沙凱輝 劉同剛 張曉麗

【摘要】 目的：探討原花青素聯(lián)合左氧氟沙星對尿路致病性大腸桿菌（UPEC）侵襲小鼠膀胱的抑制作用。方法：將雌性C57BL/6小鼠60只隨機分為四組，分別為空白對照組、左氧氟沙星組、原花青素組、原花青素+左氧氟沙星組，每組15只。將UPEC J96稀釋菌液注入各組小鼠膀胱內(nèi)，感染2 h后在無菌條件下摘取膀胱，制備成組織勻漿，稀釋后涂布于LB瓊脂平板上，以37 ℃孵育過夜。采用平板菌落計數(shù)法檢測各組UPEC J96相對侵襲率。結(jié)果：左氧氟沙星組、原花青素組、原花青素+左氧氟沙星組UPEC J96相對侵襲率低于空白對照組，原花青素+左氧氟沙星組UPEC J96相對侵襲率低于左氧氟沙星組、原花青素組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;原花青素組與左氧氟沙星組UPEC J96相對侵襲率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)論：原花青素與左氧氟沙星聯(lián)合應用更有利于抑制UPEC對小鼠膀胱的侵襲。

【關鍵詞】 原花青素 左氧氟沙星 UPEC 侵襲 小鼠 膀胱 感染

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.24.073 文獻標識碼 B 文章編號 1674-6805（2020）24-0-02

[Abstract] Objective： To investigate the inhibitory effect of Proanthocyanidins and Levofloxacin on urinary tract pathogenic escherichia coli （UPEC） invading bladder of mice. Method： A total of 60 female C57BL/6 mice were randomly divided into four groups， including the blank control group， the Levofloxacin group， the Proanthocyanidins group， the Proanthocyanidins+Levofloxacin group， 15 mice in each group. UPEC J96 diluent was injected into the bladder of mice in each group， and the bladder was extracted under sterile conditions 2 h after infection to prepare tissue homogenate， which was diluted and coated on LB AGAR plate and incubated overnight at 37 ℃. The relative invasion rate of UPEC J96 was measured by plate colony counting method. Result： The relative invasion rate of UPEC J96 in the Levofloxacin group， the Proanthocyanidins group， the Proanthocyanidins+Levofloxacin group was significantly lower than that of the blank control group， and the relative invasion rate of UPEC J96 in the Proanthocyanidins+Levofloxacin group was significantly lower than that of the Levofloxacin group and the Proanthocyanidins group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. The relative invasion rate of UPEC J96 between the Proanthocyanidins group and the Levofloxacin group was compared， and the difference was not statistically significant （P>0.05）. Conclusion： The combination of Proanthocyanidins and Levofloxacin is more beneficial to the inhibition of UPEC invasion on the bladder of mice.

[Key words] Proanthocyanidins Levofloxacin UPEC Invade Mice Bladder Infection

First-authors address： School of Nursing， Binzhou Medical University， Binzhou 256600， China

尿路感染是一種十分常見的細菌感染性疾病，主要由尿路致病性大腸埃希菌（UPEC）和肺炎克雷伯桿菌等革蘭陰性菌引發(fā)，約占所有感染病例的90%[1-2]。目前，抗生素療法是治療尿路感染的最有效手段，其中最常用的抗生素有阿莫西林、環(huán)丙沙星、左氧沙星等[3-5]。然而，由于抗生素的不合理使用，導致耐多藥/泛耐藥尿路致病菌出現(xiàn)，使得對于尿路感染的防治成為醫(yī)學界有待解決的難題[6-7]。原花青素是一種復雜的黃酮類天然聚合物，存在于谷物、豆類種子中，尤其在一些水果和果汁中的含量特別豐富[8]。本研究中，筆者通過動物實驗以驗證原花青素與左氧氟沙星聯(lián)合應用可以有效抑制UPEC侵襲膀胱，從而防治尿路感染。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 動物 選取濱州醫(yī)學院動物實驗中心的雌性C57BL/6小鼠60只。納入標準：SPF級小鼠，飲食正常。排除標準：尿路畸形。隨機分為四組，分別為空白對照組、左氧氟沙星組、原花青素組、原花青素+左氧氟沙星組，每組15只。體重18～20 g，平均（18.83±0.75）g。

1.1.2 主要藥劑 原花青素（純度>95%）購自長沙中仁生物科技有限公司。

1.1.3 UPEC UPEC J96（血清型O4：K6，ATCC 700336）購自ATCC，保存于-70 ℃冰箱中。于冰箱內(nèi)取出細菌并置于室溫下緩慢溶解，取50 ?l菌液接種于5 ml的LB肉湯液體培養(yǎng)基中，置于搖床中，以37 ℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)過夜;采用接菌環(huán)將細菌接種于TSA固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜形成單菌落，置于4 ℃冰箱備用，約可使用1周。

1.2 方法

1.2.1 四組小鼠膀胱給藥 腹腔注射5%水合氯醛（0.1 ml/10 g）進行麻醉，仰臥位固定，擠出膀胱中的尿液，通過導尿管分別將蒸餾水、左氧氟沙星稀釋液、原花青素稀釋液及左氧氟沙星和原花青素混合稀釋液注入四組小鼠膀胱內(nèi)，作用2 h。隨后，擠出膀胱中的液體，將UPEC J96稀釋菌液以5×108 CFU/膀胱的數(shù)量注入小鼠膀胱內(nèi)，感染2 h后擠出菌液，將100 ?g慶大霉素注入小鼠膀胱內(nèi)，作用30 min以殺死胞外菌。

1.2.2 平板菌落計數(shù)檢測侵襲率 以無菌磷酸緩沖鹽溶液（PBS）灌洗小鼠膀胱，去除殘留慶大霉素。在無菌條件下摘取膀胱，制備成組織勻漿，以PBS進行10倍梯度稀釋。稀釋100倍后，取100 ?l稀釋液涂布于LB瓊脂平板上，以37 ℃孵育過夜，菌落計數(shù)并計算相對侵襲率。

1.2.3 實驗次數(shù) 實驗重復3次。

1.3 觀察指標

計算四組UPEC J96相對侵襲率。

1.4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

左氧氟沙星組、原花青素組、原花青素+左氧氟沙星組UPEC J96相對侵襲率均較空白對照組明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;原花青素組與左氧氟沙星組UPEC J96相對侵襲率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表1。

3 討論

尿路感染是病原微生物在尿路中生長繁殖并入侵泌尿道黏膜或組織而引起的炎性反應[9]。最新的流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，全世界每年約有1.5億人次因各種尿路感染問題就醫(yī)或住院[10]。尿路感染具有易復發(fā)的特點，多見于女性，嚴重影響患者生活質(zhì)量[5]。

原花青素是一類富含羥基的天然多酚化合物[11]。研究證明，原花青素具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤的生物學活性[12-14]。UPEC主要導致急性膀胱感染（膀胱炎）和腎感染（腎盂腎炎），并可造成嚴重慢性腎功能衰竭或菌/敗血癥。尿道黏膜是病原微生物定殖最為棘手的部位之一，黏附和侵襲是UPEC等尿路致病菌逃避宿主免疫反應和抗生素治療最重要的策略，可以促進病原體更有效地定殖于尿道并引發(fā)感染[15]。在最常見的膀胱感染中，最為關鍵的第一步即是UPEC等尿路致病菌利用其表達的Ⅰ型菌毛黏附素FimH與膀胱上皮細胞膜表面含有甘露糖殘基的蛋白受體uroplakin Ia及Integrinα3/β1等結(jié)合，進而激活多條細胞內(nèi)信號級聯(lián)，介導UPEC等病原菌侵襲膀胱上皮細胞[16]。左氧氟沙星屬于喹諾酮類抗菌藥，能夠有效抑制細胞內(nèi)的菌落和大腸桿菌生物膜的形成，從而達到預防和治療尿路感染的目的。本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)，采用原花青素預處理小鼠膀胱后，UPEC J96對膀胱的侵襲明顯減少，與左氧氟沙星的效果相比無差異，而原花青素與左氧氟沙星聯(lián)合應用效果更顯著，說明原花青素可以作為一種治療尿路感染的替代物或輔助物與左氧氟沙星聯(lián)合應用。可能機制是原花青素能夠抑制UPEC與膀胱上皮細胞表面受體的結(jié)合，進而影響細胞內(nèi)多條信號級聯(lián)反應，達到抑制UPEC侵襲小鼠膀胱的目的。

綜上所述，原花青素與左氧氟沙星可以有效抑制UPEC侵襲小鼠膀胱，為尿路感染的臨床防治奠定一定基礎。

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（收稿日期：2020-06-18） （本文編輯：李盈）