王麗霞 李生龍 陳碭桐 王君

摘要 [目的]為了更加簡(jiǎn)便快速地檢測(cè)出產(chǎn)品中泰樂菌素的含量，建立了泰樂菌素高效液相色譜檢測(cè)方法。[方法]檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm，流速 0.6? mL/min，進(jìn)樣量20 μL，色譜柱選用C 18，柱溫30 ℃，流動(dòng)相選用乙腈∶甲醇∶0.025 mol/L磷酸二氫銨=25∶30∶5。[結(jié)果]進(jìn)樣濃度在0.5～50.0 μg/mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系（R2=0.999 9）;回收率較高，均在80%以上，變異系數(shù)在允許范圍內(nèi)（0～5%）;儀器重現(xiàn)性試驗(yàn)中，對(duì)照品連續(xù)進(jìn)樣10次，峰面積RSD為1.55%。[結(jié)論]高效液相色譜法檢測(cè)泰樂菌素及其制劑的含量準(zhǔn)確可靠，穩(wěn)定性、重復(fù)性好，精密度高，適用于獸藥企業(yè)對(duì)泰樂菌素及其制劑質(zhì)量自控。

關(guān)鍵詞 泰樂菌素;高效液相色譜法;檢測(cè)方法;含量測(cè)定

中圖分類號(hào) S859.84? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2020）20-0206-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.20.055

Establishment of HPLC Method for Determination of Tylosin

WANG Li-xia，LI Sheng-long，CHEN Dang-tong et al （Anhui Huaao Biotechnology Co.，Ltd.，Hefei，Anhui 231131）

Abstract [Objective] In order to detect the tylosin content in the product more simply and quickly， a tylosin high performance liquid chromatography method was established.[Method]The detection wavelength was 290 nm，and the flow rate was 0.6? mL/min，and the injection volume was 20 μL，and the liquid chromatography was carred out by C 18，and the column temperature was 30 ℃.With the mobile phase was acetonitrile∶methanol∶0.025 mol/L ammonium dihydrogen phosphate=25∶30∶45.[Result]The injection concentration of 0.5-50.0 μg/mL had a good linear relationship with the peak area （R2=0.999 9）; the recovery rate was above 80%， and the coefficient of variation was within the allowable range （0-5%）.In the instrument reproducibility test，ten successive injections of reference，the peak area RSD was 1.55%.[Conclusion]The detection of tylosin and its preparations by high performance liquid chromatography is accurate and reliable， with good stability， reproducibility and high precision. It is suitable for veterinary drug companies to control the quality of tylosin and its preparations.

Key words Tylosin;High performance liquid chromatography;Detection method;Content determination

泰樂菌素（tylosin）是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素 [1]，以淡黃色或白色粉末存在，易溶于水 [2]。因其在腸道內(nèi)吸收好，在體內(nèi)擴(kuò)散得快，在臨床上多用于治療藥物，其作用機(jī)理是能與病原微生物的核糖體結(jié)合、阻礙肽鏈增長(zhǎng)，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，起到殺菌作用 [3]。泰樂菌素可分為酒石酸泰樂菌素和磷酸泰樂菌素等。

泰樂菌素是支原體的首選藥，它不僅對(duì)革蘭氏陽性菌而且對(duì)部分革蘭氏陰性菌都具有很強(qiáng)的殺滅作用 [4]，泰樂菌素的這種特性使其成為治療畜禽疾病的常用藥物 [5]。孫志良等 [6]報(bào)道，飼料中添加20 mg/kg的酒石酸泰樂菌素對(duì)肉雞有明顯的促生長(zhǎng)作用。陳冰 [7]用雞支原體強(qiáng)毒人工接種AA雛雞（14日齡），24 h后口服濃度為500 mg/L的酒石酸泰樂菌素溶液，發(fā)現(xiàn)雛雞成活率和增重率均達(dá)95%以上。隨著酒石酸泰樂菌素的廣泛使用，出現(xiàn)了許多問題，如濫用藥和不規(guī)范使用，造成了藥物殘留，美國明尼蘇達(dá)大學(xué)曾做過這樣的研究，發(fā)現(xiàn)許多豬肥料樣本中泰樂菌素含量高達(dá) 5.2 mg/L [8]，所以關(guān)于泰樂菌素的檢測(cè)也越來越迫切。

《中華人民共和國獸藥典》 [9]中泰樂菌素的檢測(cè)方法是采用抗生素微生物檢定法，但該方法操作繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)且對(duì)檢測(cè)人員經(jīng)驗(yàn)要求比較高，很難滿足獸藥生產(chǎn)企業(yè)實(shí)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)品快速檢測(cè)的需求。高效液相色譜法是一種高效能、高靈敏度、快速的現(xiàn)代分析手段 [10]。因此，為獸藥企業(yè)能有一種簡(jiǎn)便、快捷的方法對(duì)泰樂菌素及其制劑進(jìn)行質(zhì)量控制，積極摸索建立一種泰樂菌素高效液相色譜檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 試劑 乙腈、磷酸二氫銨、磷酸、高氯酸鈉均為分析純，甲醇為色譜純，均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;鹽酸購于上海振企化學(xué)試劑有限公司。

1.2 藥品 泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)品由中國獸藥監(jiān)察所提供;泰樂星（10%酒石酸泰樂菌素可溶性粉）由安徽華澳生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 主要儀器

高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司），Eclipse-C 18色譜柱，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，手動(dòng)進(jìn)樣器;DELTA 320 pH計(jì)測(cè)定儀;電子天平（METTLER TOLEDO），最高精確度為0.000 01 g;單級(jí)旋片式真空泵（溫嶺市挺威真空設(shè)備有限公司）;超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;高壓鍋、杯式過濾器、紫外分光光度計(jì)、恒溫箱、烘干箱（安徽華澳生物技術(shù)有限公司）。

1.4 主要試液的配制

1.4.1 0.025 mol/L磷酸二氫銨。準(zhǔn)確稱取0.718 88 g 磷酸二氫銨于250 mL容量瓶中，先用部分超純水溶解，然后定容至刻度，搖勻，用磷酸調(diào)節(jié)其pH為2.5，待用。

1.4.2 2 mol/L高氯酸鈉溶液。稱取 28.092 g高氯酸鈉于100 mL容量瓶中，先用部分超純水溶解，然后定容至刻度，搖勻，用1 mol/L濃度的鹽酸調(diào)節(jié)pH（2.5+0.1）后，待用。

1.4.3 15%甲醇溶液。用量筒量取15 mL甲醇，另加85 mL超純水混合，搖勻，待用。

1.4.4 泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精確稱取0.050 00 g泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)品置于100 mL容量瓶中，先加10 mL甲醇溶解，再加超純水定容至100 mL，使溶液中含泰樂菌素500 μg/mL。

1.4.5 泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)稀釋液。分別吸取一定量的泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置于50 mL容量瓶中，用超純水稀釋定容，配制成50.0、20.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5 μg/mL。

1.4.6 生理鹽水。準(zhǔn)確稱取9 g氯化鈉，加入100 mL純水 溶解。

1.5 方法的建立

1.5.1 波長(zhǎng)的確定。

用紫外分光光度計(jì)對(duì)50 μg/mL泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)稀釋液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，根據(jù)掃描光譜確定最大吸收波長(zhǎng)。

1.5.2 流動(dòng)相的確定。流動(dòng)相1（2 mol/L高氯酸鈉∶乙腈60∶40），流動(dòng)相2（乙腈、甲醇、磷酸二氫銨緩沖液60∶30∶10），流動(dòng)相3（乙腈、甲醇、磷酸二氫銨緩沖液50∶35∶15），流動(dòng)相4（乙腈、甲醇、磷酸二氫銨緩沖液25∶30∶45）。上述流動(dòng)相過有機(jī)濾膜并超聲處理后檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為“1.5.1”確定的波長(zhǎng)，流速為1? mL/min。

1.5.3 流速的確定。流速分別設(shè)為1.0、0.8和0.6? mL/min，取10 μg/mL泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)稀釋液上機(jī)檢測(cè)，液相條件為 “1.5.1”和“1.5.2”選定的波長(zhǎng)和流動(dòng)相，通過比較相應(yīng)的峰面積和出峰時(shí)間等因素，確定流速。

1.5.4 提取液的確定。準(zhǔn)確稱取0.020 0 g泰樂星于100 mL容量瓶中，分別用乙腈、40%乙腈、10%甲醇和甲醇溶解并定容，超聲溶解并過有機(jī)膜過濾，不同提取液配制的溶液重復(fù)檢測(cè)3次，記錄出峰時(shí)間與面積，與泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)稀釋液峰面積比較，用外標(biāo)法計(jì)算回收率。

1.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

1.6.1 線性范圍及建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。取0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL泰樂菌素系列標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，分別上高效液相色譜儀檢測(cè)，每種濃度重復(fù)檢測(cè)3次，記錄峰面積和濃度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.2 回收率和變異系數(shù)的測(cè)定。第1組準(zhǔn)確稱取 0.500 0 g無水葡萄糖，第2組準(zhǔn)確稱取0.450 0 g無水葡萄糖和 0.050 0 g 泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)品，混勻。各組分別稱取0.050 0、 0.020 0、 0.001 0 g，用“1.5.4”中優(yōu)選出的提取液定容至 100? mL，配成濃度為50、20、1 μg/mL工作液，用“1.5”中優(yōu)選出的條件建立方法，上機(jī)檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)5次，記錄峰面積，取平均值，計(jì)算回收率。連續(xù)做3個(gè)批次，將測(cè)得的批內(nèi)和批間的色譜峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校準(zhǔn)，計(jì)算變異 系數(shù)。

1.6.3 儀器的重復(fù)性。取濃度為5 μg/mL的泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，上機(jī)檢測(cè)，檢測(cè)條件為“1.5”中優(yōu)選出的條件，重復(fù)10次，計(jì)算變異系數(shù)。

1.6.4 定量限的考察。取“1.6.2”配制的濃度為1 μg/mL的工作液進(jìn)行稀釋，至濃度為0.5和0.2 μg/mL，將這2個(gè)濃度分別上機(jī)檢測(cè)，檢測(cè)條件為“1.5”中優(yōu)選出的條件，觀察液相色譜儀上是否有響應(yīng)，并檢測(cè)其回收率和變異系數(shù)。

1.7 泰樂星的含量測(cè)定 精確稱量泰樂星0.020 0 g，用 “1.5.4”中優(yōu)選出的提取液定容至100? mL，用“1.5”中優(yōu)選出的液相條件上機(jī)檢測(cè)，進(jìn)樣量20 μL，重復(fù)檢測(cè)3次，記錄峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 波長(zhǎng)的確定

用紫外分光光度計(jì)對(duì)50 μg/mL泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)稀釋液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，可見其在290 nm處有最大吸收峰。

2.2 流動(dòng)相的確定 泰樂菌素有A、B、C、D 4個(gè)組分，其中A峰面積最大，大約占泰樂菌素總面積的90%。從圖1可以

看出，采用流動(dòng)相1（2 mol/L高氯酸鈉∶乙腈60∶40）和流動(dòng)相4（乙腈、甲醇、磷酸二氫銨緩沖液25∶30∶45）檢測(cè)的泰樂菌素A組分峰形和分離效果比較好，采用流動(dòng)相1檢測(cè)，雖然能將泰樂菌素的4個(gè)組分分開，但因重復(fù)性不好，不能采用。采用流動(dòng)相4檢測(cè)出的圖譜雖然沒有采用流動(dòng)相1得到的組分B、C、D峰形效果好，但因泰樂菌素的主要組分為A，所以流動(dòng)相4能基本滿足泰樂菌素的液相檢測(cè)需求。

2.3 流速的確定 從表1可以看出，流速越大，保留時(shí)間越小，易受到雜質(zhì)影響，峰面積降低;在流速為0.6 mL/min時(shí)，達(dá)到很好的分離，且峰面積大。

2.4 提取液的確定 比較乙腈、甲醇、10%甲醇、40%乙腈4種提取液對(duì)泰樂星產(chǎn)品的提取效果發(fā)現(xiàn)，乙腈、甲醇提取分離都沒有達(dá)到要求，無法計(jì)算回收率，10%甲醇提取的回收率為96.0%，高于40%乙腈提取的回收率（90.3%），且峰形比較好看。因此確定泰樂星的提取液為10%甲醇。

2.5 方法驗(yàn)證

2.5.1 方法的線性關(guān)系。按照“1.6.1”方法操作，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（x）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），進(jìn)行線性回歸， 兩者呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，得出回歸方程為y=56.289x-4.666 7（R2=0.999 9），表明標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度在0.5～50.0 μg/mL與峰面積線性關(guān)系較好。

2.5.2 回收率和變異系數(shù)的測(cè)定。由表2可知，該方法的平均回收率均在90%以上，說明該方法準(zhǔn)確適用，適于生產(chǎn)中用來檢測(cè)。由表3中日間和日內(nèi)變異系數(shù)結(jié)果可知，在同一天，不同濃度進(jìn)行檢測(cè)，日內(nèi)變異系數(shù)均小于5%，1和 20 g/mL 的日間變異系數(shù)大于5%，說明配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液中有效成分可能會(huì)發(fā)生降解，所以在日常檢測(cè)中，標(biāo)準(zhǔn)溶液或是樣品溶液最好現(xiàn)配現(xiàn)用，這樣才能保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.5.3 儀器的重復(fù)性。由表4可知，儀器的重復(fù)性較好，但要保證結(jié)果的準(zhǔn)確、一致，最好是同一人在同一時(shí)間段檢測(cè)，排除其他干擾因素。

2.5.4 定量限的測(cè)定。由表5可知，樣品含量在0.2 μg/mL時(shí)測(cè)得變異系數(shù)超過了5%，說明數(shù)據(jù)波動(dòng)較大，濃度太小時(shí)回收率降低;在0.5 μg/mL時(shí)，平均回收率為85%，變異系數(shù)為3.6%，在能接受的范圍，最終確定該試驗(yàn)所選方法的定量限為0.5 μg/mL。

2.6 泰樂星含量的測(cè)定 由表6可知，泰樂星中泰樂菌素的含量為9.8%，與標(biāo)示量10%結(jié)果一致。

3 討論與結(jié)論

該方法的建立重點(diǎn)在流動(dòng)相的摸索，在進(jìn)行試驗(yàn)之前，查閱了大量的資料，國內(nèi)多是用高氯酸鈉乙腈溶液作為流動(dòng)相，它能很好地分離出4個(gè)組分，但是何綺霞等 [11]的試驗(yàn)結(jié)

果表明用高氯酸鈉乙腈溶液組成的流動(dòng)相出現(xiàn)4個(gè)峰，且每次4個(gè)峰的含量不一樣，難以進(jìn)行定量，故不宜采用。通過查閱資料和試驗(yàn)結(jié)果可知，泰樂菌素中A組分的面積占總面積的85%以上，其他3個(gè)占有很小，所以在實(shí)際生產(chǎn)測(cè)量中，可以通過測(cè)定A組分含量來計(jì)算產(chǎn)品中泰樂菌素的含量，因此，尋找一種能有效分離泰樂菌素中A組分的流動(dòng)相是該方法建立的關(guān)鍵步驟。國外報(bào)道多是用乙腈、甲醇和磷酸鹽緩沖液不同比例的配比作為流動(dòng)相 [12]，雖然這種流動(dòng)相分離不出4個(gè)峰，但能分離出一個(gè)最大峰進(jìn)而可排除其他峰的干擾，且流動(dòng)相很穩(wěn)定，出峰時(shí)間快。該試驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相4（乙腈、甲醇、磷酸二氫銨緩沖液25∶30∶45）能很好地將泰樂菌素中A組分分離，能滿足獸藥企業(yè)對(duì)泰樂菌素日常檢測(cè)的需求。

對(duì)泰樂星提取條件的優(yōu)化，綜合比較提取后的液相色譜圖譜、峰形、回收率和提取液的穩(wěn)定性，最終選擇了10%甲醇作為樣品前處理的提取液。

泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度在0.5～50.0 μg/mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系（R2=0.999 9）。在準(zhǔn)確度與適應(yīng)性試驗(yàn)中，對(duì)已知含量的泰樂星進(jìn)行測(cè)定時(shí)，測(cè)定出來的結(jié)果與真實(shí)含量相差不大，具有很好的檢測(cè)性。儀器重現(xiàn)性試驗(yàn)中，將泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)檢測(cè)10次，得出的峰面積RSD為 1.55%，對(duì)于同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)10次測(cè)出的含量相差較小，在誤差允許的范圍之內(nèi)，表明該方法精密度良好。與《中華人民共和國獸藥典》中關(guān)于對(duì)泰樂菌素含量的抗生素微生物檢定法相比，該研究建立的高效液相色譜法，檢測(cè)結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確可靠、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好、精密度高，適用于獸藥企業(yè)對(duì)泰樂菌素及其制劑質(zhì)量自控。

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