %、40.00 %、50.00 %、60.00 %、70.00%。

1.2.3.3 檸檬酸用量優(yōu)化試驗

冰糖用量為6.00 %、基酒用量為50.00%，檸檬酸添加量為0.03 %、0.04 %、0.05 %、0.06 %、0.07%。

1.2.4 配方的響應面優(yōu)化

依據(jù)1.2.3 中單因素的實驗結果，利用響應面設計軟件（Design Expert）生成實驗設計參數(shù)表1，成品配方響應面實驗因素及水平。

表1 Box-Behnken Design實驗因素及水平

1.2.5 復合露酒對DPPH自由基的清除作用

配制2 mmol/L 的DPPH 溶液備用；將樣品稀釋為100 倍、500 倍、1000 倍、1500 倍、2000 倍后備用。取5 支潔凈的帶塞試管，依次加入2.00 mL 不同稀釋濃度的樣品溶液、2.00 mL DPPH 溶液，混合均勻后避光靜置30 min，然后在517 nm 測定吸光度值，DPPH自由基的清除率按照公式1計算[29]。

式中：Ac——2.00 mL DPPH 溶液+2.00 mL 無水乙醇溶液在517 nm處的吸光度值。

Ai——2.00 mL樣品溶液+2.00 mL DPPH溶液在517 nm處的吸光度值。

Aj——2.00 mL 樣品溶液+2.00 mL 無水乙醇溶液在517 nm處的吸光度值。

1.2.6 復合露酒對ABTS+·自由基的清除作用

ABTS+·儲備溶液制備：取5.00 mL 7 mmol 的ABTS+·溶液、88.00 μ L 140 mmol 的過硫酸氫鉀，混合均勻，避光貯存過夜，得ABTS+·儲備液，使用前用45%vol 乙醇稀釋至734 nm 吸光度值為0.70±0.02。

樣品測定：將待測樣品依次稀釋為500 倍、1000 倍、1500 倍、2000 倍、2500 倍后備用；取潔凈的帶塞試管，依次加入1.00 mL 稀釋的樣品、3.00 mL ABTS+·儲備溶液，混合均勻、反應6 min后在734 nm處測定其吸光度值[29]。并按照公式2 計算ABTS+·的清除率。

式中：A0——1.00 mL 緩沖溶液+3.00 mL ABTS+·溶液在734 nm處的吸光度值。

A1——1.00 mL 樣品溶液+3.00 mL ABTS+·溶液在734 nm處的吸光度值。

A2——1.00 mL 樣品溶液+3.00 mL 緩沖溶液在734 nm處的吸光度值。

1.2.7 復合露酒對·OH自由基的清除作用

溶液制備：9 mmol 硫酸亞鐵的制備，精確稱取2.50 g 的硫酸亞鐵并定容到1 L，備用；9 mmol 水楊酸的制備，精確稱取1.243 g 的水楊酸，并用無水乙醇溶解、定容到1 L，備用；8.8 mmol 的過氧化氫溶液制備，量取0.90 mL 的30 %過氧化氫溶液于1 L棕色容量瓶中，并定容備用。

樣品測定，按照表2 依次加入樣品及反應溶劑，于37 ℃條件下進行水浴15 min，然后于700 nm處測定吸光度值[29]，并按照公式3 計算·OH 的清除率。

式中：Az——空白組在700 nm處的吸光度值。

Ax——樣品組在700 nm處的吸光度值。

AY——不加過氧化氫組在700 nm處的吸光度值。

1.2.8 露酒的品評判定標準

依據(jù)國家標準GB/T 27588—2011《露酒》、GB/T 33404—2016《白酒感官品評導則》、GB/T 33405—2016《白酒感官品評術語》、GB/T 33406—2016《白酒風味物質(zhì)閾值測定指南》、GB 2757—2012《食品安全國家標準蒸餾酒及其配制酒》《白酒生產(chǎn)技術全書》（中國輕工業(yè)出版社/沈怡方著）、《白酒品酒師手冊》（中國輕工業(yè)出版社/賴高淮著）等專業(yè)文件及書籍制定評分判定表格，由1 名國家白酒評委、3 名省級白酒評委及10 名普通消費者進行盲評打分（其中國家評委評分比重占40%，省級評委評分比重占30 %，普通消費者30 %，總分100分），其復合型露酒感官定量評分表及對應的露酒風味輪見表3和圖2。

表2 ·OH體外抗氧化體系測定表(mL)

表3 復合型露酒感官定量評分表

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

通過單因素試驗分析發(fā)現(xiàn)，成品露酒的勾調(diào)實驗中，品評得分最高分分別出現(xiàn)在糖含量為4.00%到糖含量為8.00 %的區(qū)間；酸用量則在0.04 %到0.06 %之間；基酒用量在50.00 %到60.00 %之間（圖3）。

2.2 響應面實驗結果

響應面實驗配方由軟件（Design-Expert）自動生成，其配方品評實驗結果見表4；響應面實驗結果方差分析見表5；響應面各因素對品評實驗結果3D效果圖見圖4、圖5、圖6。

表4 Box-Behnken Design響應面實驗方案及結果

以品評得分為響應值，利用Design-Expert 軟件可擬合出3 個影響因素的回歸方程為：品評分=84.70+0.45A+1.20B-2.40C+0.10AB-0.90BC-0.75A2-2.95B2-1.35C2。通過Design-expert 軟件分析可得出，此方程R=0.928，說明此方程可很好反映3個影響因素對露酒品評分的影響。利用軟件分析可得出露酒最佳配方A 為1、B 為0.35、C 為-0.97 水平，即基酒比例為60.00 %，冰糖用量為6.70 %，檸檬酸用量為0.04%。

表5 響應面實驗方差分析

以預測的配方組合制備露酒，具體見圖7。所得到的復合型露酒顏色橙黃清亮，具有桂花與絞股藍復合香氣且香氣舒適、濃郁，口味馥郁，回味具有藤茶特有的甘苦感，綜合酒精度在25%vol，典型風格突出的特點。

2.3 抗氧化實驗結果

對該成品酒進行體外不同的抗氧化體系（DPPH 體系、ABTS+·體系、·OH 自由基體系）實驗，實驗結果如圖8所示。

通過圖8可以發(fā)現(xiàn)，3 個體外抗氧化體系均呈現(xiàn)隨著成品酒被稀釋的倍數(shù)越大，酒的體外抗氧化能力（清除率）越低的趨勢，其中對于DPPH 自由基體外抗氧化體系，其體外抗氧化能力在樣品被稀釋100 倍和500 倍時，分別為92.44%和77.00%，但是當樣品稀釋倍數(shù)為1000 倍以上時，樣品對DPPH 自由基的體外抗氧化能力在30%以下；針對ABTS 體外抗氧化體系，體外抗氧化能力在樣品被稀釋1000倍以上時小于50 %，但是同樣是樣品被稀釋1000倍和2000 倍時，ABTS 體系的體外抗氧化能力分別為52.48 %和30.86 %，均高于DPPH 自由基體系的29.75%和15.35%；對于OH 自由基體系而言，樣品被稀釋倍數(shù)大于20 倍時，其體外抗氧化能力為56.52 %，當稀釋倍數(shù)逐漸增加為100 倍時，體外抗氧化能力為30.89%。

3 小結

通過響應面實驗得出最優(yōu)的復合型露酒的配方：基酒比例為60.00 %，冰糖用量為6.70 %，檸檬酸用量為0.04%（水補足100%），以此配方制備的成品露酒具有酒精度低，易入口、桂花香馥郁，口感回甘等一系列特點。通過對該成品露酒的不同體系體外抗氧化實驗，發(fā)現(xiàn)該復合型露酒對ABTS+·、DPPH 和·OH 具有較強的清除作用。且有以下幾點思考及說明：

（1）該成品酒基于響應面法的配方選定實驗中，消費者盲評小組年齡在25～30 歲之間，在口感上均偏向于苦味較小的配方（這一點可以由響應面結果的3D 圖直觀反映出來），而專業(yè)評委則偏向酒度偏高、香味馥郁的配方組，如何建立兩者之間的平衡紐帶，是我們下一步研究的重點。另限于地理條件，該成品酒沒有在更大范圍內(nèi)進行盲評，考慮到酒具有一定的地域性，所以該復合型成品露酒的后續(xù)研究將偏向于地域適應性方面。

（2）實驗中的原材料，尤其是基于恩施本地的藤茶和絞股藍，材料本身不僅對人體具有抗氧化、清除自由基的生物活性成分（黃酮、多酚、皂甙、多糖等），而且由于恩施特殊的地理位置（國內(nèi)唯一探明的獨立硒礦床），極有可能還富含富硒的各種大分子物質(zhì)。諸如硒多糖、硒多肽等，這方面的研究可以作為一個全新的子課題。

（3）對于該復合型成品露酒的體外抗氧化實驗中采取了不同的稀釋濃度，但是在實際生產(chǎn)中及消費中，該復合型露酒不會再被稀釋（即以成品型露酒直接飲用），所以它的體外抗氧化能力應該分別高于90 %（DPPH 體系）、80 %（ABTS+·體系）和86 %（·OH 自由基體系），同時由于該成品露酒暫不定位于保健品及其不可能長期大量飲用的習慣，所以未進行陽性對照試驗，同時該成品酒的體外抗氧化能力分別由被浸泡物（桂花、藤茶和絞股藍）和調(diào)味劑（檸檬酸）貢獻多少，尚待進一步進行系統(tǒng)研究。

（4）該成品露酒基于恩施地區(qū)富硒特性的研究以及以此建立其特征圖譜有待于下一步研究，同時該實驗中的復合型露酒原酒生產(chǎn)工藝因涉及到專利知識產(chǎn)權，不便公開，敬請諒解。